Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Обнаружение потока гранулярных новообразованной груди Рак стволовых клеток как клеток после разворота апоптоз

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Здесь мы представляем протокол изолировать apoptotic клеток рака молочной железы путем сортировки активирован флуоресценции клеток и далее обнаружить переход груди не стволовых раковых клеток к стволовых клеток подобных клеток рака молочной железы после разворота апоптоз проточной цитометрии.

Abstract

Рецидивирование рака давно был изучен онкологов, в то время как основные механизмы остаются неясными. Недавно мы и другие обнаружили, что явление именем разворота апоптоз приводит к увеличению tumorigenicity в различных моделях клеток при различных раздражителей. Предыдущие исследования были сосредоточены на отслеживание этого процесса в vitro и in vivo; Однако изоляции реальной обратный клеток пока достичь, который ограничивает наше понимание о последствиях апоптоз разворота. Здесь мы воспользоваться краска каспазы-3/7 зеленый обнаружения метки ячейки с активированной caspases после индукции апоптоза. Клетки с позитивные сигналы далее сортируются по активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS) для восстановления. Морфологическое исследование под confocal микроскопии помогает подтвердить статус apoptotic перед СУИМ. Увеличение tumorigenicity часто может объясняться повышение доли Рак стволовых клеток (CSC)-как клетки. Кроме того Учитывая неоднородность рака молочной железы, определение происхождения этих CSC-подобных клеток будет иметь решающее значение для лечения рака. Таким образом мы готовим груди не стволовых раковых клеток до вызывая апоптоз, изолируя caspase активации клеток и выполнение процедуры разворота апоптоз. Потока cytometry анализ показывает, что CSC-подобных клеток молочной железы снова появляются в обратном группе, о том, что CSC-подобных клеток молочной железы являются транзитом от груди не стволовых раковых клеток во время вспять апоптоз. Таким образом этот протокол включает в себя изоляцию apoptotic клеток рака молочной железы и выявления изменений в CSC процент в обращенном клетках подачей cytometry.

Introduction

Рак был ведущей причиной смерти, вызывая тяжелое бремя для стран во всем мире1. Рак молочной железы занимает видное место как с точки зрения заболеваемости и смертности женщин больных среди всех видов рака1. Из-за гетерогенности рака комбинации препаратов обычно используется в химиотерапии для достижения раковых клеток смерть2,3,4. Однако поскольку общие химиотерапевтических препаратов часто целевой ДНК5,6, белка синтез7,8 и/или микротрубочек динамика9, быстро растущих клеток являются затрагивает наиболее при покоя клеток, таких как рак стволовых клеток (CSC) s, обычно меньше10. Пок являются, следовательно, более вероятно выжить после лечения, которое впоследствии приводит к лекарственной устойчивости и рак рецидив10,11. Таким образом ликвидация CSCs стала важной темой для лечения рака, и исследование происхождения CSCs является необходимым.

Дополнительные исследования на феномен апоптоза разворота были проведены в последнее десятилетие12,13,14,,1516,17,18 , 19. до появления этой концепции, она широко признана что клетки будут необратимо проходят apoptosis после активацию caspase. Caspases представляют собой семейство белков-ферменты, которые играют ключевую роль в стадии посвящения и исполнение апоптоза, включая формирование apoptotic сложные и расщепления течению субстратов20. Активировать caspases палач caspase 3 или caspase 7 уже считается «точка невозврата» для apoptosis21. Однако исследователи недавно отметил, что apoptosis переключение происходит как в пробирке и в естественных условиях, , во время которых клетки могут оправиться от апоптоза даже после активации Каспаза12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Кроме того, агрессивный функции такие, как более высокую устойчивость к оригинальной apoptotic индуктор и выше инвазивность обнаруживаются в обращенном рака клеток15. Следовательно было предложено, что процент CSC-подобных клеток будет выше в обращенном населения по сравнению с необработанными клетки, в конечном итоге способствует более злокачественного особенностей после разворота апоптоз18.

Ранее, многие были предприняты усилия для отслеживания апоптоз разворота в пробирке и что более важно, в естественных условиях, которые значительно помогают в подтверждение универсального характера этого процесса по16,17,19. Однако из-за неудовлетворительной изоляции клеток, которые действительно прошли apoptosis разворота отсутствует системное исследование о последствиях обращенном клеток. Существует необходимость приобретения чистых apoptotic клеток и восстановить их для дальнейшего изучения. Таким образом мы используем традиционно общепринятых маркер активации caspase палач как маркер «точка невозврата»21 для apoptosis и использовать активированный флуоресценции клеток, сортируя (FACS) подвергать caspase активации клеток окрашенных с красителем обнаружения зеленый каспазы-3/7. Краситель ковалентно связан с короткой аминокислотной последовательности, DEVD, которое может быть признано и расщепляется активных caspases 3/7. Расщепление помогает освободить краситель, который будет перемещать из цитозоль к ядру, где он связывается с ДНК и излучает сильный флуоресценции. Эта процедура позволяет избежать с помощью массовых популяции клеток, в котором некоторые клетки могут не претерпели апоптоз.

Пок или инициирование опухоли клетки были определены в многих солидных опухолей с помощью одного или сочетания нескольких поверхности marker(s) и очень мало число этих клеток являются достаточными для формы опухоли в иммунодефицитных мышей22,23, 24,25,,2627. Сочетание CD44 и CD24 широко использовалась в груди CSC исследования и CD44+/CD24– клетки были определены как груди CSCs26,27,,2829 , 30. Недавно мы провели серию экспериментов для подтверждения предлагаемые отношения между апоптоз разворота и пок и продемонстрировать, что перевернутая груди раковые клетки получила рост опухоли формирование способности в vitro и in vivo с повышенный процент клеток с CSC маркеры18. Хотя мы могли бы не исключают, что груди CSCs выжить лучше и таким образом получить обогащенный после разворота апоптоза, что важно, когда мы изолировать не стволовых раковых клеток и предмет их апоптоз разворота, CSC появятся в первоначально не шток популяции клеток рака, предполагая, что не стволовых раковых клеток может способствовать увеличение доли CSCs во время вспять апоптоз.

Эта статья стремится продемонстрировать переход от груди не стволовых раковых клеток к груди CSC-подобных клеток после разворота апоптоз и обнаружить этот переход проточной цитометрии. Груди не стволовых раковых клеток первоначально подготовленный изоляции CD44–/CD24+ груди раковые клетки, СУИМ. Затем апоптоз индуцированных и подтверждена морфологические изменения под микроскопом. После этого apoptotic клетки положительно сторонниками Caspase 3/7 обнаружения зеленый краситель изолированные FACS и далее культивировали в отсутствие индукторов апоптоза для разворота апоптоз. Перевернутая клетки затем витражи с маркерами CSC после 7 дней для анализа потока гранулярных восстановления. Клетки с CD44+/CD24– маркеры снова появляются в обращенном населения, предполагая, что переход от не стволовых раковых клеток к CSC-подобных клеток произошла во время вспять апоптоз.

Апоптоз разворота наблюдается в нескольких рак клеточных линий, а также нормальные клетки первичной относились с различными apoptotic раздражителей в пробирке12,13. Этот процесс также был проложен дрозофилы модель в естественных условиях16,17,19. Много информации относительно базового механизма рецидива рака в различных раковых заболеваний модели и происхождение CSCs можно получить с помощью метода, как описано в этой рукописи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка номера стволовых клеток рака груди

  1. Культура MCF-7 и MDA-MB-231 клетки в 10 мл свободного фенола Красного Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 среды с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) в 100 мм блюдо. T47D культура в 10 мл свободного фенола Красного RPMI 1640 среды с 2 мм L-глютамином, 10% тепло инактивированная FBS и 1% v/v пенициллин-стрептомицином (PS) в 100 мм блюдо. Культура клетки при 37 ° C в инкубатор культуры клеток 5% CO2/95% воздуха.
    Примечание: Фенол красный влияет на основе флуоресценции обнаружения, но также имеет потенциальное влияние на рост клеток рака молочной железы из-за его эффекты эстрогена31. Например красный фенол может стимулировать рецепторы прогестерона и рост клетками MCF-731. Он мог бы также стимулировать рост клеток T47D31.
  2. Вымыть клетки с 2 мл фосфата буфер солевой раствор (PBS) дважды. Добавьте 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА MCF-7 и MDA-MB-231 или 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в T47D клетки.
    Примечание: Концентрация трипсина ЭДТА необходимые для разделения клетки среди типов клеток рака молочной железы различных меняться хотя неуместно концентрации может повлиять на шаблоне выражения некоторых клеток поверхности маркеров, например CD44 и CD2432.
  3. Культура блюда 5 минут при 37 ° C под атмосферу 5% CO2/95% воздуха. Часто проверьте отряд клеток под микроскопом, чтобы предотвратить клетки от чрезмерной Пищеварение трипсина ЭДТА.
  4. Когда 90% клеток отсоединить, добавить 5 мл завершенных RPMI среды на блюдо и Пипетка его на поверхности слоя клеток в несколько раз.
  5. Передать клетки 15 мл Конические трубки и центрифуги на 300 x g и 4 ° C за 5 мин.
    Примечание: Как правило около 6 x 106 клеток могут быть получены блюдо 100 мм при confluency достигает 70%.
  6. Отменить супернатант и Ресуспензируйте окатышей на 106 клеток/100 мкл буфера СУИМ (PBS, содержащие азид натрия 0,1% и 0,5% BSA) в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  7. Разделите ячейки на несколько труб. Для клетками MCF-7, клетки делят на 4 трубы: два для изотипа контролирует, один для CD24 одного окрашивания как положительный контроль CD24 и один для двойной пятнать.
  8. Для T47D клетки, клетки делят на 3 трубки: два для изотипа элементов управления и один для двойной пятнать.
  9. Для MDA-MB-231 клетки, клетки делят на 4 трубы: два для изотипа контролирует, один для CD44 одного окрашивания как CD44 положительный контроль и один для двойной пятнать.
  10. Центрифуга трубы снова на 300 x g и 4 ° C для 5 минут удалить супернатант, а затем добавить что ФК блок разводят 1:50 в буфере СУИМ.
  11. Проинкубируйте образцы на льду на 20 мин в темноте перед центрифугированием при 300 x g и 4 ° C для 5 минут удалить супернатант.
  12. Добавить конъюгированных флюрохром моноклональные антитела против человека CD44 (PerCP-Cy5.5) и CD24 (PE) в 1:40 до 1:10 разведений (в буфере СУИМ) в двойной пятнать групп. Для положительных элементов управления, добавить CD44 (PerCP-Cy5.5) для MDA-MB-231 и добавить CD24 (PE) клетками MCF-7 на такой же концентрации, соответственно.
    Примечание: Сочетание CD44 и C24 широко использовался в груди CSC исследование26,27,28,29,30.
  13. Для изотипа групп управления, добавить PerCP-Cy5.5 мыши IgG2b, κ в 1:40 разрежения как элемент изотипа CD44 антител и PE мыши IgG2a, κ в 1:10 разрежения как элемент isotype антитела CD24 на 106 клеток/100 мкл.
    Примечание: Isotype антитела интерес рекомендуется как негативный контроль33.
  14. Проинкубируйте образцы (от шагов 1.12 и 1.13) при 4 ° C в темноте на 30 мин центрифуги на 300 x g и 4 ° C для 5 минут удалить супернатант.
  15. Помойте лепешка дважды с 500 мкл PBS и центрифуги на 300 x g и 4 ° C за 5 мин.
  16. Ресуспензируйте гранулы в 0,5 мл PBS и процеживают через 40 мкм нейлоновая сетка перед запуском на сортировщик активирован флуоресценции клеток.
  17. Для целей стробирования и компенсации пятно клетками MCF-7 с анти CD24 PE-конъюгированных антител и запятнать клетки MDA-MB-231 с анти CD44 PerCP-Cy5.5 конъюгированных антител как позитивные элементы управления. Использование клетки окрашивали изотипа элементы управления как негативный контроль (рис. 1).
  18. Собрать клетки с CD44–/CD24+ маркеров в раунд дно из полистирола 12 x 75 мм пробирки, содержащие 1 мл коллекции среды (свободного фенола Красного RPMI 1640 средний дополнены 20% тепла инактивированная FBS и 2% v/v PS). Центрифуга для трубы на 300 x g и RT на 5 мин и удалить супернатант.
    Примечание: CSC-подобных клеток в клетки рака груди определяются как CD44+/CD24– клетки26,27,28,29,30и не стволовых клеток рака груди определяются как CD44–/CD24+ клетки18 (рис. 1).
  19. Пластина отсортированный груди не стволовых раковых клеток в культуры блюдо, содержащий свежие коллекции средством для дальнейшего культуры при 37 ° C в инкубатор культуры клеток 5% CO2 .

2. Apoptotic индукции и обнаружение

  1. Подготовка 1 мм staurosporine12,34 в ДМСО. Для обработки группы MCF-7 добавьте 25 мкл 1 мм staurosporine завершено среднего клетками MCF-7 сделать до 10 мл заключительного тома (2,5 мкм staurosporine) в 15 мл Конические трубки. Пипетка равномерно смешать содержимое.
  2. Удалите средство культуры из клеток, мыть клетки с 2 мл PBS раз. Затем добавьте 10 мл среды с 2,5 мкм staurosporine клетками MCF-7 для 6 h индуцировать апоптоз, когда плотность клеток достигает 70% confluency.
  3. Подготовка 1 мм паклитаксел35,36 в ДМСО. Для обработки группы T47D добавьте 12,5 мкл паклитаксел 1 мм завершено среднего T47D клеток, чтобы до окончательного объём 10 мл (5 мкм паклитаксел) в 15 мл Конические трубки. Пипетка равномерно смешать содержимое.
  4. Удалите средство культуры из клеток и мыть ячейки с 2 мл PBS раз. Затем добавьте 10 мл среды с 5 мкм паклитаксел в T47D клетки для 10 h, чтобы индуцировать апоптоз, когда плотность клеток достигает 70% confluency.
    Примечание: Время индукции и концентрация индукторов, которые индуцировать апоптоз должны быть оптимизированы, всякий раз, когда новая линия клеток используется в первый раз.
  5. Для группы растворителей лечение MCF-7 добавьте 25 мкл стерильных диметилсульфоксида (ДМСО) до завершения среднего клетками MCF-7 чтобы до окончательного объём 10 мл (т.е. 0,25% v/v ДМСО) в 15 мл Конические трубки. Пипетка равномерно смешать содержимое.
  6. Удаление питательной среды от растворителя лечение клетками MCF-7, мыть с 2 мл PBS один раз. Затем добавьте 10 мл среды с 0,25% v/v ДМСО для 6 h как растворитель управления для STS.
  7. Растворитель лечение T47D группы добавьте 5 мкл стерильных ДМСО завершено среднего T47D клеток, чтобы до 10 мл заключительного тома (т.е., 0,05% v/v ДМСО) в 15 мл Конические трубки. Пипетка равномерно смешать содержимое.
  8. Удалить питательной среды от растворителя обработанной T47D клеток, мыть с 2 мл PBS один раз. Затем добавьте 10 мл среды с 0,05% v/v ДМСО для 10 h как растворитель управления для паклитаксел.
  9. Наблюдать морфологические изменения обработанные клетки, запятнать клетки с 50 Нм Mitotracker красный CMXRos и 250 нг/мл Hoechst 33342 и инкубировать еще 20 минут при 37 ° C под атмосферу 5% CO2/95% воздуха. Соблюдайте типичный apoptotic клеток морфология под 60 x конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (рис. 2).
    Примечание: Типичный апоптоз морфология включает сжатие клеток, блеббинг мембраны, митохондрии фрагментации и ядерных конденсации, но с нетронутыми клеточной мембраны12,13,14,15 ,18,37.

3. изоляция Apoptotic клеток и апоптоз реверсирование процедуры

  1. Пятно apoptotic индуктор и растворитель пропитанная MCF-7 или T47D клетки с 3 мкм каспазы-3/7 зеленый обнаружения красителя на клетки концентрация 106/мл в темноте на 30 минут при 37 ° C под атмосферу 5% CO2/95% воздуха.
  2. Фильтр клетки через 40 мкм нейлоновая сетка перед запуском на сортировщик для сортировки.
  3. Для стробирования целей, сначала ворота основные демографические (R1) и исключить мусора путем построения графа в точках с вперед разброс и разброс стороны (рис. 3).
  4. Используйте необработанные клетки без добавления красителя каспазы-3/7 зеленый обнаружения как отрицательный контроль для ворот негативные региона (R2) (рис. 3A).
  5. Используйте клетки лечат staurosporine12,18,34 за 24 часа и витражи с красителем как позитивный элемент управления для ворот регионе позитивные (R3) (рис. 3B).
  6. Соберите положительные клетки (R3) от индуктором обработанных групп в раунд дно из полистирола 12 x 75 мм пробирки, содержащие 1 мл среды коллекции (так же как средство сбора на шаге 1.18) (рисунки 3C-3D). Центрифуга для трубы на 300 x g и RT на 5 мин и удалить супернатант.
  7. Соберите отрицательные клетки (R2) от растворителя лечение групп в раунд дно полистирола 12 × 75 мм трубы с 1 мл среды коллекции как шаг 3,6 (рисунки 3E-3F).
    Примечание: Небольшая часть клеток (например, 10 000 клеток) может собраны и повторно запустить на сортировщик проверить шаблон активной caspases маркера. Если более чем 90% клеток отсортированных растворителя лечение отображаются в регионе caspase отрицательных или более 90% клеток отсортированных индуктором лечение отображаются в регионе caspase позитивных, эти собранные клетки считаются относительно чистой (цифры 3 C-3F). В противном случае следует сбросить регионе сортировки или сортировки.
  8. Ресуспензируйте отсортированный клеток в среде свежие коллекции и семян их пластины 12-ну тканевые культуры и культуры при 37 ° C под атмосферу 5% CO2/95% воздуха для 7 дней для разворота апоптоз.

4. подтверждение апоптоз в активируется Каспаза клетки

  1. Смешайте 10 мм HEPES, 140 NaCl и 2,5 мм CaCl2 подготовить annexin привязки буфере (рН 7,4). Хранить буфера на 4 ° C и избежать буфер подвергать свет.
  2. Подготовка 100 мкг/мл рабочего раствора пропидий йодидом (PI) путем разбавления 5 мкл 1 мг/мл Стоковый раствор Пи в 45 мкл буфера annexin привязки. Хранят раствор при температуре 4 ° C и избежать решения подвергать свет.
    Примечание: PI является потенциальным мутагены и должны быть обработаны с осторожностью.
  3. Подготовьте индуктором лечение клетки как шаги 2.1-2.5.
  4. Соберите индуктором лечение MCF-7 или T47D клетки, закупорить среднего слоя клеток 3-5 x чтобы отсоединить клетки. Передать клетки 15 мл Конические трубки.
  5. Центрифуга для 300 x g и RT на 5 мин удалить супернатант.
  6. Ресуспензируйте клетки с завершенных среднего на клетки концентрация 106/мл в пробки microcentrifuge 1,5 мл и запятнать клетки с 3 мкм каспазы-3/7 обнаружения зеленый краситель в темноте за 30 мин при температуре 37 ° C.
  7. Центрифуга 300 x g и RT на 5 мин отбросить supernatants.
  8. Вымыть клетки с 1 мл ледяной PBS и центрифуги на 300 x g и 4 ° C за 5 мин отбросить supernatants.
  9. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл буфера annexin привязки с добавить 5 мкл конъюгата annexin V и 1 мкл 100 мкг/мл Пи рабочего раствора для каждого 100 мкл суспензии клеток и инкубации клеток для 15 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Annexin V и PI обычно используются совместно для ярлык apoptotic клетки в поток цитометрии38,,3940.
  10. Добавьте 400 мкл буфера annexin привязки, смесь осторожно. Храните образцы на льду перед запуском на проточный цитометр.

5. Измерение CSC-подобных клеток молочной железы подачей Cytometry

  1. Урожай в обращенном MCF-7 в обеих группах лечение индуктором или растворителя с 0,05% трипсина ЭДТА. Урожай T47D клетки в обеих группах лечение индуктором или растворителя или с 0,25% трипсина ЭДТА как шаги 1.2-1.5.
  2. Запятнать клетки с конъюгированных флюрохром моноклональные антитела против человека CD44 (PerCP-Cy5.5) и CD24 (PE) как в шаге 1.12. Тем временем Подготовьте изотипа контроля как шаг 1.13.
  3. Запустите на проточный цитометр клетки и определить процент клеток с CD44+/CD24– маркеров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того чтобы наблюдать переход от груди не стволовых клеток рака груди CSC-подобных клеток, первая сортировка CD44–/CD24+ клеток рака молочной железы были необходимы. Для линии клеток MCF-7, который около 0,15% клеток с CSC маркеров в оригинальной населения (рис. 1), этот шаг помог исключить возможность обогащения КБК во время вспять апоптоз. Напротив если там были никакие клетки с CSC маркеров в первоначального населения, такие, как для T47D клеток (рис. 1), эта процедура сортировки могут быть опущены. Действительно стробирование затрагивает определение положительных и отрицательных каждого маркера, который будет в конечном итоге влияние процент КБК определяется. Таким образом соответствующие элементы управления, включая элементы управления isotype антитела интерес, один окрашенных элементов управления для каждого маркера следует тщательно выбраны и подготовлен для перестройки ворот (рис. 1).

С груди Рак не стволовые клетки apoptosis модель разворота впоследствии может быть создан. Типичный морфологические изменения могут наблюдаться после добавления индукторов апоптоза и клетки должны оправиться от апоптоза с аналогичными морфологии после отмены препарата (рис. 2). Каспазы-3/7 признает аминокислотной последовательности DEVD каспазы-3/7 зеленый обнаружения красителем и активные формы каспазы-3/7 способны расщеплять этот сайт41. Первоначально флуоресценции обнаружения зеленый каспазы-3/7 красителя в цитозоле слаба, а если краситель расщепляется и перемещен в ядро, флуоресценции сигнал будет усилен после ее привязки к ДНК в ядре. Это очевидное различие можно отличить по проточной цитометрии. Следовательно эти клетки активируется Каспаза может помечены и сортируются по их выше флуоресценции интенсивности по сравнению с те, без активацию caspase (цифры 3A-3D). Во время процесса индукции апоптоза, соответствующего растворителя элемента управления должны быть включены: растворитель лечение клетки без активацию caspase были собраны (цифры 3E и 3F) исключить возможность того, что процедура СУИМ или растворитель, сам был причиной для перехода, если таковые имеются.

Для того, чтобы показать, что эти клетки активируется Каспаза СУИМ сортировка действительно были apoptotic, мы совместно витражи эти клетки с Annexin V и Пи. Одним из изменений ранней стадии в apoptotic клеток является транслокации Фосфатидилсерин с внутренней стороны мембраны плазмы на внешней поверхности клетки13,,3839,40; Эта экстернализация Фосфатидилсерин могут быть обнаружены Annexin V. Хотя это изменение не является уникальной для apoptosis, PI может использоваться для разграничения апоптоз от некроза на основе целостности клеточной мембраны. Таким образом клетки с привязкой Annexin V, но без окрашивания PI рассматриваются как apoptotic клетки. Активируется Каспаза клетки в группах лечения индуктором apoptotic были найдены Annexin V позитивные и Пи отрицательный, предполагая, что они были apoptotic клеток (рис. 4).

После того, как второй сортировки на основе активацию caspase apoptotic клеток, эти клетки apoptotic были собраны и впоследствии искусственного восстановления. Перевернутая клетки, которые были живы смогли прикрепить дно контейнера культуры и продолжать размножаться. После 7 дней окрашивание CD44 и CD24 была исполнена в обращенном клетки в то время как элементы управления были подготовлены в то же время, как раньше. По сравнению с растворителем лечение групп (рис. 1), поток гранулярных анализ показал, что события (клетки) в CD44+/CD24– квадранте в обращенном груди Рак не стволовых клеток населения (рис. 1) . Поскольку мы уже исключены клетки с CD44+/CD24– до начала индукции апоптоза и только CD44–/CD24+ груди не стволовых раковых клеток были выбраны, эти CD44+/CD24– CSC-подобных клеток может быть только транзитом от груди не стволовых раковых клеток во время вспять апоптоз.

Figure 1
Рисунок 1: Представитель груди CSC маркер пятна на груди раковые клетки в проточной цитометрии.
MCF-7, MDA-MB-231 и T47D окрашивали конъюгированных флюрохром моноклональные антитела против человека CD44 (PerCP-Cy5.5) и CD24 (PE). Клетки были впервые закрытого вперед точечной (FSC) и стороны точечной (СГБ) (P1), чтобы исключить мусора. Isotype элементов управления CD24 и CD44 были использованы как негативный контроль для CD24 и CD44 соответственно. Витражи с CD24 клетками MCF-7 был использован как позитивный элемент управления для CD24 и MDA-MB-231 клетки окрашивали CD44 использовался в качестве позитивного управления для CD44. Non стволовых MCF-7 клеток рака молочной железы (P2) были отсортированы. Эти отсортированных клетки и клетки T47D были подвергнуты апоптоз реверсирование процедуры. CSC-как (CD44+CD24–) клетки появилась после разворота апоптоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Морфологические изменения клеток рака молочной железы под стимулом индукции апоптоза.
Клеток рака молочной железы показал типичный apoptotic морфологические изменения, включая сжатие клеток, блеббинг мембраны, митохондрии фрагментации (Желтые стрелки в монохромный цифры) и ядерных конденсации. Ядер (в синем): ядер клеток окрашенных с Hoechst 33342 были показаны синим цветом. Митохондрии (в розовом): митохондрии клеток окрашенных с Mitotracker красный CMXRos были показаны в розовый цвет. Объединенные: фигуры объединены в двойной цвета, показывая митохондрии и ядер. Митохондрии (в серый): митохондрии клеток окрашенных с Mitotracker красный CMXRos были показаны в монохромном режиме. Дифференциальной помехи контраст (DIC): весь клетки. Верхняя: Клетками MCF-7 были относиться с staurosporine (СТС) для 6 h затем отменено за 24 ч. Нижняя: T47D клетки обрабатывали паклитаксел для 10 h с разворота на 24 ч. Шкала баров = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: анализ активацию Caspase сортировщик. (A) неокрашенных MCF-7 клеток без staurosporine (STS) лечения были использованы в качестве отрицательного контроля (R2). (B) клетками MCF-7 лечение с staurosporine (STS) клетки 24 часа в регионе R3 были сосчитаны как caspase активации клеток. (C) клетками MCF-7 лечение с staurosporine (STS) 6 h. клетки в регионе R3 были отсортированы СУИМ. (D) Сортировка СУИМ активируется Каспаза MCF-7 клеток после лечения staurosporine (СТС) для 6 h были повторно. (E) ДМСО лечение MCF-7 клеток. (F) СУИМ сортировка клеток без активацию caspase после лечения ДМСО 6 h были повторного выполнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Annexin V и PI пятнать caspase активации клеток в проточной цитометрии. MCF-7 и T47D клетки были сначала закрытого вперед точечной (FSC) и стороны точечной (СГБ) (P1), чтобы исключить мусора. Клетки, которые были необработанными индукторов апоптоза и без каких-либо окрашивание использовались как негативный контроль. Для клетки лечат индукторов апоптоза, были отобраны caspase активации клеток [т.е. зеленый каспазы-3/7 позитивные] (P3), чтобы показать интенсивности флуоресценции Annexin V и PI окрашивания. Все зеленые каспазы-3/7 позитивные клетки были Annexin V позитивные и PI отрицательный, предполагая, что они были apoptotic. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает прямой и ясный способ обнаружения перехода груди не стволовых раковых клеток в клетки груди CSC-как результате апоптоз разворота. Подтверждения CSC свойств этих обращенном клеток могут оказываться с помощью яn in vitro mammosphere формирования пробирного и в естественных условиях ксенотрансплантата трансплантации в иммунодефицитных мышей18,24,26 ,27,42,,4344,45. Здесь мы используем две линии клетки рака молочной железы, но этот протокол может применяться в других линий клеток рака молочной железы. Поскольку это явление проявляется в линии клеток рака молочной железы в которых меньше количество CD44+/CD24– клетки существуют изначально, предлагается, чтобы не выбирать клеточных линий, таких как MDA-MB-231, в которой есть более чем 90% CD44+ клетки.

Поскольку память имеет важное значение в анализе потоков, надлежащего и достаточного контроля должен быть подготовлен заранее. Для сортировки, чистоту должны также определяться перед фактической коллекции клеток. Например чтобы узнать чистоту первой сортировки, небольшая часть клеток (например, 10 000 клеток) может собраны и повторно запустить на сортировщике проверить шаблон CSC маркеров. Если более чем 90% из них отсортированы клетки являются CD44–/CD24+ и не показываются в CD44+/CD24– региона, собранных клетки считается относительно чистой (рис. 1). Если клетки появляются в CD44+/CD24– регионе, регионе сортировки или сортировщик должен быть переустановлен. Сортировка должна проводиться как стерильные, насколько это возможно, либо с помощью сортировщика внутри капота культуры или добавления антибиотиков в коллекции и питательной среды для сортировки клеток.

Типы клеток рака помимо рака молочной железы может быть выбран и индуцированных с различных раздражителей apoptotic создать модель разворота апоптоз. В то время как активацию caspase могут быть обнаружены 2 h в кратчайшие сроки, время сортировки следует тщательно отобраны. Поскольку клетки в населения не синхронизированы, одновременно конкретные точки, каждая ячейка может находятся на разных стадиях апоптоза. Тем временем держать происходит клетки apoptotic смерти после активацию caspase. Поэтому если индукторов удаляются только тогда, когда все клетки достичь активацию caspase, некоторые клетки могут уже достигли стадии фрагментацию ДНК, что делает их не удалось восстановить даже после удаления индуктором. Не предлагается индуцировать апоптоз слишком долго для достижения более высокий процент caspase активации клеток, но с ценой оставляя большое количество клеток, умирает после сбора. Кроме того время инкубации и концентрации красителя, этикетки активируется Каспаза клетки должны быть оптимизированы, всякий раз, когда новая линия клеток используется в первый раз.

Еще одна озабоченность по состоянию на успешно вызывая апоптоз разворота в apoptotic клеток является уровень низкий восстановления клеток (обычно менее 10%). Клетки прошли apoptosis плюс процедуре сортировки; Таким образом они требуют очень нежный обработки во время центрифугирования и передачи на этапах сбора и ресуспендирования. Кроме того выбор тарелку или блюдо для последующего культуры не должен быть зависимым на количество собранных клеток, но на ожидаемое количество возмещений. В противном случае клетки могут выделяться слишком редко вспять и вновь растут. Учитывая, что рак не стволовые клетки растут на более высокой скорости и могут доминировать в вновь созданной клеток населения46, время обнаружения от первого дня восстановления не должно быть слишком далеко.

Груди первый изолирует этот метод non стволовых клеток рака, то применяет их для индукции апоптоза где делается второй сортировки основанные на активацию caspase, прежде чем получить восстановить клетки. Ре-внешний вид груди CSC-подобных клеток в обращенном населения определяется проточной цитометрии. Поскольку процедура в vitro разворота апоптоз изолирует чисто апоптоза раковых клеток, ряд экспериментов теперь может проводиться понять последствия этих реальной обратный клеток. Помимо клеток рака молочной железы других типов твердых опухолей, а также гематологических злокачественных новообразований, что с известными CSC маркеры могут быть изучены и могут быть использованы различные apoptotic стимул. Следовательно этот метод является расширяемой и применимых к границе области рака расследования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана инновационных технологий фонд инноваций технологии Комиссии: финансирование поддержки от государства ключ лаборатории агробиотехнологию (CUHK), Ло слыша-Сонг биомедицинских исследований фонда и Фонда Хайсан Lee. Y.X. была поддержана аспирантуры от CUHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40 μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus -
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

Tags

Исследования рака выпуск 143 раковых стволовых клеток рак молочной железы апоптоз апоптоз разворота проточной цитометрии сортировки активирован флуоресценции клеток
Обнаружение потока гранулярных новообразованной груди Рак стволовых клеток как клеток после разворота апоптоз
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. … More

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal. J. Vis. Exp. (143), e58642, doi:10.3791/58642 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter