Construcción de una hoja de varias capas células madre mesenquimales con un sistema de cultivo dinámico 3D
Summary
Este artículo proporciona un método eficiente y factible para la construcción de hojas de varias capas de células madre con células madre favorable propiedad.
Abstract
Terapia con células madre muestra un prometedor futuro en regenerar las heridas órganos y tejidos, y la técnica de la hoja de la célula ha sido desarrollada para mejorar la retención baja celular y la supervivencia pobre dentro de la zona de destino. Sin embargo, durante el proceso de construcción en vitro , una solución para mantener la actividad biológica de células madre y aumento de la cantidad de células dentro de la hoja de la célula es urgente. Aquí, este protocolo presenta un método para la construcción de una hoja de varias capas de células con células madre favorable bioactividad y óptima operatividad. Pericardio porcino decellularized (DPP) es preparado por fosfolipasa un método de descelularización2 (PLA2) como el andamio de la hoja de la célula, y rata médula ósea las células madre mesenquimales (BMSCs) son aisladas y ampliadas como las células sembradas. La estructura de la hoja temporal varias capas celulares se construye mediante el uso de RAD16-I péptido hidrogel. Finalmente, la hoja de la célula se cultiva con un sistema de perfusión dinámica para estabilizar la estructura tridimensional (3D), y la hoja de la célula podría obtenerse después de un cultivo de 48-horas en vitro. Este protocolo proporciona un método eficiente y factible para la construcción de una hoja de varias capas de células, y la hoja de la célula podría desarrollarse como un producto de terapia de células madre favorable en el futuro.
Introduction
Terapia de células madre se ha divulgado como un tratamiento efectivo para muchas enfermedades; sin embargo, retención celular baja y pobre supervivencia dentro de la zona de destino siguen siendo cuestiones críticas después de la inyección de células madre tradicional. Para resolver este problema, científicos ingeniería tejido desarrollado la técnica de la hoja de la célula. Una hoja monolayered célula con la matriz extracelular intacta en primer lugar se preparó utilizando la temperatura de respuesta cultura plato1, y sus seguimiento estudios informaron mejorías significativas de la célula de vástago de retención y sobrevivencia en el infartado zona2,3. Entre los métodos, construcción de la hoja de varias capas de células se ha divulgado como una estrategia efectiva para mejorar la supervivencia de la célula y la célula hoja efecto terapéutico3,4. Desde entonces, los científicos han trabajado en el desarrollo de métodos de construcción de hoja de diferentes células con el fin de aumentar la cantidad de celulares, propiedad de la célula de vástago y propiedades mecánicas de las hojas de la célula. Hasta ahora, ciertos tipos de hoja de la célula han sido construidos y estudiados en el tratamiento del infarto de miocardio5, cartílago lesión6, y7de la herida de la piel.
La actividad biológica de células antes del trasplante demostró una influencia emergente sobre la regeneración del tejido lesionado, y estrategias de construcción de hoja de diferentes células tienen diferentes efectos sobre las células madre. Por un lado, hojas de células confluentes sólo consistieron de alta densidad de las células madre y matrices extracelulares naturales podían ser adquiridos por apilamiento de hojas monolayered celular8 o mediante el uso de técnicas ingeniería de tejido magnético9. Por otra parte, los investigadores desarrollaron diferentes andamios para proporcionar una resistencia mecánica adecuada y apoyo celular crecimiento10,11,12, que permitió una baja siembra densidad para asegurar la nutrición la célula de vástago de la fuente. Sin embargo, a pesar de estos enfoques, la fuente de baja nutrición eficiente dentro de la estructura de la hoja de varias capas de la célula sigue siendo una preocupación importante durante la construcción en vitro . Por lo tanto, se necesita urgentemente un sistema de construcción de hoja celular eficiente y factible.
Este protocolo describe los pasos para preparar una hoja de células multilayeredmesenchymal la célula de vástago (MSC). En este sistema de construcción, la resistencia mecánica de la hoja de la célula proviene de una DPP. Partiendo de este andamio, la estructura 3D de la célula puede rápidamente construir con RAD16-I hidrogel de péptido y un sistema de perfusión dinámica se utiliza para la hoja de varias capas de células, con el fin de estabilizar la estructura de la hoja de celular 3D y proporciona nutrición suficiente de la cultura fuente para las células. Usando este sistema, una hoja de varias capas de CMMo se preparó con éxito y exhibe un efecto terapéutico óptimo en el infarto de miocardio de rata modelo13.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente Protocolo informa un método eficiente para la construcción de una hoja de varias capas de MSC. Esta hoja celular exhibe óptima resistencia mecánica, alta siembra densidad celular y células madre favorable bioactividad. Utilizando BMSCs como ejemplo, la estructura 3D de la célula rápidamente se construye con RAD16-I péptido hidrogel. Después de ser cultivadas en el sistema de perfusión dinámica, la hoja de varias capas de CMMo se obtiene con éxito y las BMSCs mantienen una alta expresión de marcad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (número 31771064); la ciencia y tecnología de planificación proyecto de la provincia de Guangdong (grant números 2013B010404030, 2014A010105029 y 2016A020214012); la ciencia y la tecnología de planificación proyecto de Guangzhou (número 201607010063); y el grado de innovación y programa de formación empresarial (número 201610559028); la Fundación Nacional de ciencia para jóvenes científicos de China (la concesión número 31800819).
Materials
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
References
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