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Cancer Research

नव गठित स्तन कैंसर के प्रवाह Cytometric का पता लगाने के Apoptosis उत्क्रमण के बाद कोशिका की तरह स्टेम सेल

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Summary

यहां, हम प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई द्वारा अपोप्तोटिक स्तन कैंसर की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और आगे प्रवाह cytometry द्वारा apoptosis उत्क्रमण के बाद स्तन कैंसर स्टेम कोशिका कोशिकाओं की तरह स्टेम कैंसर कोशिकाओं के संक्रमण का पता लगाने ।

Abstract

कैंसर पुनरावृत्ति लंबे समय अर्बुदविज्ञानी द्वारा अध्ययन किया गया है अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट रहते हैं । हाल ही में, हम और दूसरों को पता चला कि एक घटना apoptosis उलटा नाम विभिंन उत्तेजनाओं के तहत विभिंन सेल मॉडलों में वृद्धि हुई tumorigenicity की ओर जाता है । पिछले अध्ययनों में इस प्रक्रिया पर नज़र रखने पर ध्यान केंद्रित किया गया है इन विट्रो और vivo में; हालांकि, असली उलट कोशिकाओं के अलगाव अभी तक प्राप्त किया है, जो apoptosis उत्क्रमण के परिणामों पर हमारी समझ सीमा है । यहां, हम अपोप्तोटिक प्रेरण के बाद सक्रिय caspases के साथ कोशिकाओं लेबल करने के लिए एक Caspase-3/ सकारात्मक संकेतों वाले कक्ष आगे प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) द्वारा पुनर्प्राप्ति के लिए हल किए जाते हैं । फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत रूपात्मक परीक्षा FACS से पहले अपोप्तोटिक स्थिति की पुष्टि में मदद करता है । tumorigenicity में वृद्धि अक्सर कैंसर स्टेम सेल के प्रतिशत में उंनयन के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है (CSC)-कोशिकाओं की तरह । साथ ही, ब्रेस्ट कैंसर के विविधता को देखते हुए इन सीएससी की उत्पत्ति की पहचान-जैसे कोशिकाएं कैंसर के इलाज के लिए अहम होंगी । इस प्रकार, हम apoptosis ट्रिगर से पहले स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं तैयार, caspase-सक्रिय कोशिकाओं को अलग और apoptosis उलटा प्रक्रिया प्रदर्शन. प्रवाह cytometry विश्लेषण से पता चलता है कि स्तन सीएससी की तरह कोशिकाओं को फिर से उलट समूह में दिखाई देते हैं, का संकेत स्तन सीएससी की तरह कोशिकाओं apoptosis उत्क्रमण के दौरान स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं से पारगमन कर रहे हैं । संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल अपोप्तोटिक स्तन कैंसर की कोशिकाओं के अलगाव और प्रवाह cytometry द्वारा उलट कोशिकाओं में CSC प्रतिशत में परिवर्तन का पता लगाने के शामिल हैं ।

Introduction

कैंसर की मौत का एक प्रमुख कारण रहा है, भारी बोझ के कारण दुनिया भर में देशों1। स्तन कैंसर1कैंसर के सभी प्रकार के बीच महिला रोगियों में घटना और मृत्यु के मामले में दोनों उच्च रैंकों । कैंसर विविधता के कारण, दवाओं का एक संयोजन आमतौर पर कीमोथेरेपी में प्रयोग किया जाता है कैंसर कोशिका मृत्यु2,3,4प्राप्त करने के लिए । हालांकि, के बाद से आम कीमोथेरेपी दवाओं अक्सर लक्ष्य डीएनए5,6, प्रोटीन संश्लेषण7,8 और/या microtubule गतिशीलता9, तेजी से बढ़ती कोशिकाओं को सबसे अधिक प्रभावित कर रहे हैं, जबकि quiescent कोशिकाओं जैसे कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) एस आमतौर पर कम10प्रभावित कर रहे हैं । सीएससीएस कर रहे हैं, इसलिए, अधिक उपचार के बाद जीवित रहने की संभावना है, जो बाद में दवा प्रतिरोध और कैंसर पतन10,11की ओर जाता है । इसलिए, सीएससीएस के उंमूलन कैंसर के इलाज के लिए एक महत्वपूर्ण विषय बन गया है और सीएससीएस के मूल के अध्ययन के लिए आवश्यक है ।

apoptosis उत्क्रमण की घटना पर अधिक अध्ययन हाल के दशक में प्रदर्शन किया गया है12,13,14,15,16,17,18 , 19. इस अवधारणा के उद्भव से पहले, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि कोशिकाओं को caspase सक्रियण के बाद apoptosis से गुजरना होगा अचल । Caspases प्रोटीन एंजाइमों के एक परिवार है कि दीक्षा और apoptosis के निष्पादन चरणों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं, अपोप्तोटिक परिसर के गठन और बहाव सब्सट्रेट20के दरार सहित । caspase 3 या caspase 7 के रूप में जल्लाद caspases के सक्रियकरण21apoptosis के लिए नहीं वापसी की "बिंदु" के रूप में माना गया है । हालांकि, शोधकर्ताओं ने हाल ही में कहा कि apoptosis उलटा दोनों विट्रो में और vivo में होता है, जो के दौरान कोशिकाओं apoptosis से उबरने के बाद भी caspase सक्रियण12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. इसके अलावा, इस तरह के मूल अपोप्तोटिक उत्प्रेरण और उच्च इनवेसिव के लिए उच्च प्रतिरोध के रूप में आक्रामक सुविधाओं उलट कैंसर कोशिकाओं में पता लगाया है15। इसलिए, यह प्रस्तावित किया गया था कि सीएससी की तरह कोशिकाओं का प्रतिशत उलट आबादी में उच्च होगा जब अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में, अंततः apoptosis उलटा18के बाद और अधिक घातक सुविधाओं के लिए योगदान ।

पहले, कई प्रयासों में apoptosis उलटा ट्रैक करने के लिए किया गया है और अधिक महत्वपूर्ण बात, vivo में, जो बहुत इस प्रक्रिया की सार्वभौमिकता की पुष्टि करने में मदद16,17,19. हालांकि, उलट कोशिकाओं के परिणामों पर एक प्रणालीगत अध्ययन कोशिकाओं है कि वास्तव में apoptosis उत्क्रमणीय है की असंतोषजनक अलगाव के कारण कमी है । शुद्ध अपोप्तोटिक कोशिकाओं के अधिग्रहण और आगे के अध्ययन के लिए उन्हें ठीक करने की जरूरत है । इस प्रकार, हम जल्लाद caspase सक्रियकरण की पारंपरिक रूप से अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है मार्कर का उपयोग करें "कोई वापसी के बिंदु के मार्कर के रूप में"21 apoptosis के लिए और उपयोग प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) भेदभाव caspase-सक्रिय कोशिकाओं को दाग Caspase-3/7 ग्रीन डिटेक्शन डाई के साथ । डाई covalently एक छोटे एमिनो एसिड अनुक्रम, DEVD, जो पहचाना जा सकता है और सक्रिय caspases 3/7 से सट से जुड़ा हुआ है । दरार डाई रिलीज में मदद करता है, जो नाभिक को cytosol से translocate जहां यह डीएनए के लिए बांध और मजबूत प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करेगा । यह कार्यविधि बल्क सेल जनसंख्या का उपयोग करने से बचती है जिसमें कुछ कक्ष हो सकते है apoptosis नहीं आए हैं ।

सीएससीएस या ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं कई ठोस ट्यूमर में पहचान की गई है एक एकल या कई सतह मार्कर (ओं) का एक संयोजन का उपयोग कर और इन कोशिकाओं की बहुत कुछ संख्या immunodeficient चूहों में ट्यूमर फार्म करने के लिए पर्याप्त हैं22,23, 24,25,26,27. CD44 और CD24 का एक संयोजन आमतौर पर स्तन सीएससी अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, और CD44+/CD24- कोशिकाओं स्तन सीएससीएस के रूप में परिभाषित किया गया है26,27,28,29 , 30. हाल ही में, हम apoptosis उत्क्रमण और सीएससीएस के बीच प्रस्तावित संबंधों की पुष्टि करने के लिए प्रयोगों की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया है और यह दर्शाता है कि स्तन कैंसर कोशिकाओं में वृद्धि ट्यूमर बनाने की क्षमता इन विट्रो में और एक साथ vivo में प्राप्त सीएससी मार्करों के साथ कोशिकाओं का ऊंचा प्रतिशत18. हालांकि हम संभावना है कि स्तन सीएससीएस बेहतर जीवित है और इस तरह apoptosis उत्क्रमण के बाद समृद्ध हो बाहर नहीं कर सकता है, महत्वपूर्ण बात, जब हम अलग गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं और उंहें apoptosis उत्क्रमण के अधीन, CSC मूल रूप से गैर स्टेम में उभर जाएगा कैंसर कोशिका जनसंख्या, सुझाव है कि गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं apoptosis उत्क्रमण के दौरान सीएससीएस के प्रतिशत में वृद्धि करने के लिए योगदान कर सकते हैं ।

इस लेख के लिए स्तन गैर से संक्रमण का प्रदर्शन करना है स्टेम कैंसर कोशिकाओं apoptosis उत्क्रमण के बाद स्तन CSC-कोशिकाओं की तरह है और प्रवाह cytometry द्वारा इस संक्रमण का पता लगाने के लिए । स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं शुरू में FACS द्वारा CD44-/CD24+ स्तन कैंसर की कोशिकाओं को अलग करके तैयार कर रहे हैं । फिर, apoptosis प्रेरित और माइक्रोस्कोप के तहत रूपात्मक परिवर्तन की पुष्टि की है । बाद में, अपोप्तोटिक कोशिकाओं सकारात्मक-Caspase द्वारा लेबल 3/7 ग्रीन डिटेक्शन डाई FACS द्वारा अलग कर रहे हैं और आगे apoptosis उत्क्रमण के लिए अपोप्तोटिक उत्प्रेरण के अभाव में प्रसंस्कृत. रिवर्स कोशिकाओं तो प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए वसूली के 7 दिनों के बाद सीएससी मार्करों के साथ दाग रहे हैं । CD44 के साथ कोशिकाओं+/CD24- मार्करों रिवर्स जनसंख्या में फिर से दिखाई देते हैं, का सुझाव है कि गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं से सीएससी की तरह कोशिकाओं में संक्रमण apoptosis उत्क्रमण के दौरान हुई है ।

Apoptosis उत्क्रमण में देखा गया है एकाधिक कैंसर सेल लाइनों के साथ ही सामांय प्राथमिक इन विट्रो में विभिंन अपोप्तोटिक उत्तेजनाओं के साथ इलाज कोशिकाओं12,13। वीवो16,17,19में Drosophila मॉडल में भी यह प्रक्रिया ट्रेस की गई है । बहुत अलग कैंसर रोग मॉडल और सीएससीएस की उत्पत्ति में कैंसर पतन के अंतर्निहित तंत्र के बारे में जानकारी तकनीक के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है के रूप में इस पांडुलिपि में वर्णित है ।

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Protocol

1. स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं की तैयारी

  1. संस्कृति MCF-7 और एमडीए-एमबी-२३१ phenol लाल मुक्त रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं १६४० मध्यम एक १०० mm डिश में 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक । संस्कृति T47D के 10 मिलीलीटर में phenol लाल मुक्त RPMI १६४० मध्यम 2 मिमी एल के साथ पूरक-glutamine, 10% गर्मी निष्क्रिय FBS, और 1% v/v पेनिसिलिन-Streptomycin (PS) एक १०० mm डिश में । एक 5% CO2में ३७ ° c में संस्कृति कोशिकाओं/९५% एयर सेल संस्कृति मशीन ।
    नोट: Phenol-लाल प्रतिदीप्ति आधारित पहचान को प्रभावित करता है, लेकिन यह भी अपने एस्ट्रोजन की वजह से स्तन कैंसर कोशिकाओं के विकास पर एक संभावित प्रभाव की तरह31प्रभाव पड़ता है । उदाहरण के लिए, phenol लाल प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर और MCF के विकास-7 कोशिकाओं को उत्तेजित कर सकता है31. यह भी T47D कोशिकाओं के विकास को उत्तेजित कर सकता है31।
  2. दो बार फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । EDTA कोशिकाओं के लिए ०.०५% trypsin-EDTA में से 2 मिलीलीटर MCF-7 और एमडीए-एमबी-२३१ या ०.२५% trypsin-T47D के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: trypsin-EDTA की एकाग्रता अलग स्तन कैंसर कोशिका प्रकार के बीच कोशिकाओं के विभाजन के लिए आवश्यक भिन्न है, जबकि एक अनुपयुक्त एकाग्रता कुछ सेल सतह मार्करों जैसे CD44 और CD24३२के अभिव्यक्ति पैटर्न को प्रभावित कर सकते हैं ।
  3. संस्कृति 5% सह2/९५% हवा के एक वातावरण के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर ५ मिनट के लिए व्यंजन । अक्सर माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की टुकड़ी की जांच करने के लिए trypsin-EDTA से अधिक पाचन से कोशिकाओं को रोकने के ।
  4. जब ९०% से अधिक कोशिकाओं को अलग, पकवान को पूरा RPMI मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और यह सेल परत सतह पर कई बार पिपेट ।
  5. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित और 5 मिनट के लिए ३०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
    नोट: आमतौर पर, लगभग 6 x 106 कोशिकाओं को एक १०० mm डिश से प्राप्त किया जा सकता है जब प्रभावित ७०% तक पहुंचता है ।
  6. supernatant को छोड़ें और 106 कक्षों/100 μL FACS बफर (पंजाबियों ०.५% BSA और ०.१% सोडियम azide युक्त) में एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब पर छर्रों resuspend ।
  7. कई ट्यूबों में कोशिकाओं को विभाजित । MCF-7 कोशिकाओं के लिए, 4 ट्यूबों में कोशिकाओं को विभाजित: isotype नियंत्रण, CD24 सकारात्मक नियंत्रण और दोहरी धुंधला के लिए एक के रूप में CD24 एकल धुंधला के लिए एक के लिए दो ।
  8. T47D कोशिकाओं के लिए, 3 ट्यूबों में कोशिकाओं को विभाजित: isotype नियंत्रण के लिए दो और दोहरी धुंधला के लिए एक ।
  9. एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के लिए, 4 ट्यूबों में कोशिकाओं को विभाजित: isotype नियंत्रण, CD44 सकारात्मक नियंत्रण और दोहरी धुंधला के लिए एक के रूप में CD44 एकल धुंधला के लिए एक के लिए दो ।
  10. 5 मिनट के लिए ३०० x g और 4 ° c पर ट्यूबों फिर से केंद्रापसारक supernatant छोड़ें, और फिर FACS बफ़र में 1:50 पतला एफसी ब्लॉक जोड़ें ।
  11. ३०० x g पर केंद्रापसारक से पहले अंधेरे में 20 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों की मशीन और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस । supernatant को छोड़ें ।
  12. मानव CD44 के खिलाफ fluorochrome-संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जोड़ें (PerCP-cy 5.5) और CD24 (पीई) पर 1:40 और 1:10 कमजोर पड़ने (FACS बफर में) दोहरी धुंधला समूहों में । सकारात्मक नियंत्रण के लिए, CD44 (PerCP-cy 5.5) एमडीए-एमबी-२३१ के लिए जोड़ें और CD24 (पीई) MCF-7 कोशिकाओं को एक ही एकाग्रता, क्रमशः में जोड़ें ।
    नोट: CD44 और C24 का संयोजन सामान्यतः स्तन सीएससी अध्ययन26,27,28,29,30में किया गया है ।
  13. isotype नियंत्रण समूहों के लिए, PerCP-cy 5.5 माउस IgG2b, κ isotype एंटीबॉडी और पीई माउस CD44 के लिए IgG2a नियंत्रण के रूप में एक 1:40 कमजोर पड़ने पर, κ में isotype एंटीबॉडी के लिए CD24 नियंत्रण के रूप में एक 1:10 कमजोर पड़ने पर 106 कोशिकाओं/
    नोट: ब्याज की एंटीबॉडी के लिए Isotype नियंत्रण नकारात्मक नियंत्रण३३के रूप में सिफारिश कर रहे हैं.
  14. नमूनों की मशीन (कदम से १.१२ और १.१३) 4 ° c पर अंधेरे में 30 min. के लिए ३०० x g और 4 ° c पर 5 मिनट के लिए । supernatant को त्यागें ।
  15. दो बार पंजाब के ५०० μL के साथ गोली धो और ३०० x g और 4 ° c 5 मिनट के लिए पर केंद्रापसारक ।
  16. एक प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टर पर चलने से पहले पंजाब और फिल्टर के एक ४० µm नायलॉन जाल के माध्यम से ०.५ मिलीलीटर में गोली resuspend ।
  17. गेटिंग और क्षतिपूर्ति प्रयोजनों के लिए, दाग MCF-7 कोशिकाओं के साथ पीई-संयुग्मित एंटी CD24 एंटीबॉडी और दाग एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के साथ PerCP-cy 5.5-संयुग्मित विरोधी CD44 एंटीबॉडी के रूप में सकारात्मक नियंत्रण. नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1) के रूप में isotype नियंत्रण के साथ दाग कोशिकाओं का प्रयोग करें ।
  18. CD44-/CD24+ मार्करों के साथ गोल-नीचे polystyrene 12 x ७५ मिमी ट्यूब संग्रह मध्यम के 1 मिलीलीटर (phenol लाल मुक्त RPMI १६४० मध्यम 20% गर्मी के साथ पूरक-निष्क्रिय FBS और 2% v/वी पी एस) में इकट्ठा कोशिकाओं । 5 मिनट के लिए ३०० x जी और आर टी पर ट्यूबों केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    नोट: सीएससी-स्तन कैंसर की कोशिकाओंमें कोशिकाओं की तरह CD44+/CD24- कोशिकाओं26,27,28,29,30, और स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं के रूप में परिभाषित कर रहे हैं CD44-/CD24+ कोशिकाओं18 (चित्रा 1) के रूप में परिभाषित कर रहे हैं ।
  19. प्लेट क्रमबद्ध स्तन गैर संस्कृति में स्टेम कैंसर की कोशिकाओं को आगे संस्कृति के लिए ताजा संग्रह माध्यम युक्त डिश में ३७ ° c में 5% सह2 सेल संस्कृति मशीन ।

2. अपोप्तोटिक प्रेरण और पता लगाना

  1. DMSO में 1 मिमी staurosporine12,३४ तैयार करें । इलाज MCF-7 समूह के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अंतिम मात्रा (२.५ माइक्रोन staurosporine) के 10 मिलीलीटर तक बनाने के लिए MCF-7 कोशिकाओं के पूर्ण माध्यम के लिए 1 मिमी staurosporine के 25 μL जोड़ें । पिपेट सामग्री समान रूप से मिश्रण करने के लिए ।
  2. कल्चरल मीडियम को कोशिकाओं से निकालें, एक बार पंजाबियों की 2 एमएल वाली कोशिकाओं को धो लें । तो 6 एच के लिए २.५ माइक्रोन staurosporine के साथ मध्यम के 10 मिलीलीटर MCF-7 कोशिकाओं को जोड़ने के लिए apoptosis प्रेरित जब सेल घनत्व ७०% तक पहुंचता है ।
  3. DMSO में 1 mM paclitaxel३५,३६ तैयार करें । इलाज T47D समूह के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 10 मिलीलीटर (5 माइक्रोन paclitaxel) की अंतिम मात्रा तक बनाने के लिए T47D कोशिकाओं के पूर्ण माध्यम के लिए 1 मिमी paclitaxel के १२.५ μL जोड़ें । पिपेट सामग्री समान रूप से मिश्रण करने के लिए ।
  4. कल्चरल मीडियम को कोशिकाओं से हटा दें और एक बार पंजाब की 2 एमएल वाली कोशिकाओं को धो लें । फिर 10 एच के लिए 5 माइक्रोन paclitaxel के साथ मध्यम के 10 मिलीलीटर T47D कोशिकाओं को जोड़ने के लिए apoptosis प्रेरित जब सेल घनत्व ७०% तक पहुंचता है ।
    नोट: प्रेरण समय और उत्प्रेरण कि apoptosis प्रेरित की एकाग्रता जब भी एक नया सेल लाइन पहली बार के लिए प्रयोग किया जाता है अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  5. विलायक इलाज MCF-7 समूह के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 10 मिलीलीटर (यानी, ०.२५% वी/वी DMSO) की एक अंतिम मात्रा तक बनाने के लिए MCF-7 कोशिकाओं के पूर्ण माध्यम से बाँझ dimethyl sulfoxide (DMSO) के 25 μL जोड़ें । पिपेट सामग्री समान रूप से मिश्रण करने के लिए ।
  6. संस्कृति मध्यम विलायक इलाज MCF-7 कोशिकाओं से निकालें, एक बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो लो । फिर अनुसूचित जनजातियों के लिए विलायक नियंत्रण के रूप में 6 एच के लिए ०.२५% v/v DMSO के साथ मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  7. विलायक इलाज T47D समूह के लिए, T47D कोशिकाओं के पूर्ण माध्यम में बाँझ DMSO के 5 μL जोड़ने के लिए 10 मिलीलीटर अंतिम मात्रा (यानी, ०.०५% वी/वी DMSO) एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में बनाने के लिए । पिपेट सामग्री समान रूप से मिश्रण करने के लिए ।
  8. संस्कृति माध्यम को विलायक स्वास्थ्यकर्मी T47D कोशिकाओं से निकालें, एक बार पंजाब के 2 मिलीलीटर से धो लें । फिर, paclitaxel के लिए विलायक नियंत्रण के रूप में 10 h के लिए ०.०५% v/v DMSO के साथ मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. इलाज कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए, ५० एनएम Mitotracker लाल CMXRos और २५० एनजी/एमएल Hoechst ३३३४२ के साथ दाग कोशिकाओं, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक और 20 मिनट के लिए एक वातावरण के तहत मशीन 5% CO2/९५% हवा । एक 60x फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के तहत ठेठ अपोप्तोटिक सेल आकृति विज्ञान का पालन.
    नोट: ठेठ apoptosis आकृति विज्ञान कोशिका संकोचन, झिल्ली blebbing, mitochondria विखंडन और परमाणु संघनित्र भी शामिल है, लेकिन बरकरार सेलुलर झिल्ली के साथ12,13,14,15 ,18,३७.

3. अपोप्तोटिक कोशिकाओं और Apoptosis उलटा प्रक्रिया का अलगाव

  1. दोनों अपोप्तोटिक उत्प्रेरण-और विलायक इलाज MCF-7 या T47D कोशिकाओं 3 माइक्रोन Caspase के साथ-3/अंधेरे में 106/mL के सेल एकाग्रता पर 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस में 5% कं2/९५% हवा के एक वातावरण के तहत 7 हरी पहचान डाई ।
  2. छंटाई के लिए सॉर्टर पर चलने से पहले एक ४० µm नायलॉन जाल के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर ।
  3. गेटिंग प्रयोजनों के लिए, पहले गेट प्रमुख आबादी (R1) और आगे तितर बितर और साइड कैटर (चित्रा 3) के साथ डॉट्स में ग्राफ की साजिश रचने के द्वारा मलबे को बाहर ।
  4. नकारात्मक क्षेत्र (R2) (चित्रा 3ए) गेट करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में Caspase-3/7 हरी पहचान डाई जोड़ने के बिना अनुपचारित कोशिकाओं का प्रयोग करें ।
  5. staurosporine12,18,३४ के लिए 24 घंटे के साथ इलाज कोशिकाओं का उपयोग करें और सकारात्मक क्षेत्र (R3) (आंकड़ा 3 बी) गेट करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में डाई के साथ दाग ।
  6. राउंड-बॉटम polystyrene 12 x ७५ mm ट्यूबों में उत्प्रेरण-उपचार समूहों से सकारात्मक कोशिकाओं (R3) लीजिए संग्रह माध्यम के 1 मिलीलीटर (चरण १.१८ में संग्रह माध्यम के रूप में ही) (आंकड़े 3सी-3डी) युक्त । 5 मिनट के लिए ३०० x जी और आर टी पर ट्यूबों केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  7. इकट्ठा नकारात्मक कोशिकाओं (R2) विलायक-इलाज समूहों से दौर में नीचे polystyrene 12 × ७५ मिमी ट्यूबों के साथ 1 संग्रह माध्यम की मिलीलीटर के रूप में ३.६ कदम (आंकड़े 3ई-3एफ) ।
    नोट: कोशिकाओं का एक छोटा सा हिस्सा (जैसे १०,००० कोशिकाओं) को एकत्र किया जा सकता है और सक्रिय caspases मार्कर के पैटर्न की जांच करने के लिए सॉर्टर पर फिर से चला सकते हैं । यदि ९०% से अधिक सॉर्ट किए गए विलायक-इलाज कक्षों में दिखाए जाते हैं caspase-ऋणात्मक क्षेत्र या ९०% से अधिक सॉर्ट किए गए उत्प्रेरण-उपचार कक्ष caspase-धनात्मक क्षेत्र में दिखाए जाते हैं, इन एकत्र कोशिकाओं को अपेक्षाकृत शुद्ध माना जाता है (आंकड़े 3 सी-3F). अंयथा, सॉर्टिंग क्षेत्र और/सॉर्टर रीसेट किया जाना चाहिए ।
  8. ताजा संग्रह माध्यम में क्रमबद्ध कोशिकाओं resuspend और उन्हें 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों और संस्कृति में ३७ डिग्री सेल्सियस के एक वातावरण के तहत 5% CO2/९५% हवा में apoptosis उत्क्रमण के लिए 7 दिनों के लिए ।

4. Caspase-सक्रिय कोशिकाओं में Apoptosis की पुष्टि

  1. annexin-बाइंडिंग बफ़र (pH ७.४) तैयार करने के लिए 10 mm HEPES, १४० mm NaCl, और २.५ mm CaCl2 मिलाएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर स्टोर और प्रकाश को बेनकाब करने के लिए बफर से बचें ।
  2. एक १०० µ जी/एमएल काम समाधान propidium आयोडाइड (PI) के कमजोर द्वारा 5 µ 1 मिलीग्राम/एमएल PI स्टॉक समाधान में ४५ µ के annexin-बाध्यकारी बफर के एल । 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान और प्रकाश को बेनकाब करने के लिए समाधान से बचने ।
    नोट: PI एक संभावित mutagen है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए ।
  3. २.१ २.५ करने के लिए चरणों में के रूप में उत्प्रेरण-व्यवहार कक्ष तैयार करें ।
  4. सेल परत 3 पर मध्यम pipetting द्वारा उत्प्रेरण-इलाज MCF-7 या T47D कोशिकाओं को इकट्ठा-5x कोशिकाओं को अलग करने के लिए । कोशिकाओं को एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब स्थानांतरण ।
  5. 5 मिनट के लिए ३०० x g और RT पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
  6. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 106/mL के सेल एकाग्रता में पूर्ण माध्यम के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित और 3 माइक्रोन Caspase 3/7 हरे रंग का पता लगाने के साथ दाग कोशिकाओं 30 मिनट के लिए अंधेरे में ३७ ° c.
  7. 5 मिनट के लिए ३०० x g और RT पर केंद्रापसारक । supernatants को छोड़ें ।
  8. बर्फ की 1 मिलीलीटर ठंड पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो और ३०० x g और 4 ° c 5 मिनट के लिए पर केंद्रापसारक । supernatants को त्यागें ।
  9. annexin-बाइंडिंग बफ़र के annexin V संयुग्मी के जोड़ें 5 μL और १०० µ g/एमएल PI के 1 µ l के साथ कक्षों की १०० μL में resuspend कक्ष निलंबन के प्रत्येक १०० μL के लिए समाधान काम कर रहे है और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: Annexin वी और PI आमतौर पर एक साथ प्रयोग किया जाता है प्रवाह cytometry३८,३९,४०में अपोप्तोटिक कोशिकाओं लेबल ।
  10. जोड़ें ४०० µ l annexin-बाइंडिंग बफ़र, धीरे मिश्रण । एक फ्लो cytometer पर चलने से पहले नमूनों को बर्फ पर रखें ।

5. स्तन सीएससी की माप-प्रवाह Cytometry द्वारा कोशिकाओं की तरह

  1. ०.०५% trypsin-EDTA के साथ दोनों उत्प्रेरण-या विलायक-इलाज समूहों में उलट MCF-7 फसल । फसल T47D दोनों उत्प्रेरण या विलायक-इलाज समूहों में या ०.२५% trypsin-EDTA के साथ १.२ चरणों में १.५ के रूप में ।
  2. fluorochrome के साथ कोशिकाओं दाग-मानव CD44 के खिलाफ संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (PerCP-cy 5.5) और चरण १.१२ में के रूप में CD24 (पीई) । इस बीच, चरण १.१३ में के रूप में isotype नियंत्रण तैयार करें ।
  3. एक प्रवाह cytometer पर कोशिकाओं को चलाने और CD44+/CD24- मार्करों के साथ कोशिकाओं का प्रतिशत का पता लगाने ।

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Representative Results

आदेश में स्तन गैर से संक्रमण का निरीक्षण करने के लिए स्टेम कैंसर कोशिकाओं को स्तन CSC-कोशिकाओं की तरह, CD44 की पहली छंटाई-/CD24+ स्तन कैंसर की कोशिकाओं की जरूरत थी । MCF-7 सेल लाइन है, जो मूल जनसंख्या (चित्रा 1) में सीएससी मार्करों के साथ ०.१५% कोशिकाओं के आसपास है के लिए, इस कदम apoptosis उत्क्रमण के दौरान सीएससी संवर्धन की संभावना को बाहर करने में मदद की । इसके विपरीत, यदि मूल जनसंख्या में CSC मार्कर वाले कोई कक्ष नहीं थे, जैसे T47D कक्षों के लिए (आरेख 1), तो इस सॉर्टिंग कार्यविधि को छोड़ा जा सकता है. दरअसल, गेटिंग प्रत्येक मार्कर के सकारात्मक और नकारात्मक की परिभाषा को प्रभावित करते हैं, जो अंततः सीएससी के प्रतिशत को प्रभावित करेगा । इसलिए, isotype नियंत्रण सहित उचित नियंत्रण ब्याज की एंटीबॉडी के लिए, प्रत्येक मार्कर के लिए एक दाग नियंत्रण सावधानी से चुना और गेट समायोजन (चित्रा 1) के लिए तैयार किया जाना चाहिए.

स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं के साथ, apoptosis उलटा मॉडल के बाद स्थापित किया जा सकता है । ठेठ रूपात्मक परिवर्तन अपोप्तोटिक उत्प्रेरण जोड़ने के बाद मनाया जा सकता है और कोशिकाओं को दवा वापसी (चित्रा 2) के बाद समान आकृति विज्ञान के साथ apoptosis से पुनर्प्राप्त करना चाहिए. Caspase-3/7 Caspase में एमिनो एसिड अनुक्रम DEVD पहचानता है-3/7 ग्रीन डिटेक्शन डाई और Caspase के सक्रिय रूपों-3/7 इस साइट४१सट करने में सक्षम हैं । मूलतः, Caspase के प्रतिदीप्ति-3/cytosol में हरे रंग का पता लगाने डाई कमजोर है, जबकि अगर डाई और translocated नाभिक को सट है, प्रतिदीप्ति संकेत के नाभिक में डीएनए के लिए अपनी बाध्यकारी के बाद परिलक्षित होगा । यह स्पष्ट अंतर प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है । इसलिए, उन caspase-सक्रिय कोशिकाओं लेबल और उनके उच्च प्रतिदीप्ति caspase सक्रियण के बिना उन लोगों की तुलना तीव्रता के आधार पर हल किया जा सकता है (3 ए केआंकड़े 3d) । अपोप्तोटिक प्रेरण प्रक्रिया के दौरान, एक उपयुक्त विलायक नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए: caspase सक्रियण के बिना विलायक उपचार कोशिकाओं (आंकड़े 3E और 3F) एकत्र किए गए संभावना है कि FACS प्रक्रिया या विलायक ही था बाहर करने के लिए संक्रमण के लिए कारण, यदि कोई हो ।

आदेश में दिखाने के लिए कि उन FACS-क्रमबद्ध caspase-सक्रिय कोशिकाओं वास्तव में अपोप्तोटिक थे, हम सह Annexin वी और PI के साथ इन कोशिकाओं दाग । अपोप्तोटिक कोशिकाओं में प्रारंभिक चरण के परिवर्तन में से एक है phosphatidylserine की भीतरी ओर से प्लाज्मा झिल्ली की बाहरी सतह पर translocation की कोशिका१३,३८,३९,४०; phosphatidylserine के इस externalization का पता Annexin वी द्वारा ही लगाया जा सका । हालांकि यह परिवर्तन apoptosis के लिए अद्वितीय नहीं है, PI कोशिका झिल्ली की अखंडता के आधार पर परिगलन से apoptosis भेद के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रकार, Annexin V बाध्यकारी लेकिन PI धुंधला के बिना के साथ कोशिकाओं अपोप्तोटिक कोशिकाओं के रूप में माना जाता है । अपोप्तोटिक उत्प्रेरण उपचार समूहों में Caspase सक्रिय कोशिकाओं Annexin वी सकारात्मक और PI नकारात्मक होना पाया गया, सुझाव है कि वे थे अपोप्तोटिक कोशिकाओं (चित्रा 4).

अपोप्तोटिक कोशिकाओं में caspase सक्रियण के आधार पर दूसरी छंटाई के बाद, इन अपोप्तोटिक कोशिकाओं को एकत्र किया गया और बाद में वसूली के लिए संस्कृति । उलट कोशिकाओं है कि जीवित थे संस्कृति कंटेनर नीचे संलग्न करने के लिए और पैदा करना जारी कर रहे थे । 7 दिनों के बाद, CD44 और CD24 के धुंधला रिवर्स कोशिकाओं में प्रदर्शन किया था, जबकि नियंत्रण पहले की तरह एक ही समय में तैयार थे । विलायक इलाज समूहों (चित्रा 1) के साथ तुलना में, प्रवाह cytometric विश्लेषण से पता चला कि वहां घटनाओं (कोशिकाओं) CD44 में प्रदर्शित+/CD24- उलट स्तन गैर स्टेम कैंसर सेल जनसंख्या में वृत्त का चक्र (1 चित्रा) . चूंकि हम पहले से ही CD44+/CD24 के साथ कोशिकाओं को बाहर रखा था- apoptosis प्रेरण के अग्रिम में और केवल CD44-/CD24+ स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं को चुना गया था, इन CD44+/CD24- सीएससी-कोशिकाओं की तरह ही हो सकता है apoptosis उत्क्रमण के दौरान स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं से पारगमन ।

Figure 1
चित्र 1: प्रवाह cytometry में स्तन कैंसर की कोशिकाओं पर प्रतिनिधि स्तन सीएससी मार्कर धुंधला ।
MCF-7, एमडीएस-एमबी-२३१ और T47D मानव मोनोक्लोनल (CD44-PerCP 5.5) और cy (पीई) के खिलाफ fluorochrome-संयुग्मित CD24 एंटीबॉडी के साथ दाग थे । कक्षों को मलबे से बाहर निकालने के लिए पहले gated स्कैटर (FSC) और साइड स्कैटर (एसएससी) (P1) द्वारा रखा गया था । CD24 और CD44 के Isotype नियंत्रण क्रमशः CD24 और CD44 के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । MCF-7 CD24 के साथ दाग कोशिकाओं CD24 के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था और एमडीए-एमबी-२३१ CD44 के साथ दाग कोशिकाओं CD44 के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । गैर स्टेम MCF-7 स्तन कैंसर कोशिकाओं (P2) हल किया गया । इन सॉर्ट की गई कोशिकाओं और T47D कोशिकाओं apoptosis उलटा प्रक्रिया के अधीन थे । सीएससी की तरह (CD44+CD24-) कोशिकाओं apoptosis उत्क्रमण के बाद दिखाई दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: अपोप्तोटिक उत्तेजना प्रेरण के तहत स्तन कैंसर कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन ।
स्तन कैंसर की कोशिकाओं ठेठ अपोप्तोटिक कोशिका सिकुड़न, झिल्ली blebbing, mitochondria विखंडन (मोनोक्रोम आंकड़ों में पीले तीर) और परमाणु संघनित्र सहित रूपात्मक परिवर्तन दिखाया । नाभिक (नीले रंग में): Hoechst ३३३४२ के साथ सना हुआ कोशिकाओं का नाभिक ब्लू कलर में दिखाया गया । Mitochondria (गुलाबी रंग में): Mitotracker लाल CMXRos से सना हुआ कोशिकाओं का Mitochondria पिंक कलर में दिखाया गया । विलय: आंकड़े दोहरे रंग में विलय mitochondria और नाभिक दोनों दिखा । Mitochondria (धूसर में): Mitotracker लाल CMXRos से सना हुआ कोशिकाओं का Mitochondria मोनोक्रोम में दिखाया गया । विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग): पूरे सेल । ऊपरी: MCF-7 कोशिकाओं staurosporine (अनुसूचित जनजातियों) के लिए 6 के साथ इलाज किया ज तो 24 घंटे के लिए उलट: T47D कोशिकाओं paclitaxel के साथ 10 घंटे के लिए उत्क्रमण के साथ इलाज किया गया 24 ज. स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सॉर्टर द्वारा Caspase सक्रियकरण विश्लेषण । (क) बिना दाग MCF-7 कोशिकाओं staurosporine (अनुसूचित जनजातियों) उपचार के नकारात्मक नियंत्रण (R2) के रूप में इस्तेमाल किया गया । (ख) MCF-7 कोशिकाओं के साथ इलाज किया staurosporine (अनुसूचित जनजातियों) के लिए 24 ज. R3 क्षेत्र में कोशिकाओं caspase सक्रिय कोशिकाओं के रूप में माना गया. (ग) MCF-7 कोशिकाओं के साथ इलाज किया staurosporine (अनुसूचित जनजातियों) के लिए 6 एच. R3 क्षेत्र में कोशिकाओं FACS-क्रमबद्ध थे. (घ) FACS-क्रमबद्ध caspase-आपन MCF-7 कोशिकाओं के बाद staurosporine (अनुसूचित जनजातियों) के लिए उपचार 6 ज फिर से चला रहे थे । (ङ) DMSO-स्वास्थ्यकर्मी MCF-७ कक्ष. (च) FACS-सॉर्ट किए गए कक्ष caspase सक्रियण के बिना 6 h के लिए DMSO उपचार के बाद पुन: चलाए गए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Annexin वी और PI धुंधला caspase-सक्रिय कोशिकाओं के प्रवाह cytometry में । MCF-7 और T47D कोशिकाओं को मलबे से बाहर करने के लिए gated फॉरवर्ड कैटरिंग (FSC) और साइड स्कैटर (एसएससी) (P1) द्वारा सबसे पहले थे । कोशिकाओं है कि अपोप्तोटिक उत्प्रेरण और बिना किसी भी दाग के साथ अनुपचारित थे नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । कोशिकाओं अपोप्तोटिक उत्प्रेरण के साथ इलाज के लिए, caspase-सक्रिय कोशिकाओं [यानी, caspase-3/7 हरे सकारात्मक कोशिकाओं] का चयन किया गया (पी पी) Annexin वी और PI धुंधला की प्रतिदीप्ति तीव्रता को दिखाने के लिए । सभी Caspase-3/हरे सकारात्मक कोशिकाओं Annexin वी सकारात्मक और PI नकारात्मक थे, सुझाव है कि वे अपोप्तोटिक थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल apoptosis उत्क्रमण का एक परिणाम के रूप में स्तन CSC-जैसे कोशिकाओं में स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं के संक्रमण का पता लगाने के लिए एक सीधा और स्पष्ट तरीका का वर्णन । इन उलट कोशिकाओं के CSC गुणों की पुष्टि in इन विट्रो mammosphere गठन परख का उपयोग करके सहायता प्राप्त किया जा सकता है और vivo में xenograft ट्रांसप्लांटेशन immunodeficient चूहों में18,24,26 ,27,४२,४३,४४,४५. यहां, हम दो स्तन कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करें, लेकिन इस प्रोटोकॉल आगे अंय स्तन कैंसर सेल लाइनों में लागू किया जा सकता है । इस घटना के बाद से स्तन कैंसर कोशिका लाइन में स्पष्ट है जिसमें कम संख्या में CD44+/CD24- कोशिकाओं मूल रूप से मौजूद है, यह नहीं का चयन करने के लिए सुझाव दिया है सेल लाइनों जैसे एमडीए-एमबी-२३१ में ९०% से अधिक CD44+ कक्षों.

चूंकि गेटिंग प्रवाह विश्लेषण में महत्वपूर्ण है, उचित और पर्याप्त नियंत्रण अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए । छंटाई के लिए, शुद्धता भी कोशिकाओं के वास्तविक संग्रह से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, पहली छंटाई की पवित्रता को जानने के लिए, कोशिकाओं के एक छोटे से हिस्से (जैसे १०,००० कोशिकाओं) को एकत्र किया जा सकता है और CSC मार्करों के पैटर्न की जांच करने के लिए सॉर्टर पर फिर से चला सकते हैं । यदि इन सॉर्ट किए गए कक्षों का ९०% से अधिक CD44-/CD24+ हैं और CD44+/CD24- क्षेत्र में नहीं दिखाए जाते हैं, तो एकत्र कोशिकाओं को अपेक्षाकृत शुद्ध माना जाता है (चित्रा १). CD44+/CD24- क्षेत्र में कक्ष प्रकट होते हैं, तो सॉर्टिंग क्षेत्र और/या सॉर्टर रीसेट होना चाहिए । छंटाई या तो संस्कृति हूड के अंदर एक सॉर्टर का उपयोग कर या संग्रह और हल कोशिकाओं के लिए संस्कृति के माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने के द्वारा संभव के रूप में बाँझ आयोजित किया जाना चाहिए ।

कैंसर कोशिका स्तन कैंसर के अलावा अंय प्रकार भी चुना जा सकता है और विभिंन अपोप्तोटिक उत्तेजनाओं के साथ प्रेरित करने apoptosis उत्क्रमण मॉडल स्थापित । जबकि caspase सक्रियण 2 एच के रूप में जल्दी पता लगाया जा सकता है, छंटाई समय सावधानी से चुना जाना चाहिए । चूंकि जनसंख्या में कक्ष सिंक्रनाइज़ नहीं हुए हैं, एक विशिष्ट समय बिंदु पर, प्रत्येक कक्ष apoptosis के विभिंन चरणों तक पहुंच सकता है । इस बीच, कोशिकाओं caspase सक्रियण के बाद एक अपोप्तोटिक मौत पर जा रहा रखने के लिए । इसलिए, यदि उत्प्रेरणों केवल जब सभी कोशिकाओं को caspase सक्रियण तक पहुंच रहे हैं, कुछ कोशिकाओं को पहले से ही डीएनए विखंडन की अवस्था तक पहुंच सकते हैं, उंहें निकालने के बाद भी ठीक करने में असमर्थ बना रहे हैं । यह बहुत लंबे समय के लिए caspase-सक्रिय कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत को प्राप्त करने के लिए apoptosis प्रेरित करने का सुझाव नहीं है, लेकिन संग्रह के बाद मर कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या छोड़ने की लागत के साथ । इसके अलावा, मशीन समय और डाई एकाग्रता है कि लेबल caspase सक्रिय कोशिकाओं को अनुकूलित किया जाना चाहिए जब भी एक नया सेल लाइन पहली बार के लिए प्रयोग किया जाता है ।

सफलतापूर्वक अपोप्तोटिक कोशिकाओं में apoptosis उत्क्रमण उत्प्रेरण के रूप में एक और चिंता का विषय कोशिकाओं की कम वसूली की दर है (आमतौर पर से कम 10%). कोशिकाओं apoptosis प्लस छंटाई प्रक्रिया के माध्यम से चला गया है; इसलिए, वे बहुत ही सौंय हैंडलिंग के दौरान की आवश्यकता होती है और संग्रह और resuspension चरणों में स्थानांतरण । इसके अलावा, थाली या बाद में संस्कृति के लिए इस्तेमाल पकवान का चुनाव एकत्र कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर नहीं होना चाहिए, लेकिन वसूली की उंमीद की संख्या पर । अंयथा, कोशिकाओं को रिवर्स और फिर से बढ़ने के लिए भी विरल आवंटित किया जा सकता है । यह देखते हुए कि गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं को एक उच्च गति से बढ़ने और पुन: गठित सेल जनसंख्या४६में हावी हो सकता है, पता लगाने के समय बहुत दूर पहले वसूली दिन से नहीं होना चाहिए ।

इस विधि पहले स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिका को अलग तो उंहें अपोप्तोटिक प्रेरण जहां एक दूसरे छंटाई caspase सक्रियण के आधार पर किया जाता है पहले कोशिकाओं को बरामद करने के लिए लागू होता है । उल्टे जनसंख्या में स्तन CSC-like कक्षों की पुन: उपस्थिति का पता प्रवाह cytometry द्वारा लगाया जाता है । इस के बाद से इन विट्रो apoptosis उलटा प्रक्रिया शुद्ध अपोप्तोटिक कैंसर की कोशिकाओं को अलग, प्रयोगों के एक नंबर अब इन असली उलट कोशिकाओं के परिणामों को समझने के लिए आयोजित किया जा सकता है. स्तन कैंसर की कोशिकाओं के अलावा, अन्य ठोस ट्यूमर प्रकार के साथ ही hematologic द्रोह है कि ज्ञात सीएससी मार्करों के साथ कर रहे हैं अध्ययन किया जा सकता है और विभिन्न अपोप्तोटिक उत्तेजना इस्तेमाल किया जा सकता. इसलिए, इस विधि के विस्तार और कैंसर की जांच के एक बोर्डर गुंजाइश पर लागू है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम नवाचार प्रौद्योगिकी आयोग के अभिनव प्रौद्योगिकी कोष द्वारा समर्थित किया गया था: Agrobiotechnology (CUHK), लो Kwee-Seong बायोमेडिकल रिसर्च फंड और ली Hysan फाउंडेशन की राज्य कुंजी प्रयोगशाला से फंडिंग समर्थन । Y.X. CUHK से स्नातकोत्तर की छात्राओं ने समर्थन किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40 μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus -
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

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References

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Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal. J. Vis. Exp. (143), e58642, doi:10.3791/58642 (2019).

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