Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Flow Cytometric påvisning av nydannede brystkreft stilk cellen som celler etter apoptose reversering

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å isolere apoptotisk brystkreft celler ved fluorescens-aktivert celle sortering og videre oppdage overgangen av brystkreft ikke-stammen celler til brystkreft stilk cellen som celler etter apoptose reversering av flowcytometri.

Abstract

Kreft tilbakefall har lenge vært studert av onkologer mens de underliggende mekanismene fortsatt uklare. Nylig fant vi og andre at et fenomen kalt apoptose reverseringen fører til økt tumorigenicity i forskjellige celle modeller under ulike stimuli. Tidligere studier har vært fokusert på sporing denne prosessen i vitro og in vivo; imidlertid ennå isolering av ekte tilbakeførte celler oppnås, som begrenser vår forståelse på konsekvensene av apoptose reversering. Her dra vi nytte av en Caspase-3/7 grønn oppdagelsen fargestoff til etiketten celler med aktivert caspases etter apoptotisk induksjon. Celler med positive signaler er ytterligere sortert fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) for utvinning. Morfologiske eksamen under AC confocal mikroskopi bidrar til å bekrefte apoptotisk status før FACS. En økning i tumorigenicity kan ofte tilskrives høyden i prosent for kreft stilk cellen (CSC)-som celler. Også vil gitt heterogenitet av brystkreft, identifisere opprinnelsen til disse CSC-lignende cellene være avgjørende for kreftbehandling. Derfor forberede vi brystkreft ikke-stammen celler før utløser apoptose, isolere caspase-aktivert celler og utføre apoptose reversering prosedyren. Flow cytometri analysen avdekker at brystet CSC-lignende celler vises i omvendt-gruppen angir bryst CSC-lignende celler er passerte fra brystkreft ikke-stammen celler under apoptose reversering. I sammendraget inkluderer denne protokollen isolering av apoptotisk brystkreft celler og påvisning av endringer i CSC prosent i motsatt celler av flowcytometri.

Introduction

Kreft er en ledende årsak til død, forårsaker byrde land over hele verden1. Brystkreft rangerer høyt både når det gjelder forekomsten og dødelighet i kvinnelige pasienter blant alle typer kreft1. På grunn av kreft heterogenitet brukes en kombinasjon av narkotika vanligvis i kjemoterapi for å oppnå kreft celle død2,3,4. Men siden felles cellegifter ofte målet DNA5,6, påvirket protein syntese7,8 og/eller microtubule dynamics9, raskt voksende celler er de mens Quiescent celler som kreft stilk cellen (CSC) s er vanligvis mindre rammet10. CSCs er derfor mer sannsynlig til å overleve etter behandling, noe som senere fører til resistens og kreft tilbakefall10,11. Derfor eliminering av CSCs har blitt et viktig tema for kreftbehandling og studie av opprinnelsen til CSCs er nødvendig.

Flere studier på fenomenet apoptose tilbakeføringen er utført i det siste tiåret12,13,14,15,16,17,18 , 19. før fremveksten av dette konseptet, det akseptert at celler vil irreversibelt gjennomgår apoptose etter caspase aktivisering. Caspases er en familie av protein enzymer som spiller nøkkelroller i oppstart og utførelse av apoptose, inkludert dannelsen av apoptotisk komplekse og cleavage nedstrøms underlag20. Aktivering av bøddelen caspases som caspase 3 eller caspase 7 har vært ansett som "point of no return" for apoptose21. Men observert forskere nylig at apoptose reversering oppstår både i vitro og i vivo, under hvilke celler kan gjenopprette fra apoptose selv etter caspase aktivisering12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. videre aggressiv funksjoner som høyere motstand mot den opprinnelige apoptotisk induser og høyere invasiveness oppdages i motsatt kreft celler15. Derfor ble det foreslått at andelen CSC-lignende celler ville være høyere i motsatt befolkningen sammenlignet med ubehandlet cellene, til slutt bidrar til mer ondartet funksjoner etter apoptose reversering18.

Tidligere, mange innsats har blitt gjort spore apoptose tilbakeføringen i vitro og enda viktigere, i vivo, som stor hjelper i å bekrefte denne prosessen16,17,19universalitet. Men mangler en systemisk studie om konsekvensene av motsatt celler på grunn av utilfredsstillende isolasjon som virkelig har gjennomgått apoptose reversering. Det er behov for å kjøpe ren apoptotisk celler og gjenopprette dem for videre studier. Derfor vi bruker tradisjonelt godt akseptert markør for bøddelen caspase aktivisering som merket "point of no return"21 apoptose og utnytte fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) å diskriminere caspase-aktivert celler farget med Caspase-3/7 grønn oppdagelsen fargestoff. Fargestoff er covalently knyttet til en kort aminosyresekvens, DEVD, som kan gjenkjennes og kløyvde av aktive caspases 3/7. Spalting hjelper løslate fargestoff, som vil translocate fra stoffer til kjernen der det binder seg til DNA og avgir sterk fluorescens. Denne prosedyren unngås en bulk celle befolkningen som ikke kan noen celler har gjennomgått apoptose.

CSCs eller svulst-starte celler er blitt identifisert i mange solide svulster ved hjelp av ett eller en kombinasjon av flere overflate marker(s) og svært få antall disse cellene er tilstrekkelig til skjemaet svulster i immunodeficient mus22,23, 24,25,26,27. En kombinasjon av CD44 og CD24 har blitt brukt i bryst CSC studier, og CD44+/CD24- celler har blitt definert som brystet CSCs26,27,28,29 , 30. nylig vi har utført en rekke eksperimenter for å bekrefte foreslåtte forholdet mellom apoptose reversering og CSCs og demonstrere at tilbakeførte brystkreft celler fått økt svulst-forming evne i vitro og in vivo med en forhøyet prosent av celler med CSC markører18. Selv om vi ikke kan utelukke at brystet CSCs overleve bedre og dermed få beriket etter apoptose reversering, viktigere, når vi isolere ikke-stammen celler og gjenstand dem til apoptose tilbakeføring, CSC vil dukke opp i den opprinnelig ikke-stammen kreft celle befolkningen, tyder på at ikke-stammen kreft celler kan bidra til økningen i andelen CSCs under apoptose reversering.

Denne artikkelen tar sikte å demonstrere overgangen fra brystkreft ikke-stammen celler til brystet CSC-lignende celler etter apoptose reversering og oppdage denne overgangen av flowcytometri. De brystkreft ikke-stammen cellene er opprinnelig utarbeidet av isolere CD44-/CD24+ bryst kreftceller av FACS. Apoptose er deretter indusert og bekreftet av morfologiske endringer under mikroskopet. Etterpå er apoptotisk celler positivt merket av Caspase 3/7 grønn oppdagelsen dye isolert av FACS og ytterligere kultivert i fravær av apoptotisk indusere for apoptose tilbakeføring. Tilbakeførte cellene er deretter farget med CSC markører etter 7 dager med gjenoppretting for flyt cytometric analyse. Celler med CD44+/CD24- indikatorer vises i motsatt befolkningen, foreslå at overgangen fra ikke-stammen kreftceller CSC-lignende celler har oppstått under apoptose reversering.

Apoptose tilbakeføring har blitt observert i flere kreft cellelinjer samt normale primære celler behandlet med forskjellige apoptotisk stimuli i vitro12,13. Denne prosessen har også blitt sporet i Drosophila modell i vivo16,17,19. Mye informasjon om den underliggende mekanismen av kreft tilbakefall i forskjellige kreft sykdom modeller og opprinnelsen til CSCs kan oppnås gjennom bruk av teknikken som beskrevet i dette manuskriptet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av bryst ikke-stammen kreftceller

  1. Kultur MCF-7 og MDA-MB-231 celler i 10 mL av fenol red-fri Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS) i en 100 mm rett. Kultur T47D i 10 mL av fenol red-fri RPMI 1640 medium med 2 mM L-glutamin, 10% inaktivert FBS og 1% v/v Penicillin-Streptomycin (PS) i en 100 mm rett. Kultur celler på 37 ° C i en 5% CO2/95% luft celle kultur inkubator.
    Merk: Fenol-rød påvirker fluorescens-basert oppdagelsen, men har også en potensiell innflytelse på veksten av brystkreft celler på grunn av sin østrogen effekter31. For eksempel kan fenol red stimulere progesteron reseptor og vekst av MCF-7 celler31. Det kan også stimulere veksten av T47D celler31.
  2. Vask celler med 2 mL fosfat bufret saltvann (PBS) to ganger. Legge til 2 mL 0,05% trypsin-EDTA MCF-7 og MDA-MB-231 eller 2 mL 0,25% trypsin-EDTA T47D celler.
    Merk: Konsentrasjonen av trypsin-EDTA nødvendig for separasjon av celler blant annet bryst kreft celletyper variere mens en upassende konsentrasjon kan påvirke uttrykksmønster av noen celle overflate markører som CD44 og CD2432.
  3. Kultur retter for 5 min på 37 ° C under en atmosfære av 5% CO2/95% luft. Ofte sjekke brøkdel av celler under mikroskop for å hindre celler mot over fordøyelsen av trypsin-EDTA.
  4. Når over 90% celler fjerne, legge til 5 mL av fullførte RPMI medium parabolen og Pipetter det over lag celleoverflaten flere ganger.
  5. Overføre cellene til en 15 mL konisk rør og sentrifuge på 300 x g og 4 ° C for 5 min.
    Merk: Vanligvis kan rundt 6 x 106 celler fås fra en 100 mm rett når confluency når 70%.
  6. Forkast nedbryting og resuspend pellets på 106 celler/100 μL FACS buffer (PBS med 0,5% BSA og 0,1% Natriumazid) i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  7. Dele cellene i flere rør. For MCF-7 celler, dele cellene i 4 rør: to for isotype kontroller, en for CD24 enkelt flekker som CD24 positive kontroll og en for to flekker.
  8. For T47D celler, dele cellene i 3 rør: to for isotype kontroller og en for to flekker.
  9. For MDA-MB-231 celler, dele cellene i 4 rør: to for isotype kontroller, en for CD44 enkelt flekker som CD44 positive kontroll og en for to flekker.
  10. Sentrifuger rør igjen på 300 x g og 4 ° C i 5 min. forkaste nedbryting, og deretter legge Fc blokk utvannet 1:50 FACS buffer.
  11. Inkuber prøvene på is 20 min i mørket før sentrifugering på 300 x g og 4 ° C i 5 min. kast nedbryting.
  12. Legge til fluorochrome-konjugerte monoklonale antistoffer mot menneskelig CD44 (PerCP-Cy5.5) og CD24 (PE) på 1:40 og 1:10 fortynninger (i FACS buffer) i to flekker grupper. For positive kontroller, legge CD44 (PerCP-Cy5.5) til MDA-MB-231 og legge til CD24 (PE) i MCF-7 celler på samme konsentrasjonen, henholdsvis.
    Merk: Kombinasjonen av CD44 og C24 er ofte brukt i bryst CSC studie26,27,28,29,30.
  13. For isotype kontroll grupper, legger PerCP-Cy5.5 mus IgG2b, κ på en 1:40 fortynning som isotype kontrollen for CD44 antistoffer og PE musen IgG2a, κ på en 1:10 fortynning som isotype kontrollen for CD24 antistoffer i 106 celler/100 μL.
    Merk: Isotype kontroller for antistoffer rundt anbefales som negative kontroller33.
  14. Inkuber prøvene (fra trinn 1.12 og 1.13) på 4 ° C i mørket 30 min. sentrifuge på 300 x g og 4 ° C i 5 min. kast nedbryting.
  15. Vask pellet to ganger med 500 μL PBS og sentrifuge på 300 x g og 4 ° C for 5 min.
  16. Resuspend pellet i 0,5 mL PBS og filtrere gjennom en 40 µm nylon maske før du kjører på fluorescens-aktivert celle sortering.
  17. For gating og kompensasjon, beis MCF-7 celler med PE-konjugerte anti-CD24 antistoffer og flekken MDA-MB-231 celler med anti-CD44 PerCP-Cy5.5-konjugerte antistoffer som positive kontroller. Bruk celler farget med isotype kontroller som negative kontroller (figur 1).
  18. Samle celler med CD44-/CD24+ markører i runde bunn polystyren 12 x 75 mm rør som inneholder 1 mL av samlingen medium (fenol red-fri RPMI 1640 medium med 20% inaktivert FBS og 2% v/v PS). Sentrifuge rørene på 300 x g og RT for 5 min og kast nedbryting.
    Merk: CSC-lignende celler i brystkreft celler er definert som CD44+/CD24- celler26,27,28,29,30og bryst ikke-stammen kreftceller defineres som CD44-/CD24+ celler18 (figur 1).
  19. Plate sorterte bryst ikke-stammen kreftceller i kultur parabol med fersk samling medium for videre kultur på 37 ° C i 5% CO2 celle kultur inkubator.

2. apoptotisk induksjon og oppdagelsen

  1. Forberede 1 mM staurosporine12,34 i DMSO. Legge til 25 μL 1 mM staurosporine til ferdigutfylte medium MCF-7 celler å lage opptil 10 mL av siste volum (2,5 μM staurosporine) i en 15 mL konisk tube gruppen behandlet MCF-7. Pipetter for å blande innhold jevnt.
  2. Fjerne kultur medium fra cellene, vask cellene med 2 mL PBS en gang. Deretter legge til de 10 mL av medium med 2,5 μM staurosporine MCF-7 celler for 6 h å indusere apoptose når cellen tetthet når 70% confluency.
  3. Forberede 1 mM paklitaxel35,36 i DMSO. For gruppen behandlet T47D legge 12.5 μL 1 mM paklitaxel til ferdigutfylte medium T47D celler gjøre et endelig antall 10 mL (5 μM paklitaxel) i en 15 mL konisk rør. Pipetter for å blande innhold jevnt.
  4. Fjerne kultur medium fra cellene, og vask cellene med 2 mL PBS en gang. Deretter legge til de 10 mL av middels med 5 μM paklitaxel T47D celler for 10 h å indusere apoptose når cellen tetthet når 70% confluency.
    Merk: Innledningstiden og konsentrasjonen av indusere som induserer apoptose skal optimaliseres når en ny cellen linje for første gang.
  5. Løsemiddel-behandlet MCF-7 gruppen, legge til 25 μL sterilt dimethyl sulfoxide (DMSO) til ferdigutfylte medium MCF-7 celler gjøre et endelig antall 10 mL (dvs. 0,25% v/v DMSO) i en 15 mL konisk rør. Pipetter for å blande innhold jevnt.
  6. Fjern kultur mediet løsemiddelet behandlet MCF-7 celler, vask med 2 mL PBS en gang. Deretter Legg den 10 mL av medium med 0,25% v/v DMSO 6 h som løsemiddel kontrollen for STS.
  7. For løsemiddel-behandlet T47D gruppen, legge 5 μL sterilt DMSO til ferdigutfylte medium T47D celler utgjør 10 mL siste volum (dvs. 0,05% v/v DMSO) i en 15 mL konisk rør. Pipetter for å blande innhold jevnt.
  8. Fjerne kultur medium fra løsemiddel behandlet T47D cellene, vask med 2 mL PBS en gang. Deretter legge til de 10 mL av medium med 0,05% v/v DMSO 10 h som løsemiddel kontrollen for paklitaxel.
  9. Å observere morfologiske endringene behandlet celler, stain celler med 50 nM Mitotracker røde CMXRos og 250 ng/mL Hoechst 33342, og Inkuber for en annen 20 min på 37 ° C under en atmosfære av 5% CO2/95% luft. Observere typisk apoptotisk celle morfologi under en 60 x AC confocal laserskanning mikroskopet (figur 2).
    Merk: Typisk apoptose morfologi inneholder cellen krymping, membran blebbing, mitokondrier fragmentering og kjernefysiske kondens, men med intakt mobilnettet membran12,13,14,15 ,18,37.

3. isolering av apoptotisk celler og apoptose reversering prosedyre

  1. Flekk både apoptotisk induser og løsemiddel-behandlet MCF-7 eller T47D celler med 3 μM Caspase-3/7 grønn oppdagelsen fargestoff på cellen konsentrasjonen av 106/mL i mørket 30 min på 37 ° C under en atmosfære av 5% CO2/95% luft.
  2. Filtrere cellene til en 40 µm nylon maske før du kjører på sorter for sortering.
  3. For gating formål, først gate store befolkningen (R1) og ekskludere rusk ved å plotte grafen i prikker frem scatter og siden xy (Figur 3).
  4. Bruke ubehandlet cellene uten å legge Caspase-3/7 grønn oppdagelsen fargestoff som en negativ kontroll gate negative regionen (R2) (figur 3A).
  5. Bruker cellene behandlet med staurosporine12,18,34 24 h og farget med fargestoff som en positiv til gate positiv regionen (R3) (figur 3B).
  6. Samle positiv celler (R3) fra induser-behandlet gruppene i runde bunn polystyren 12 x 75 mm rør som inneholder 1 mL av samlingen medium (samme som samling medium i trinn 1,18) (tall 3C-3D). Sentrifuge rørene på 300 x g og RT for 5 min og kast nedbryting.
  7. Samle negativ celler (R2) fra løsemiddel-behandlet grupper i runde bunn polystyren 12 × 75 mm rør med 1 mL av samlingen medium som i trinn 3.6 (tall 3E-3F).
    Merk: En liten del av celler (for eksempel 10 000 celler) kan samles inn og Kjør på sorterer du mønsteret av aktive caspases markør. Hvis over 90% av sortert løsemiddel-behandlet celler vises i regionen caspase-negativ eller over 90% av sortert induser-behandlet celler vises i regionen caspase-positive, er disse avhentet celler antatt å være ren (tall 3 C-3F). Ellers skal regionen sortering og/eller sorterer tilbakestilles.
  8. Resuspend sortert cellene i frisk samling medium og frø dem i 12-vel vev kultur plater og kultur på 37 ° C under en atmosfære av 5% CO2/95% luft i 7 dager for apoptose reversering.

4. bekreftelse av apoptose i Caspase-aktivert celler

  1. Bland 10 mM HEPES, 140 mM NaCl og 2,5 mM CaCl2 å forberede annexin-binding buffer (pH 7.4). Lagre bufferen på 4 ° C og unngå buffer til utsettes for lys.
  2. Klargjør en 100 µg/mL fungerende løsning av propidium iodide (PI) ved utvannende 5 µL av 1 mg/mL PI lagerløsning i 45 µL annexin-binding bufferen. Lagre løsningen på 4 ° C og unngå løsningen utsettes for lys.
    Merk: PI er en potensiell mutagen og bør behandles med forsiktighet.
  3. Forberede induser-behandlet cellene som trinn 2.1 til 2,5.
  4. Samle induser-behandlet MCF-7 eller T47D celler av pipettering medium over cellen laget 3-5 x for å koble cellene. Overføre cellene til en 15 mL konisk rør.
  5. Sentrifuge på 300 x g og RT for 5 min. Forkast nedbryting.
  6. Resuspend cellene med fullført medium på cellen konsentrasjonen av 106/mL i et 1,5 mL microcentrifuge rør og flekken celler med 3 μM Caspase 3/7 grønn oppdagelsen fargestoff i mørket 30 min på 37 ° C.
  7. Sentrifuge på 300 x g og RT for 5 min. forkaste supernatants.
  8. Vask cellene med 1 mL av iskalde PBS og sentrifuger på 300 x g og 4 ° C i 5 min. forkaste supernatants.
  9. Resuspend cellene i 100 μL annexin-binding buffer med Legg til 5 μL annexin V konjugert og 1 µL 100 µg/ml PI fungerende løsning for hver 100 μL celle suspensjon og ruge cellene i 15 min ved romtemperatur.
    Merk: Annexin V og PI brukes vanligvis sammen til å merke apoptotisk celler i flyt cytometri38,39,40.
  10. Legge til 400 µL av annexin-binding buffer, bland forsiktig. Holde prøvene på is før du kjører på en flyt cytometer.

5. måling av bryst CSC-lignende celler av flowcytometri

  1. Høste den tilbakeførte MCF-7 i begge induser eller løsemiddel-behandlet grupper med 0,05% trypsin-EDTA. Høste T47D celler i begge induser eller løsemiddel-behandlet grupper eller med 0,25% trypsin-EDTA i trinn 1.2 til 1,5.
  2. Stain cellene med fluorochrome-konjugerte monoklonale antistoffer mot menneskelig CD44 (PerCP-Cy5.5) og CD24 (PE) som i trinn 1.12. I mellomtiden Forbered isotype kontrollene som i trinn 1.13.
  3. Kjøre cellene på en flyt cytometer og oppdage prosentandelen av celler med CD44+/CD24- markører.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å observere overgangen fra bryst ikke-stammen kreftceller bryst CSC-lignende celler, en første sortering av CD44-/CD24+ brystkreft celler var nødvendig. For MCF-7 celle linjen, som har rundt 0,15% celler med CSC markører i den opprinnelige befolkningen (figur 1), dette trinnet hjulpet utelukke muligheten for CSC berikelse under apoptose reversering. Tvert imot, hvis det var noen celler med CSC indikatorer i den opprinnelige befolkningen, kan som for T47D celler (figur 1), denne sortering prosedyren utelates. Faktisk påvirket gating definisjonen av positive og negative av hver merketråd, som til slutt vil påvirke andelen CSC bestemmes. Derfor bør riktig kontroller inkludert isotype kontroller for antistoffer av interesse, enkelt farget kontroller for hver indikator være nøye utvalgt og tilberedt for gate justering (figur 1).

Med brystkreft ikke-stammen celler, kan apoptose reversering modellen deretter opprettes. Vanlige morfologiske endringer kan være observert etter apoptotisk indusere og cellene skal komme fra apoptose med lignende morfologi etter narkotika uttak (figur 2). Caspase-3/7 gjenkjenner aminosyresekvens DEVD i Caspase-3/7 grønn oppdagelsen fargestoff og den aktive former av caspase-3/7 kan deler dette nettstedet41. Opprinnelig er fluorescens Caspase-3/7 grønn oppdagelsen fargestoff i stoffer svak mens hvis fargestoff er kløyvde og translocated til kjernen, fluorescens signalet vil bli forsterket etter sin binding til DNA i kjernen. Denne åpenbare forskjellen kan skilles av flowcytometri. Derfor kan caspase-aktivert celler være merket og sortert ut basert på deres høyere fluorescens intensitet sammenligne dem uten caspase Aktivisering (tall 3A-3D). Under apoptotisk induksjon prosessen, en passende løsemiddel kontroll må være inkludert: løsemiddel-behandlet celler uten caspase aktivisering ble samlettall 3E og 3Futelukke muligheten for at FACS prosedyren eller løsemiddelet selv var årsaken for overgangen, eventuell.

For å vise at FACS-sortert caspase-aktivert celler var faktisk apoptotisk, farget vi co disse cellene med Annexin V og PI. En tidlig stadium endringene i apoptotisk celler er translokasjon av fosfatidylserin fra innsiden av plasma membranen i ytre overflaten av cellen13,38,39,40; Denne eksternalisering av fosfatidylserin ble oppdaget av Annexin V. Denne endringen er ikke unikt for apoptose, kan PI brukes for å skille apoptose fra nekrose basert på integriteten i cellemembranen. Dermed regnes celler med Annexin V bindende men uten PI flekker som apoptotisk celler. Caspase-aktivert celler i apoptotisk induser behandlingsgrupper fant Annexin V positiv og PI negativ, antyder at de var apoptotisk celler (Figur 4).

Etter den andre sortering basert på caspase aktivisering i apoptotisk celler, var disse apoptotisk cellene samles og senere kultivert for utvinning. Tilbakeførte cellene var i live kunne feste kultur beholder bunnen og sprer seg. Etter 7 dager, ble farging av CD44 og CD24 utført i motsatt cellene mens kontroller var forberedt på samme tid som før. Sammenlignet med løsemiddel-behandlet gruppene (figur 1), flyt cytometric analyse viste at det var hendelser (celler) vises i CD44+/CD24- kvadrant i motsatt bryst ikke-stammen kreft celle befolkningen (figur 1) . Siden vi hadde allerede utelukket celler med CD44+/CD24- før apoptose induksjon og bare CD44-/CD24+ brystkreft ikke-stammen celler ble valgt, disse CD44+/CD24- CSC-lignende celler kan bare være passerte fra brystkreft ikke-stammen celler under apoptose reversering.

Figure 1
Figur 1: Representant bryst CSC markør flekker på brystkreft celler i flowcytometri.
MCF-7, MDA-MB-231 og T47D var farget med fluorochrome-konjugerte monoklonale antistoffer mot menneskelig CD44 (PerCP-Cy5.5) og CD24 (PE). Cellene ble først gated frem xy (FSC) og siden xy (SSC) (P1) å utelukke rusk. Isotype kontrollene CD24 og CD44 ble brukt som negative kontroller for CD24 og CD44 henholdsvis. MCF-7 celler med CD24 ble brukt som positive kontroll for CD24 og MDA-MB-231 celler med CD44 ble brukt som positive kontroll for CD44. Ikke-stammen MCF-7 brystkreft celler (P2) ble sortert. Disse sorterte celler og T47D celler ble utsatt for apoptose reversering prosedyren. CSC-lignende (CD44+CD24-) celler dukket opp etter apoptose reversering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Morfologiske endringer av brystkreft celler under apoptotisk stimulans induksjon.
Brystkreft celler viste typisk apoptotisk morfologiske endringer inkludert celle krymping, membran blebbing, mitokondrier fragmentering (gule piler i monokrom tallene) og kjernefysiske kondens. Kjerner (i blått): kjerner av celler med Hoechst 33342 ble vist i blått. Mitokondrier (i rosa): mitokondrier celler med Mitotracker røde CMXRos ble vist i rosa fargen. Flettede: Tall flettes i to farger viser både mitokondrier og kjerner. Mitokondrier (i grått): mitokondrier celler med Mitotracker røde CMXRos ble vist i svart-hvitt. Differensial forstyrrelser kontrast (DIC): hele celler. Overdel: MCF-7 celler var behandlet med staurosporine (m) for 6 h så tilbake for 24 h. lavere: T47D celler ble behandlet med paklitaxel 10 h med tilbakeføring for 24 h. skala barer = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Caspase aktivisering analyse av sorterer. (A) unstained kvinne MCF-7 celler uten staurosporine (m) behandling ble brukt som negativ kontroll (R2). (B) MCF-7 cellene behandlet med staurosporine (m) for 24 h. celler i R3 området ble betraktet som de caspase-aktivert cellene. (C) MCF-7 cellene behandlet med staurosporine (m) for 6 h. celler i R3 området var FACS-sortert. (D) FACS-sortert caspase-aktivert MCF-7 celler etter staurosporine (m) behandling for 6t var å kjøre. (E) DMSO-behandlet MCF-7 celler. (F) FACS-sortert celler uten caspase aktivisering etter DMSO behandling for 6t var å kjøre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Annexin V og PI farging av caspase-aktivert celler i flowcytometri. MCF-7 og T47D celler ble først gated frem xy (FSC) og siden xy (SSC) (P1) å utelukke rusk. Celler som ubehandlet med apoptotisk indusere og uten noen flekker ble brukt som negative kontroller. For cellene behandlet med apoptotisk indusere, caspase-aktivert celler [dvs. Caspase-3/7 grønn positiv celler] ble valgt (P3) vise fluorescens intensiteten av Annexin V og PI flekker. Alle Caspase-3/7 grønn positiv celler var Annexin V positive og PI negativ, antyder at de var apoptotisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en direkte og tydelig måte for å oppdage overgangen av brystkreft ikke-stammen celler i bryst CSC-lignende celler som følge av apoptose reversering. Bekreftelse av CSC egenskapene til disse tilbakeførte cellene kan utvides ved hjelp av jegn vitro mammosphere formasjon analysen og i vivo xenograft transplantasjon i immunodeficient mus18,24,26 ,,27,,42,,43,,44,,45. Her bruker vi to bryst kreftcelle linjer, men denne protokollen videre kan brukes i andre bryst kreftcelle linjer. Siden dette fenomenet er tydelig i bryst kreft cellen linje som færre antall CD44+/CD24- -celler finnes opprinnelig, det anbefales ikke for å velge linjer som MDA-MB-231 der det er mer enn 90% av CD44+ celler.

Siden gating er viktig i flyt analyse, bør riktig og tilstrekkelig være forberedt på forhånd. Sortering, bør renheten også fastslås før selve samling av celler. For eksempel for å vite renheten av første sortering, kan en liten del av celler (for eksempel 10 000 celler) samles inn og Kjør på sorterer du mønsteret av CSC markører. Dersom over 90% av disse cellene er CD44-/CD24+ og vises ikke i CD44+/CD24- -regionen, det avhentet celler antas å være ren (figur 1). Hvis celler vises i CD44+/CD24- -regionen, sortering regionen og/eller sorterer den burde være restarte. Sortering bør utføres som sterilt som mulig enten ved hjelp av sortering inne kultur hette eller legge antibiotika i innsamling og kultur medium for sorterte celler.

Kreft celletyper enn brystkreft kan også være valgt og indusert med ulike apoptotisk stimuli å etablere apoptose reversering modellen. Mens caspase aktivisering kan oppdages så tidlig som 2t, bør sortering tiden velges med omhu. Siden celler i befolkningen ikke er synkronisert, på et bestemt tidspunkt, kan hver celle kan ha nådd ulike stadier av apoptose. I mellomtiden holde celler skjer til en apoptotisk død etter caspase aktivisering. Derfor hvis indusere fjernes bare når alle celler når caspase aktivisering, kan noen celler ha allerede nådd stadiet av DNA fragmentering, noe som gjør dem ikke gjenopprette selv etter induser fjerning. Det anbefales ikke for å indusere apoptose for også lang tid å oppnå en høyere prosentandel av caspase-aktivert celler, men med kostnadene ved å forlate et stort antall celler dør etter samling. Dessuten skal inkubasjon tiden og fargestoff konsentrasjonen som merker caspase-aktivert celler være optimalisert når en ny cellen linje for første gang.

En annen bekymring som vellykket inducing apoptose reversering i apoptotisk cellene er lav utvinningsgrad på cellene (vanligvis mindre enn 10%). Cellene har gått gjennom apoptose pluss sortering prosedyren; Derfor krever de svært skånsom behandling under sentrifugering og overføre ved innsamling og rørets trinnene. Også være valg av plate eller rett brukes for påfølgende kultur ikke avhengig av antall celler samlet men på forventet antall inngang. Ellers kan celler tildeles for tynt for å reversere og re-vokse. Gitt at ikke-stammen kreft celler vokse på en høyere hastighet og kan dominere i nytt utgjorde celle befolkningen46, bør gjenkjenning tiden ikke være for langt fra første utvinning dag.

Denne metoden første isolerer bryst ikke-stammen kreftcelle så gjelder dem apoptotisk induksjon der en andre sortering er gjort basert på caspase aktivisering før celler bli gjenopprettet. Re-utseendet på brystet CSC-lignende celler i motsatt befolkningen er oppdaget av flowcytometri. Siden denne i vitro apoptose reversering-prosedyren isolerer ren apoptotisk kreftceller, kan en rekke eksperimenter nå utføres for å forstå konsekvensene av disse virkelige tilbakeførte cellene. Bortsett fra brystkreft celler, andre solid tumor samt hematologic kreft som med kjente CSC markører kan studeres og ulike apoptotisk stimulans kan brukes. Derfor er denne metoden utvides og gjelder for en boarder omfanget av kreft etterforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av nyskapende teknologi fond av innovasjon teknologi Kommisjonen: finansiering støtte fra den staten nøkkel laboratorium av Agrobiotechnology (CUHK), den Lo Kwee-Seong Biomedical Research Fund og Lee Hysan Foundation. Y.X. ble støttet av den praktisk studentship fra CUHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40 μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus -
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

Tags

Kreftforskning problemet 143 stilk celler brystkreft apoptose apoptose reversering flowcytometri aktiveres av fluorescens celle sortering
Flow Cytometric påvisning av nydannede brystkreft stilk cellen som celler etter apoptose reversering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. … More

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal. J. Vis. Exp. (143), e58642, doi:10.3791/58642 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter