Summary
ここでは、蛍光活性化細胞ソーティングによってアポトーシス乳癌細胞を分離し、さらにフローサイトメトリーによるアポトーシス反転後乳癌幹細胞のような細胞非幹乳ガン細胞の転移を検出するためのプロトコルを提案する.
Abstract
癌の再発は、基になるメカニズムは不明ながら専門医により研究されている長い。最近では、私たちと他の人、というアポトーシス逆転現象がさまざまな刺激の下で様々 な細胞モデルに増加した腫瘍につながることを発見します。In vitro および in vivo; このプロセスのトラッキングに関する以前の研究が注目されています。ただし、真逆の細胞の分離はまだ達成されるべきアポトーシス逆転の影響に関する我々 の理解を制限します。ここでは、我々 を活用カスパーゼ 3/7 グリーン検出色素ラベル カスパーゼ活性化細胞にアポトーシス誘導後。肯定的な信号を細胞が蛍光活性化セル (FACS) を回復の並べ替えによって選別してさらに。共焦点顕微鏡形態学的検査は、FACS 前に、アポトーシスの状態を確認できます。腫瘍の増加がしばしば癌幹細胞 (CSC) の割合の上昇に起因する-セルのように。また、乳がんの多様性を与えられて、これらの CSC のような細胞の起源を識別する重要になるがん治療。したがって、我々 はアポトーシスを誘発、カスパーゼ活性化細胞を分離してアポトーシスの反転手順を実行する前に乳癌以外の幹細胞を準備します。フローサイトメトリー解析では、乳房 CSC のような細胞が乳房 CSC のような細胞がアポトーシス反転中に乳癌以外の幹細胞から通過を示す逆のグループに再表示されることを明らかにします。要約すると、このプロトコルには、フローサイトメトリーによるアポトーシス乳癌細胞の分離と逆セルに CSC 割合の変化の検出が含まれます。
Introduction
がん国世界中1の大きな負担の原因と死の主要な原因となっています。乳がんは、がん1のすべてのタイプの間で女性患者の両方の発生率と死亡率の面で高いランクします。がんの多様性により化学療法でがん細胞死2,3、4を達成するために薬の組み合わせを使用する通常は。ただし、9、急速に成長している細胞は、タンパク質合成7,8や微小管ダイナミクス以来、一般的な化学療法薬は、しばしば DNA5,6をターゲットとしながら最も影響を受けるがん幹細胞 (CSC) s など休止期の細胞は、通常影響の少ない10です。CSCs は、したがって、治療、薬剤耐性やがんにつながる後再発10,11のちにも生き残る可能性が高い。したがって、CSCs の除去がん治療の重要な話題となっている、CSCs の起源の研究は必要です。
アポトーシスの逆転現象に関するより多くの研究は、最近 10 年間・12,13,14,15,16,17,18で行われています。,19. この概念の出現する前に広く受け入れられて細胞が不可逆的カスパーゼ活性化後アポトーシスを受けること。カスパーゼはアポトーシス、複雑なアポトーシスの形成と下流の基板20の胸の谷間などの開始と実行の段階で重要な役割を果たすタンパク質酵素の家族です。カスパーゼ 3 やカスパーゼ 7 など死刑執行カスパーゼの活性は、"ノーリターンのポイント「アポトーシス21として考えられています。しかし、研究者は最近観察アポトーシス反転体外の両方に発生し、セルの中に体内の,は、カスパーゼ活性化12,13,14後もアポトーシスから回復できます。,15,16,17,18,19します。 さらに、積極的な機能など元アポトーシス誘導と高い侵襲性に高い抵抗が逆のがんで検出された細胞の15。したがって、それは CSC のような細胞の割合が逆の人口未処理細胞と比較して最終的にアポトーシス逆転18後より悪性の機能に貢献して高くなる提案されました。
以前は、多くの努力がなされたアポトーシス反転体外ともっと重要なは、生体内での追跡にこのプロセス16,17,19の普遍性を確認するのに大きく役立つ。ただし、全身逆セルの結果考察はアポトーシス逆転に本当に影響を受けた細胞の不十分な分離のために欠けています。純粋なアポトーシス細胞を取得し、さらなる研究のためにそれらを回復する必要があります。したがって、我々 は"ノーリターンのポイント「21 apoptosis ためのマーカーとして死刑執行カスパーゼ活性化伝統的に広く受け入れられたマーカーを使用し、蛍光活性化細胞のカスパーゼ活性化細胞染色を区別する (FACS) を並べ替えを利用カスパーゼ-3/7 グリーン検出染付。染料は、短いアミノ酸シーケンスが認識され、アクティブなカスパーゼ 3/7 は切断する DEVD 共有にリンクされます。開裂の細胞質から核 DNA に結合して強い蛍光を発する場所に若しは染料を解放に役立ちます。この手順は、いくつかの細胞が行われていないことアポトーシス一括セル人口を使用して回避できます。
CSCs または腫瘍幹細胞は単一を使って多くの固体腫瘍で確認されている、またはいくつかの表面マーカーとこれらの細胞の非常にいくつかの数字の組み合わせが、免疫不全マウス22,23、形態の腫瘍に十分です 24,25,26,27。CD44 と CD24 の組み合わせは胸 CSC 研究と CD44 の一般的使用されています+/CD24-細胞は胸 CSCs26,27,28,29として定義されています。,30最近、一連のアポトーシス反転と CSCs の提案の関係を確認し、逆の乳房のがん細胞は in vitro および in vivo での増加の腫瘍形成能を得たことを示す実験を行ったが、。CSC マーカー18細胞の高い割合です。私たちが胸 CSCs より生き残る、従って得る豊かアポトーシス反転後重要なは、我々 は非幹細胞と件名を分離するときする可能性を除かないが、もともと非幹アポトーシス反転、CSC に出てくるがん細胞集団、示唆非幹がん細胞はアポトーシス反転中 CSCs の割合の増加に貢献できます。
この記事は、アポトーシス反転後乳癌以外の幹細胞から胸 CSC 様細胞への移行を示すとフローサイトメトリーによるこの転移を検出するために目指しています。乳癌以外の幹細胞は、CD44 を分離することによって準備最初-/CD24+ FACS による癌細胞の乳房します。アポトーシスが誘発し、顕微鏡下での形態学的変化によって確認されました。その後、アポトーシスはカスパーゼ 3/7 グリーン検出色素によって積極的にラベルは FACS により分離、さらにアポトーシスの反転のアポトーシス誘導物質の不在で培養します。逆セル、フローサイトメトリーによる解析のための回復の 7 日後 CSC マーカーとに汚れます。CD44 細胞+/CD24 逆の人口に-マーカーが再表示されますアポトーシス反転中に非幹細胞から CSC 様細胞への移行が発生したことを示唆しています。
アポトーシスの反転は、複数のがんで観察されている正常細胞と同様に細胞培養12,13異なるアポトーシス誘導刺激で治療します。このプロセスは、ショウジョウバエにトレースされている体内の16,17,19のモデルします。本稿で説明するよう、技術を使用して異なった癌疾患モデルと CSCs の起源で癌再発のメカニズムに関する多くの情報を取得できます。
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Protocol
1. 乳房非幹細胞の作製
- 文化 MCF-7、フェノールレッド フリー 10% 熱不活化の牛胎児血清 (FBS) 100 mm ディッシュとロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 培の 10 mL の MDA MB 231 セル。文化 T47D フェノールレッド フリー 2 mm L グルタミン RPMI 1640 培の 10 mL で、10% 熱非動化 FBS、および 1 %v/v ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) 100 mm ディッシュ。5% CO295% 空気細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で培養細胞。
注:フェノール レッド蛍光ベースの検出に影響を与えますが、そのエストロゲンのような効果31による乳癌細胞の成長の潜在的な影響を及ぼしています。たとえば、フェノールレッドはプロゲステロン受容体と MCF 7 セル31の成長を刺激できます。それがまた31T47D 細胞の成長を刺激します。 - リン酸 2 mL ではセルを洗浄緩衝生理食塩水 (PBS) 2 回。MCF 7 と MDA MB 231 または 0.25% トリプシン-EDTA T47D 細胞に 2 mL に 0.05% トリプシン-EDTA の 2 mL を追加します。
注:トリプシン-EDTA の濃度に必要なさまざまな乳房のがん細胞の種類の中で細胞の分離が異なる不適切な濃度 CD44 と CD2432などいくつかの細胞の表面のマーカーの表現パターンに影響を与える可能性があります。 - 5% CO295% 空気雰囲気下で 37 ° C で 5 分間料理を文化します。トリプシン-EDTA によって過剰消化から細胞を防ぐために、顕微鏡下で細胞の剥離を頻繁にチェックします。
- 90% 以上のセルをデタッチ、皿に完成した RPMI 培地 5 mL を追加し、細胞層表面に数回それをピペットします。
- 15 mL の円錐管と 5 分間遠心する 300 × g 4 ° C のセルに転送します。
注:通常、約 6 x 10 の6セルは、密度が 70% に達すると、100 mm ディッシュから取得できます。 - 上澄みを廃棄し、1.5 mL 遠心チューブに FACS バッファー (0.5 %bsa と 0.1% アジ化ナトリウムを含む PBS) の 10 の6セル/100 μ L でペレットを再懸濁します。
- いくつかの管に、セルを分割します。Mcf-7 細胞の分割セル 4 管: 2 つのアイソタイプ コントロール、CD24 陽性対照との二重染色染色 CD24 の単一の 1 つ。
- 3 チューブ T47D 細胞の分割セル: 2 つのアイソタイプ コントロールとデュアルの汚損のための 1 つ。
- MDA MB 231 セルの分割セル 4 管: 2 つのアイソタイプ コントロール、CD44 陽性対照との二重染色染色 CD44 の単一の 1 つ。
- 遠心 300 x gと 4 ° C、5 分で再びチューブ、上澄みを廃棄し、Fc ブロック希釈 1:50 FACS バッファーに追加します。
- 300 × gで遠心分離前に暗闇の中で 20 分間氷の上のサンプルをインキュベートし、4 ° C、5 分は上澄みを廃棄します。
- 蛍光色素標識されたモノクローナル抗体人間 CD44 を追加 (PerCP Cy5.5) と CD24 (PE) デュアルで (FACS バッファー) で 1:40 と 1:10 の希釈液で染色グループ。ポジティブ コントロール、CD44 を追加 (PerCP Cy5.5) MDA MB 231 と同じ濃度で mcf-7 細胞をそれぞれ CD24 (PE) を追加。
注:CD44 と C24 の組み合わせは、乳房 CSC 研究26,27,28,29,30で一般的に使用されています。 - アイソタイプ コントロール グループの追加、PerCP Cy5.5 マウス IgG2b、κ、1:40 で CD44 抗体と PE マウス igg2a 産、κ、1:10 でのアイソタイプ コントロールとして希釈希釈 106セル/100 μ L で CD24 抗体アイソタイプ コントロールとして。
注:興味の抗体アイソタイプ コントロールは、マイナス コントロール33として推奨されます。 - 4 ° c で 30 分間遠心分離機 300 × g暗闇の中で (1.12、1.13 の手順) からサンプルをインキュベートし、4 ° C、5 分は上澄みを廃棄します。
- 500 μ L の PBS と 5 分間遠心する 300 × g 4 ° C で 2 回ペレットを洗浄します。
- 蛍光活性化セルソーターを実行する前に、0.5 mL の PBS と 40 μ m のナイロン メッシュをフィルターにペレットを再懸濁します。
- ゲーティングと補償のために PE 共役アンチ CD24 抗体で mcf-7 細胞を染色し、ポジティブ コントロールとして PerCP Cy5.5 共役抗 CD44 抗体と MDA MB 231 細胞を染色します。アイソタイプ コントロール (図 1) のネガティブ コントロールとして染色細胞を使用します。
- CD44 細胞を収集-/CD24+コレクション培地 (フェノールレッド フリー RPMI 1640 培 20% 熱不活化 FBS と 2 %v/v PS) 1 mL を含む丸底ポリスチレン 12 × 75 mm 管のマーカー。5 分のgと RT × 300 でチューブを遠心し、上澄みを廃棄します。
注:乳癌細胞に CSC のようなセルは、CD44 として定義されている+/CD24-細胞26,27,28,29,30と胸以外の幹細胞CD44 として定義された-/CD24+細胞18 (図 1)。 - さらに 5% CO2細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で文化の新鮮なコレクション媒体を含んでいる培養皿で非幹、並べ替えられた乳癌細胞をプレートします。
2. アポトーシス誘導と検出
- 1 mM スタウロスポリン12,34 DMSO を準備します。MCF 7 群、MCF 7 細胞 15 mL の円錐管に 10 mL の最終巻 (2.5 μ M スタウロスポリン) までの完成品の中に 1 mM スタウロスポリンの 25 μ L を追加します。コンテンツを均等にミックスするピペット。
- 細胞から培養液を削除、2 ml の PBS のセルを一度洗います。Mcf-7 細胞細胞密度に達すると 70% の confluency にアポトーシスを誘導するために 6 時間に 2.5 μ M スタウロスポリンと媒体の 10 mL を加えます。
- 1 mM パクリタ キセル35,36 DMSO を準備します。T47D 群、15 mL の円錐管に 10 mL (パクリタ キセル 5 μ M) の最終的なボリュームに T47D 細胞の完成品の中に 1 mM パクリタ キセルの 12.5 μ L を追加します。コンテンツを均等にミックスするピペット。
- 細胞から培養培地を外し、2 ml の PBS のセルを一度洗います。細胞密度に達すると 70% の confluency にアポトーシスを誘導するために 10 h の T47D 細胞に 5 μ M のパクリタ キセルで培地 10 mL を加えます。
注:新しい細胞ラインが最初に使用されるときに誘導時間とアポトーシスを誘導する誘導物質の濃度を最適化する必要があります。 - MCF 7 の溶媒投与群、15 mL の円錐管に 10 mL (すなわち、0.25 %v/v DMSO) の最終巻に mcf-7 細胞の完成品の中に 25 μ L の滅菌ジメチルスルホキシド (DMSO) を追加します。コンテンツを均等にミックスするピペット。
- 溶剤処理した mcf-7 細胞から培養液を削除、2 mL の PBS で 1 回洗浄します。STS の溶剤コントロールとして 6 時間 v/v 0.25 %dmso と媒体の 10 mL を加えます。
- T47D の溶媒投与群、滅菌 DMSO の 5 μ L を 15 mL の円錐管に 10 mL の最終巻 (すなわち、0.05 %v/v DMSO) に T47D 細胞の完成品の中に追加します。コンテンツを均等にミックスするピペット。
- 2 mL の PBS で 1 回洗浄、溶剤処理 T47D 細胞から培養液を削除します。パクリタ キセルの溶剤コントロールとして 10 h の v/v 0.05 %dmso と媒体の 10 mL を追加します。
- 扱われた細胞の形態変化を観察し、50 で細胞を染色する nM Mitotracker 赤 CMXRos と 250 ng/mL ヘキスト 33342、5% CO295% 空気雰囲気下で 37 ° C で別の 20 分間インキュベートし、。共焦点レーザー走査型顕微鏡 (図 2) x 60 の下で典型的なアポトーシス細胞の形態を観察します。
注:セルの縮小、ブレブ膜、ミトコンドリア断片化核凝縮などの典型的なアポトーシスの形態がそのまま細胞膜12,13,14,15 ,,1837。
3. アポトーシス細胞とアポトーシスの反転手順の分離
- アポトーシス誘導剤と溶剤-処理 MCF 7 または 5% CO295% 空気雰囲気下で 37 ° C で 30 分間暗闇の中で 10 の6/mL の濃度で 3 μ M のカスパーゼ 3/7 グリーン検出色素 T47D 細胞を染色します。
- 40 μ m のナイロン メッシュからのセルを並べ替えの並べ替えを実行する前にフィルターします。
- 目的をゲートの最初主要な人口 (R1) をゲートし、前方散乱、側方散乱 (図 3) とドットのグラフをプロットすることによって破片を除外します。
- ネガティブ コントロールとしてカスパーゼ 3/7 グリーン検出色素を追加せず負の領域 (R2) をゲートに未処理細胞を使用 (図 3 a)。
- 肯定的な地域 (R3) をゲートにセル スタウロスポリン12,18,34 24 h と扱われ、肯定的な制御として染料で染色を使用 (図 3 b)。
- (同じ 1.18 の手順でコレクション媒体として) (図 3C-3D) コレクションの中の 1 mL を含む丸底ポリスチレン 12 × 75 mm 管の誘導治療グループから陽性細胞 (R3) を収集します。5 分のgと RT × 300 でチューブを遠心し、上澄みを廃棄します。
- ステップ 3.6 (図 3E-3F) のようにコレクションの中の 1 ml 丸底ポリスチレン 12 × 75 mm 管の溶剤処理グループから否定的な細胞 (R2) を収集します。
注:(10,000 細胞) などのごく一部を収集し、アクティブなカスパーゼ マーカーのパターンをチェックする選別機で再実行できます。カスパーゼ負領域で並べ替えられた溶剤処理細胞の 90% を表示する以上またはカスパーゼ正領域で並べ替えられたインデューサ処理細胞の 90% を表示する以上、これらの集められたセルは比較的純粋な (図 3 C-3F) と考えられています。並べ替えの地域および/またはソーターをリセットする必要があります。 - 新鮮なコレクション中で並べ替えられた細胞を再懸濁し、アポトーシス逆転で 7 日間 5% CO295% 空気雰囲気下で 37 ° C で 12 も組織培養プレート文化でそれらを播きます。
4. カスパーゼ活性化細胞におけるアポトーシスの確認
- ミックス 10 mM HEPES、140 mM の NaCl と 2.5 mM CaCl2アネキシン結合バッファー (pH 7.4) を準備します。4 ° C でバッファーを保存し、光に公開するバッファーを避けてください。
- アネキシン結合バッファーの 45 μ L で PI 原液 1 mg/mL の 5 μ L に希釈して propidium ヨウ化 (PI) の 100 μ g/mL 作業ソリューションを準備します。4 ° C でソリューションを格納し、光に公開するソリューションを避けてください。
注:PI は、潜在的な変異原物質を注意して処理する必要があります。 - 手順 2.1 から 2.5 のようにインデューサ処理細胞を準備します。
- セルをデタッチするのには 3-5 x 細胞層に媒体をピペッティングによるインデューサ扱わ MCF 7 T47D 細胞を収集します。15 mL の円錐管にセルを転送します。
- 5 分破棄上清のgと RT x 300 の遠心分離機します。
- 1.5 mL 遠心チューブに 10 の6/mL の濃度で完成した培地で細胞を再懸濁します、37 ° C で 30 分間暗闇の中で 3 μ M カスパーゼ 3/7 グリーン検出色素で細胞を染色
- Gと RT x 300 5 分破棄培養上清の遠心分離機します。
- 1 ml の氷冷 PBS の 300 × gで遠心する細胞を洗浄し、4 ° C、5 分は、培養上清を捨てます。
- アネキシン V 共役の追加 5 μ L のアネキシン結合バッファーの 100 μ L に細胞を再懸濁します、1 μ L 100 μ g/mL の細胞懸濁液の各 100 μ L に取り組んで解決策を PI し室温で 15 分間細胞を孵化させなさい。
注:アネキシン V と PI は一般的流れ cytometry38,,3940におけるアポトーシスに一緒に使用されます。 - 優しくアネキシン結合バッファー、ミックスの 400 μ L を追加します。流れの cytometer で実行する前に氷のサンプルを保ちます。
5 フローサイトメトリーによる乳房 CSC のような細胞の測定
- 0.05% トリプシン - edta 誘導剤や溶剤処理ともに逆 MCF 7 を収穫します。T47D 細胞誘導または溶媒投与群でまたは、手順で 1.2 から 1.5 0.25% トリプシン-EDTA を収穫します。
- 人間 CD44 に対する蛍光色素標識されたモノクローナル抗体で細胞を染色 (PerCP Cy5.5) と CD24 (PE) ステップ 1.12 のように。一方、1.13 のステップのようにアイソタイプ コントロールを準備します。
- 流れの cytometer でセルを実行し、CD44 細胞の割合を検出+/CD24-マーカー。
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Representative Results
非幹細胞胸 CSC のような細胞、CD44 の最初の並べ替えに乳がんから転移を観察するために-/CD24+乳癌細胞が必要でした。MCF 7 セルラインの貢献してきました約 0.15% 元の人口 (図 1) この手順で CSC マーカーと細胞アポトーシス反転中に CSC 濃縮の可能性を除外します。それどころか、元の人口の CSC マーカーを持つセルがない場合など T47D 細胞 (図 1)、この並べ替えの手順は省略できます。確かに、ゲートは正と負最終的に決定 CSC の割合に影響を与えるそれぞれのマーカーの定義を影響を受けます。したがって、興味の抗体アイソタイプ コントロールを含む適切なコントロール、マーカーごとに 1 つのステンド グラス コントロール必要があります慎重に選択し、ゲート調整 (図 1) のために準備します。
乳癌以外の幹細胞とアポトーシス反転モデルをその後確立でした。アポトーシス誘導剤を追加した後、典型的な形態学的変化を観察できるし、細胞は薬物による禁断症状 (図 2) 後と同様の形態とアポトーシスから回復する必要があります。カスパーゼ-3/7 はカスパーゼ 3/7 グリーン検出色素アミノ酸シーケンス DEVD を認識し、カスパーゼ-3/7 のアクティブなフォームがこのサイト41を切断することができます。核内の DNA に結合した蛍光信号が増幅されるか染料、裂かれ、核への移行、もともと、細胞質でカスパーゼ 3/7 グリーン検出色素の蛍光性は弱い。この明らかな違いは、フローサイトメトリーによって区別できます。したがって、それらのカスパーゼ活性化細胞を標識し、の高い蛍光強度と比較するカスパーゼ活性化 (図 3 a 3 D) のないものに基づいて並べ替え可能性があります。アポトーシス誘導過程では、適切な溶剤コントロールを含める必要があります: カスパーゼ活性化せず溶剤処理細胞を採取した (図 3 e、3 f) FACS プロシージャまたは溶媒自体が可能性を除外するには存在する場合、移行のための原因。
それら FACS ソート カスパーゼ活性化細胞がアポトーシスでは実際を表示、するために共同アネキシン V と PI でこれらの細胞を染色しました。アポトーシス細胞の早期変化の 1 つは細胞膜の内側から38,13,4039,細胞の外面にホスファチジルセリンの転流ホスファチジルセリンのこの外部化は、アネキシン V で検出でした。この変更はアポトーシスに固有ではない、PI が細胞膜の整合性に基づく壊死とアポトーシスを区別するため使用できます。したがって、PI 染色することがなく結合する Annexin V の細胞はアポトーシス細胞とみなされます。カスパーゼ活性化細胞アポトーシス誘導剤治療群では負、アポトーシス細胞 (図 4) がたちを示唆アネキシン V 正と PI 見つかりました。
アポトーシス細胞のカスパーゼ活性化に基づく 2 番目の並べ替え後、これらアポトーシス細胞収集、その後の回復のため培養します。生きていた逆の細胞培養容器の底を添付し、増殖し続けることができた。7 日後 CD44 と CD24 の染色で行われた逆セル コントロールは、前と同時に準備されたし、。溶媒投与群 (図 1) と比較して、フローサイトメトリーによる解析はみられなかった、CD44 に表示されるイベント (セル)+/CD24-象限逆乳房幹非癌細胞集団 (図 1) で.我々 はすでに CD44 細胞を除外していたので+/CD24-アポトーシス誘導とだけ CD44 の前に-/CD24+乳癌以外の幹細胞が選ばれた、これら CD44+/CD24- CSC のような細胞ができます。乳癌以外の幹細胞からアポトーシス反転時に通過。
図 1: 代表的な乳房 CSC マーカー フローサイトメトリーで乳癌細胞に染色します。
MCF-7、MDA MB 231 と T47D 人間 CD44 に対する蛍光色素標識されたモノクローナル抗体で染色した (PerCP Cy5.5) と CD24 (PE)。細胞はあった最初前方散乱 (FSC) と側方散乱 (SSC) (P1) 破片を除外するゲート。CD24 および CD44 のアイソタイプ コントロールは、それぞれ CD24 および CD44 のネガティブ コントロールとして使用されました。CD24 染色 mcf-7 細胞は CD24 の肯定的な制御として使用された、CD44 と MDA MB 231 細胞は CD44 の肯定的な制御として使用されました。非幹 MCF 7 乳癌細胞 (P2)、ソートされます。これらの細胞と T47D 細胞アポトーシスの反転手順を行った。CSC のような (CD44+CD24-) 細胞がアポトーシス反転後登場します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: アポトーシス刺激誘導下乳癌細胞の形態学的変化。
乳癌細胞は典型的なアポトーシス細胞の収縮、膜ブレブ、ミトコンドリアの断片化 (モノクロの図の黄色の矢印)、核凝縮を含む形態学的変化を示した。(青) の核: ヘキスト 33342 で染色細胞の核が青で示されていた。(ピンク) におけるミトコンドリア: Mitotracker 赤 CMXRos 染色細胞のミトコンドリアは、ピンク色で示されていた。差し込み印刷: 数字はミトコンドリアと核の両方を示すデュアル色でマージされます。(グレー) におけるミトコンドリア: Mitotracker 赤 CMXRos 染色細胞のミトコンドリアがモノクロで表示されます。差動干渉の対照 (DIC): 全体のセルです。上部: mcf-7 細胞だったスタウロスポリン (STS) 6 h を投与し、24 時間下に逆に: T47D 細胞が 24 時間スケール バーの反転と 10 h のパクリタ キセルで治療された = 20 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: カスパーゼ活性化によるソーター 。(A) 無染色 MCF 7 細胞なしスタウロスポリン (STS) 治療がネガティブ コントロール (R2) として使用されました。(B) mcf-7 細胞処理スタウロスポリン (STS) R3 地域で 24 時間細胞のカスパーゼ活性化細胞として見なされていたため。(C) mcf-7 細胞は R3 地域で 6 h 細胞の FACS ソートためスタウロスポリン (STS) で治療します。6 h スタウロスポリン (STS) 治療後 (D) FACS ソート カスパーゼ活性化の MCF-7 セルは再実行しました。(E) DMSO 処理 MCF 7 セルです。(F) FACS 並べ替えセル 6 h の DMSO 処理後のカスパーゼ活性化なしだった再実行。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: アネキシン V と PI は cytometry 流れのカスパーゼ活性化細胞の染色します。MCF 7 と T47D 細胞はあった前方散乱 (FSC) と側方散乱 (SSC) 破片を除外する (P1) まずゲート。アポトーシス誘導とは、染色することがなく処理された細胞は、ネガティブ コントロールとして使用されました。アポトーシス誘導、細胞のカスパーゼ活性化細胞 [すなわち、カスパーゼ-3/7 緑陽性細胞] が選ばれた PI 染色 Annexin V の蛍光強度を表示する (P3)。カスパーゼ-3/7 グリーンのすべての肯定的なセルはアネキシン V 正と PI 否定的な彼らがアポトーシスを示唆している.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、乳癌非幹細胞のアポトーシス逆転の結果乳癌 CSC のような細胞への移行を検出するための直接かつ明確な方法について説明します。これらの逆の細胞の CSC プロパティの確認は私n vitro mammosphere 形成アッセイとin vivo異種移植による免疫不全マウス18,24,26 アシストでした。 ,27,42,43,44,45。ここでは、2 つの乳房癌細胞ラインが、他乳房のがん細胞でこのプロトコルをさらに適用できます。この現象は CD44 の数が少ないで乳房癌細胞ラインで明白なので+/CD24-セルがもともと存在する細胞 MDA-MB-231 CD44 の 90% 以上があるなど使用しないように勧め+セルです。
ゲートはフロー分析で重要な適切かつ十分なコントロールを事前に準備する必要があります。、並べ替えには、セルの実際のコレクションの前に純度を決定する必要があります。たとえば、最初の並べ替えの純度を知る (10,000 細胞) などの小さい部分収集でき CSC マーカーのパターンをチェックする選別機で再実行します。CD44 以上これらの 90% が並べ替えられている場合セルは、-/CD24+ 、CD44 に表示されず+/CD24-地域、集められたセルの比較的純粋な (図 1) と考えられています。セル表示、CD44 の場合+/CD24-地域、ソート領域および/またはソーターをリセットする必要があります。並べ替えする必要があります文化フード内部の並べ替えアイコンを使用してまたはコレクションと細胞培養培地に抗生物質を追加することによって可能な限り滅菌実施可能。
乳がん以外のがん細胞の種類を選択し、誘発アポトーシス反転モデルを確立する様々 なアポトーシス誘導刺激できます。中 2 h も早く、カスパーゼ活性化を検出可能性があります並べ替えの時間を慎重に選択する必要があります。人口の細胞が同期していないので 1 つの特定の時間の時点で、各細胞アポトーシスのさまざまな段階に達している可能性があります。一方、細胞は、カスパーゼ活性化後のアポトーシス死に行きなさい。したがって、すべての電池がカスパーゼ活性化に達するときにだけ、情報が削除されて場合、いくつかの細胞が既に段階に達している、インデューサ除去後も回復できませんし、DNA 断片化の。コレクション後死細胞の数が多いままのコストがカスパーゼ活性化細胞のより高いパーセントを達成するためにあまりにも長い時間のためのアポトーシスを誘導することはお勧めしません。ほか、インキュベーション時間とカスパーゼ活性化細胞をラベル色素の濃度は、新しい細胞ラインを初めて使用する場合に最適化する必要があります。
現在正常に誘導アポトーシス細胞におけるアポトーシス逆転のもう一つの懸念は、セル (通常 10% 未満) の回収率です。細胞は、アポトーシス プラス並べ替えプロシージャを経てください。したがって、遠心分離とコレクションの巻き上がり・手順の伝達の間に非常に穏やかな処理が必要です。また、細胞の数ではなくリカバリの数依存に版か皿のそれに続く文化に使用の選択しないでください。それ以外の場合、セルを逆にし再成長もまばら割り当てでした。非幹癌細胞がより高い速度で成長し、再構成されたセル人口46を独占するかもしれないことを考えると、検出時間はならないあまりにも遠く回復の最初の日から。
この方法最初に分離された胸以外の幹細胞、細胞の回復を得る前に、カスパーゼ活性化に基づく 2 つ目の並べ替えが行われるアポトーシス誘導のためそれらを適用します。逆の人口乳房 CSC のような細胞の再登場は、フローサイトメトリーによって検出されます。この体外アポトーシスの反転手順は、純粋なアポトーシス発現がん細胞分離、以来、これらの真逆の細胞の結果を理解する今実験の数を実施できます。乳癌細胞、CSC の既知のマーカーとは、血液の悪性腫瘍と同様に、その他の固形腫瘍の種類を学ぶことができる、様々 なアポトーシス刺激を使用することができます。したがって、このメソッドは延長、がん調査のボーダー範囲に適用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、革新的な技術基金の革新技術委員会によって支えられた: 状態キー研究所の Agrobiotechnology (香港中文大学)、Lo Kwee 成医学研究基金とリー Hysan 基礎からの資金調達サポート。情報は、香港中文大学の大学院学生の身分によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40 μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | - | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
References
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