Summary
Hier presenteren we een protocol om te isoleren van apoptotic borstkankercellen door fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren en de overgang van niet-stam borstkankercellen aan stamcel-achtige borstkankercellen na apoptosis omkering verder kan worden opgespoord door stroom cytometry.
Abstract
Kanker terugkeerpatroon is lang bestudeerd door oncologists terwijl de onderliggende mechanismen zijn nog steeds onduidelijk. Onlangs, wij en anderen vond dat een verschijnsel genaamd apoptosis omkering tot verhoogde tumorigeniciteit in verschillende cel modellen onder verschillende prikkels leidt. Eerdere studies hebben gericht geweest op het bijhouden van dit proces in vitro en in vivo; het isolement van echte omgekeerde cellen moet echter nog worden bereikt, die onze kennis over de gevolgen van apoptosis omkering beperkt. Hier, profiteren we van een kleurstof Caspase-3/7 groen detectie op etiket cellen met geactiveerde caspases na apoptotic inductie. Cellen met positieve signalen zijn verder geregeld door fluorescentie-activated cell sorting (FACS) voor herstel. Morfologische onderzoek onder confocale microscopie bevestigt de apoptotic status vóór FACS. Een toename van de tumorigeniciteit kan vaak worden toegeschreven aan de stijging in het percentage van de cel van de stam van kanker (CSC)-als cellen. Ook, gezien de heterogeniteit van borstkanker, identificatie van de oorsprong van deze CSC-achtige cellen zou essentieel zijn voor de behandeling van kanker. Zo bereiden we niet-stam borstkankercellen voordat triggering apoptosis, caspase-geactiveerde cellen isoleren en uitvoeren van de procedure van de omkering apoptosis. Stroom cytometry analyse blijkt dat borst CSC-achtige cellen opnieuw in de omgekeerde groep verschijnen, die aangeeft borst CSC-achtige cellen zijn doortocht van niet-stam borstkankercellen tijdens apoptosis omkering. Kortom omvat dit protocol de isolatie van apoptotic borstkankercellen en detectie van veranderingen in CSC percentage in omgekeerde cellen door stroom cytometry.
Introduction
Kanker is een belangrijke doodsoorzaak, waardoor zware last aan landen wereldwijd1. Borstkanker rangen hoog zowel in termen van de incidentie en mortaliteit bij vrouwelijke patiënten onder alle soorten kanker1. Als gevolg van de heterogeniteit van de kanker, wordt een combinatie van drugs meestal gebruikt in chemotherapie om kanker cel dood2,3,4. Echter, aangezien gemeenschappelijke chemotherapeutische geneesmiddelen vaak richten op DNA5,6, eiwit synthese7,8 en/of microtubulus dynamiek,9, snelgroeiende cellen zijn het hardst getroffen terwijl zwakke cellen zoals kanker stamcel (CSC) s zijn meestal minder getroffen10. CSCs zijn, dus meer kans om te overleven na de behandeling, die later leidt tot resistentie tegen geneesmiddelen en kanker terugvalpreventie10,11. Vandaar, eliminatie van CSCs uitgegroeid tot een belangrijk onderwerp voor de behandeling van kanker en studie van de oorsprong van CSCs noodzakelijk is.
Meer studies over het fenomeen van apoptosis omkering zijn uitgevoerd in de afgelopen tien jaar12,13,14,15,16,17,18 , 19. vóór de opkomst van dit concept, het is algemeen aanvaard dat cellen apoptosis onherroepelijk zal ondergaan na activering van caspase. Caspases is een familie van eiwit-enzymen die spelen een sleutelrol in de inleiding en uitvoering stadia van apoptosis, met inbegrip van de vorming van de complexe apoptotic en de splitsing van downstream substraten20. Activering van de beul caspases zoals caspase-3 of caspase 7 heeft beschouwd als de "point of no return" voor apoptosis21. Onderzoekers onlangs merkte echter dat apoptosis terugboeking zowel in vitro plaatsvindt en in vivo, tijdens welke cellen van apoptosis zelfs na caspase activering12,13,14 herstellen kan , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Bovendien, agressieve eigenschappen zoals hogere weerstand tegen de oorspronkelijke apoptotic inductor en hogere invasiviteit worden gedetecteerd in de omgekeerde kanker cellen15. Derhalve werd voorgesteld dat het percentage van de CSC-achtige cellen hoger in de omgekeerde bevolking in vergelijking met de onbehandelde cellen, uiteindelijk bij te dragen tot de meer kwaadaardige functies na apoptosis omkering18zou zijn.
Eerder, vele inspanningen hebben gedaan om bij te houden van de apoptosis omkering in vitro en nog belangrijker, in vivo die enorm helpen bij de bevestiging van de universaliteit van dit proces16,17,19. Een systematische studie over de gevolgen van omgekeerde cellen ontbreekt echter als gevolg van de onbevredigende isolatie van cellen die werkelijk apoptosis omkering hebben ondergaan. Er is behoefte aan zuivere apoptotic cellen verwerven en herstellen hen voor verdere studie. Dus, we gebruiken de traditioneel goed aanvaarde markering van de beul caspase activering als de markering van de "point of no return"21 voor apoptosis en gebruik maken van de fluorescentie-activated cell sorting (FACS) om te discrimineren caspase-geactiveerde cellen gekleurd met Caspase-3/7 groen detectie kleurstof. De kleurstof is covalent gekoppeld aan een reeks van korte aminozuur, DEVD, die kan worden herkend en door actieve caspases 3/7 gekloofd. Het splijten helpt vrijlating van de kleurstof, die zal translocate van het cytosol aan de kern waar het zich bindt aan het DNA en stoot sterke fluorescentie. Deze procedure vermijdt met behulp van een bulk-celpopulatie waarin sommige cellen kunnen niet hebben ondergaan apoptosis.
CSCs of inleiding van de tumor cellen zijn geïdentificeerd in vele solide tumoren met een enkele of een combinatie van verschillende oppervlakte marker(s) en weinig nummers van deze cellen zijn voldoende om formulier tumoren in muizen immunodeficiëntie22,23,, 24,25,26,27. Een combinatie van CD44 en CD24 is vaak gebruikt in borst CSC studies en CD44+/CD24- cellen zijn gedefinieerd als de borst CSCs26,27,28,29 , 30. onlangs, wij hebben uitgevoerd een reeks experimenten om te bevestigen de voorgestelde relatie tussen apoptosis omkering en CSCs en aantonen dat omgekeerde borstkankercellen opgedaan meer tumor-vormende mogelijkheden in vitro en in vivo met een verhoogde percentage cellen met CSC markeringen18. Hoewel we niet uitsluiten kunnen dat borst CSCs beter overleven en dus na apoptosis omkering, vooral verrijkt krijgen wanneer we niet-stam kankercellen en onderwerp isoleren zal kunnen apoptosis omkering, CSC ontstaan in de oorspronkelijk niet-stam kanker-celpopulatie, suggereren dat niet-stam kanker cellen kunnen bijdragen tot de verhoging van het percentage van CSCs tijdens apoptosis omkering.
Dit artikel is bedoeld om aan te tonen van de overgang van niet-stam borstkankercellen naar borst CSC-achtige cellen na apoptosis omkering en deze overgang worden opgespoord door stroom cytometry. De borstkankercellen van niet-stam zijn aanvankelijk bereid door het isoleren van CD44-/CD24+ borstkanker kankercellen door FACS. Vervolgens is de apoptosis geïnduceerde en bevestigd door morfologische veranderingen onder de loep. Daarna zijn de apoptotic cellen positief gemerkt door Caspase-3/7 groen detectie kleurstof geïsoleerd door FACS en verder gekweekt in de afwezigheid van apoptotic inductoren voor apoptosis omkering. De omgekeerde cellen worden vervolgens gekleurd met CSC markeringen na 7 dagen van herstel voor flow cytometrische analyse. Cellen met CD44+/CD24- markeringen weer verschijnen in de omgekeerde bevolking, suggereren dat overgang van niet-stam kankercellen naar CSC-achtige cellen apoptosis omkering heeft geheerst.
Apoptosis omkering is waargenomen in meerdere kanker cellijnen evenals normale primaire cellen met verschillende apoptotic prikkels in vitro12,13behandeld. Dit proces is ook opgespoord in Drosophila model in vivo16,17,19. Veel informatie over het onderliggende mechanisme van kanker herval in verschillende kanker ziekte modellen en de oorsprong van CSCs kan worden verkregen door het gebruik van de techniek, zoals beschreven in dit manuscript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de borst niet-stam kankercellen
- Cultuur MCF-7 en MDA-MB-231 cellen in 10 mL van fenol rood-vrije Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) in een schotel van 100 mm. Cultuur T47D in 10 mL van fenol rood-vrije RPMI 1640 medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% warmte-geïnactiveerd FBS, en 1% v/v penicilline-streptomycine (PS) in een schotel van 100 mm. De cellen van de cultuur bij 37 ° C in een 5% CO2/95% lucht cel cultuur incubator.
Opmerking: Fenol-rood fluorescentie gebaseerde detectie beïnvloedt, maar heeft ook een potentiële invloed op de groei van borstkankercellen als gevolg van de oestrogeen-achtige effecten31. Fenol rood kan bijvoorbeeld progesteron receptor en groei van MCF-7 cellen31bevorderen. Het kan ook het stimuleren van de groei van T47D cellen31. - Wash cellen met 2 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal. Voeg 2 mL trypsine-EDTA 0,05% MCF-7 en MDA-MB-231 of 2 mL van 0,25% trypsine-EDTA naar T47D cellen.
Opmerking: De concentratie van trypsine-EDTA nodig voor scheiding van cellen onder verschillende borst kanker celtypes terwijl een ongepaste concentratie van invloed kan zijn op het expressiepatroon van sommige merkers cel oppervlak zoals CD44 en CD2432variëren. - Cultuur van de gerechten gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2/95% lucht. Het detachement van cellen onder de Microscoop om te voorkomen dat cellen van overmatige vertering door trypsine-EDTA regelmatig te controleren.
- Wanneer meer dan 90% cellen los, voeg 5 mL van voltooide RPMI medium aan de schotel en Pipetteer het over het celoppervlak laag meerdere malen.
- De cellen overbrengen in een conische tube van 15 mL en centrifugeer bij 300 x g en 4 ° C gedurende 5 min.
Opmerking: Meestal kunnen ongeveer 6 x 106 cellen worden verkregen van een schotel van 100 mm wanneer de confluentie 70% bedraagt. - Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets op 106 cellen/100 μl van FACS buffer (PBS met 0,5% BSA en 0,1% natriumazide) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
- Verdeel de cellen in de verschillende buizen. Voor MCF-7 cellen, de cellen te verdelen in 4 buizen: twee voor isotype controleert, één voor één CD24 kleuring als positieve controle van de CD24 en één voor dual kleuring.
- Voor T47D cellen, de cellen te splitsen in 3 buizen: twee voor isotype controles en een voor dual kleuring.
- Voor MDA-MB-231 cellen, de cellen te verdelen in 4 buizen: twee voor isotype controleert, één voor één CD44 kleuring als positieve controle van de CD44 en één voor dual kleuring.
- Centrifuge de buizen weer bij 300 x g - en 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en voeg vervolgens Fc blok verdund tot 1:50 in FACS buffer.
- Incubeer de monsters op ijs gedurende 20 minuten in het donker voor centrifugeren op 300 x g en 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
- Toevoegen van fluorescerende-geconjugeerde monoklonale antistoffen tegen menselijke CD44 (PerCP-Cy5.5) en CD24 (PE) op 1:40 en 1:10 verdunnen (in FACS buffer) in de duale kleuring groepen. Voor de positieve controles, het toevoegen van CD44 (PerCP-Cy5.5) aan MDA-MB-231 en CD24 (PE) naar MCF-7 cellen op dezelfde concentratie, respectievelijk toe te voegen.
Opmerking: De combinatie van CD44 en C24 is vaak gebruikt in borst CSC studie26,27,28,29,30. - Voor de controlegroepen isotype toevoegen PerCP-Cy5.5 muis IgG2b, κ op een 1:40 verdunning als het besturingselement isotype voor CD44 antilichamen en PE muis IgG2a, κ op een 1:10 verdunning als het besturingselement isotype voor CD24 antilichamen op 106 cellen/100 μl.
Opmerking: Isotype besturingselementen voor de antilichamen van belang worden aanbevolen als negatieve controles33. - Incubeer de monsters (uit stap 1.12 en 1.13) bij 4 ° C in het donker voor 30 min. Centrifuge 300 x g en 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
- De pellet tweemaal met 500 μL van PBS en centrifugeer bij 300 x g en 4 ° C gedurende 5 minuten wassen.
- Resuspendeer de pellet in 0,5 mL PBS en filteren door middel van een 40 µm nylon gaas voordat u op een cel fluorescentie-geactiveerde diasorteerderweergave.
- Behoeve van gating en compensatie, vlek MCF-7 cellen met anti-CD24 PE-geconjugeerde antilichamen en vlek MDA-MB-231 cellen met anti-CD44 PerCP-Cy5.5-geconjugeerde antilichamen als positieve controle. Gebruik cellen gekleurd met isotype besturingselementen als negatieve controles (Figuur 1).
- Verzamelen van cellen met CD44-/CD24+ markeringen in ronde onderkant polystyreen 12 x 75 mm buizen met 1 mL van collectie medium (fenol rood-vrije RPMI 1640 medium aangevuld met 20% warmte-geïnactiveerd FBS en 2% v/v PS). Centrifugeer de buizen bij 300 x g en RT gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
Opmerking: CSC-achtige cellen in borstkankercellen zijn gedefinieerd als CD44+/CD24- cellen26,27,28,29,30, en borst niet-stam kankercellen worden gedefinieerd als CD44-/CD24+ cellen18 (Figuur 1). - Plaat van de gesorteerde non-stam borstkankercellen in de cultuur-schotel met frisse collectie medium voor verdere cultuur bij 37 ° C in 5% CO2 cel cultuur incubator.
2. de Apoptotic inductie en detectie
- Bereiden 1 mM staurosporine12,34 in DMSO. Voor de behandelde groep MCF-7, voeg toe 25 μL van 1 mM staurosporine aan het voltooide medium MCF-7 cellen te maken tot 10 mL eindvolume (2,5 μM staurosporine) in een conische tube van 15 mL. Pipetteer te mengen de inhoud gelijkmatig.
- Verwijderen van het cultuurmedium van de cellen, cellen met 2 mL PBS keer wassen. Voeg vervolgens de 10 mL medium met 2,5 μM staurosporine naar MCF-7 cellen voor 6 h voor het opwekken van apoptosis wanneer celdichtheid 70% confluentie bereikt.
- Bereiden 1 mM paclitaxel35,36 in DMSO. Toevoegen voor de behandelde groep van de T47D, 12,5 μL van 1 mM paclitaxel op de voltooide normaal voor T47D cellen te halen tot een eindvolume van 10 mL (5 μM paclitaxel) in een conische tube van 15 mL. Pipetteer te mengen de inhoud gelijkmatig.
- Het cultuurmedium van de cellen verwijderen en de cellen met 2 mL PBS keer wassen. Voeg vervolgens de 10 mL medium met 5 μM paclitaxel naar de cellen van de T47D voor 10 h voor het opwekken van apoptosis wanneer celdichtheid confluentie van 70% bereikt.
Opmerking: De tijd van de inductie en de concentratie van de inductoren die apoptosis induceren moeten worden geoptimaliseerd, wanneer een nieuwe cellijn wordt gebruikt voor de eerste keer. - Voor de oplosmiddel-MCF-7 Testgroep, voeg 25 μL van steriele dimethylsulfoxide (DMSO) aan het voltooide medium MCF-7 cellen te halen tot een eindvolume van 10 mL (dat wil zeggen, 0,25% v/v DMSO) in een conische tube van 15 mL. Pipetteer te mengen de inhoud gelijkmatig.
- Verwijder het medium van de cultuur van het oplosmiddel behandeld MCF-7 cellen, wassen met eens 2 mL PBS. Voeg vervolgens de 10 mL medium met 0,25% v/v DMSO voor 6 h als het oplosmiddel besturingselement voor St.
- Toevoegen voor de oplosmiddel-T47D testgroep, 5 μL van steriele DMSO op de voltooide normaal voor T47D cellen te vul aan tot 10 mL eindvolume (dat wil zeggen, 0.05% v/v DMSO) in een conische tube van 15 mL. Pipetteer te mengen de inhoud gelijkmatig.
- Het kweekmedium uit de oplosmiddelen behandelde T47D cellen verwijderen, een keer wassen met 2 mL PBS. Dan, voeg de 10 mL medium met 0,05% v/v DMSO voor 10 h als het oplosmiddel besturingselement voor paclitaxel.
- Observeren van de morfologische veranderingen van de behandelde cellen, cellen met 50 vlek nM Mitotracker rode CMXRos en 250 ng/mL 33342, Hoechst en incubeer gedurende een ander 20 minuten bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2/95% lucht. Let op de typische apoptotic cel morfologie onder een 60 x confocale laser scanning microscoop (Figuur 2).
Opmerking: Typische apoptosis morfologie bevat cel krimp, membraan blebbing, mitochondriën fragmentatie en nucleaire condensatie maar met intact cellulaire membraan12,13,14,15 ,18,37.
3. isolatie van Apoptotic cellen en Apoptosis omkering Procedure
- Vlek zowel de apoptotic inductor - en oplosmiddel-testgroep MCF-7 of T47D cellen met 3 μM Caspase-3/7 groen detectie kleurstof bij de cel concentratie van 106/mL in het donker gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2/95% lucht.
- De cellen door een 40 µm nylon gaas filteren voordat u op de sorter voor het sorteren.
- Voor gating doeleinden, eerst de grote bevolking (R1) poort en uitsluiten van het puin door het uitzetten van het diagram in punten met voorwaarts scatter en kant scatter (Figuur 3).
- Gebruik de onbehandelde cellen zonder de Caspase-3/7 groen detectie kleurstof toe te voegen als een negatieve controle aan de poort van de negatieve regio (R2) (figuur 3A).
- Cellen met staurosporine12,18,34 gedurende 24 uur behandeld en gekleurd met de kleurstof als positieve controle worden gebruikt aan de poort van de positieve regio (R3) (figuur 3B).
- Verzamelen positieve cellen (R3) van de inductor-behandelde groepen in ronde onderkant polystyreen 12 x 75 mm buizen met 1 mL van collectie medium (hetzelfde als de collectie medium in stap 1.18) (figuren 3C-3D). Centrifugeer de buizen bij 300 x g en RT gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Negatieve cellen (R2) verzamelen van oplosmiddel-behandelde groepen in ronde onderkant polystyreen 12 × 75 mm buizen met 1 mL van collectie medium zoals in stap 3.6 (figuren 3E-3F).
Opmerking: Een klein deel van de cellen (zoals 10.000 cellen) kan worden verzameld en opnieuw uitvoeren op de sorter te controleren van het patroon van actieve caspases markering. Als meer dan 90% van de gesorteerde oplosmiddel-behandelde cellen worden weergegeven in de regio caspase-negatief of meer dan 90% van de gesorteerde inductor behandelde cellen worden weergegeven in de regio caspase-positieve, worden deze verzamelde cellen verondersteld om relatief zuiver (cijfers 3 C-3F). Anders moet de sorteer regio en/of de sorter worden gereset. - Resuspendeer de gesorteerde cellen in frisse collectie medium en zaad ze in 12-well weefselkweek platen en cultuur bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2/95% lucht voor 7 dagen voor apoptosis omkering.
4. bevestiging van Apoptosis in Caspase-geactiveerde cellen
- Mix 10 mM HEPES, 140 mM NaCl en 2,5 mM CaCl2 ter voorbereiding van Annexine-bindende buffer (pH 7.4). Bewaar de buffer bij 4 ° C en de buffer bloot aan het licht te vermijden.
- Bereid een 100 µg/mL werkoplossing van propidium jodide (PI) door verdunnen 5 µL van de 1 mg/mL stockoplossing van PI in 45 µL van Annexine-bindende buffer. Opslaan van de oplossing bij 4 ° C en de oplossing bloot aan het licht te vermijden.
Opmerking: PI is een potentiële mutagene stof en moet met zorg worden behandeld. - De inductor behandelde cellen zoals in stappen 2.1 tot en met 2.5 voor te bereiden.
- Verzamel de inductor behandeld MCF-7 of T47D cellen waarbij het medium over de cellaag 3-5 x als u wilt loskoppelen van de cellen. De cellen overbrengen in een conische tube van 15 mL.
- Centrifugeer bij 300 x g en RT voor 5 min. negeren het supernatant.
- Resuspendeer de cellen met voltooide medium op de concentratie van de cel van 106/mL in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en vlekken van cellen met 3 μM Caspase-3/7 detectie van de groene kleurstof in het donker gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Centrifugeer bij 300 x g en RT voor 5 min. negeren het supernatant.
- Spoel de cellen met 1 mL ijskoud PBS en centrifuge op 300 x g en 4 ° C gedurende 5 min. negeren het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 100 μl van Annexine-bindende buffer met de toevoegen 5 μL van de annexin V-geconjugeerde en 1 µL van 100 µg/mL werkoplossing aan elke 100 μl van de celsuspensie PI en Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Annexine V en PI worden vaak samen gebruikt om te etiketteren van apoptotic cellen in stroom cytometry38,39,40. - Voeg 400 µL van Annexine-bindende buffer, mix zachtjes. Houd de monsters op ijs voordat u op een cytometer van de stroom.
5. meting van de borst CSC-achtige cellen door Stroom Cytometry
- Oogst de omgekeerde MCF-7 in beide groepen inductor - of oplosmiddel-testgroep met 0,05% trypsine-EDTA. Oogst T47D cellen in beide groepen inductor - of oplosmiddel-testgroep of met 0,25% trypsine-EDTA zoals in stappen 1,2 tot 1,5.
- Vlekken van de cellen met fluorescerende-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen menselijke CD44 (PerCP-Cy5.5) en CD24 (PE) zoals in stap 1.12. Ondertussen bereiden de isotype besturingselementen zoals in stap 1.13.
- Draaien de cellen op een cytometer van de stroom en het percentage cellen met CD44 sporen+/CD24- -markeringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het observeren van de overgang van borst niet-stengel kankercellen te borst CSC-achtige cellen, een eerste sortering van CD44-/CD24+ borstkankercellen nodig waren. Voor de cellijn MCF-7, die ongeveer 0,15 procent cellen met CSC markeringen in de oorspronkelijke bevolking (Figuur 1), deze stap geholpen uitsluiten van de mogelijkheid van verrijking van de CSC tijdens apoptosis omkering. Integendeel, als er geen cellen met CSC markeringen in de oorspronkelijke bevolking, kon zoals voor T47D cellen (Figuur 1), deze sorteren procedure worden weggelaten. Inderdaad, gating beïnvloed de definitie van de positieve en negatieve van iedere markeerdraad, die uiteindelijk zou de invloed van het percentage van de CSC bepaald. Daarom, passende controles, inclusief isotype besturingselementen voor antilichamen van belang, één gebeitst besturingselementen voor elke hoofdstukmarkering moeten zorgvuldig gekozen en voorbereid op poort aanpassing (Figuur 1).
Met niet-stam borstkankercellen, kon het model van de omkering apoptosis daarna worden vastgesteld. Typische morfologische veranderingen kon worden waargenomen na het toevoegen van apoptotic inductoren en cellen moeten herstellen van apoptosis met soortgelijke morfologie na drug terugtrekking (Figuur 2). Caspase-3/7 herkent de volgorde van de aminozuur DEVD in de kleurstof Caspase-3/7 groen detectie en de actieve vormen van caspase-3/7 kunnen deze site41klieven. Oorspronkelijk is de fluorescentie van de kleurstof Caspase-3/7 groen detectie in cytosol zwak, terwijl als de kleurstof is gekloofd en translocated aan de kern, het fluorescentie-signaal worden na de binding met DNA in de celkern versterkt zou. Dit duidelijke verschil zich kunnen onderscheiden door stroom cytometry. Vandaar, kon die caspase-geactiveerde cellen worden geëtiketteerd en geregeld op basis van hun hogere fluorescentie intensiteit te vergelijken die zonder activering van caspase (cijfers 3A-3D). Tijdens de inductie apoptotic een passende oplosmiddelen controlemaatregelen moet worden opgenomen: oplosmiddel-behandelde cellen zonder activering van caspase werden verzameld (cijfers 3E en 3F) uit te sluiten van de mogelijkheid dat de FACS procedure of het oplosmiddel zelf was de oorzaak voor de overgang, indien van toepassing.
Om aan te tonen dat die FACS-gesorteerd caspase-geactiveerde cellen inderdaad apoptotic waren, gekleurd we samen deze cellen met Annexine V en PI. Één van de beginnende veranderingen in apoptotic cellen is de translocatie van fosfatidylserine van de binnenzijde van het plasma membraan op de buitenkant van de cel13,38,39,40; Deze externalization van fosfatidylserine kon worden opgespoord door Annexine V. Hoewel deze wijziging niet uniek voor apoptosis is, kan PI worden gebruikt voor het onderscheiden van apoptosis van necrose op basis van de integriteit van de celmembraan. Zo worden cellen met Annexine V binding maar zonder PI kleuring beschouwd als apoptotic cellen. Caspase-geactiveerde cellen in de apoptotic inductor behandelgroepen bleken te worden Annexine V positieve en PI negatief, wat suggereert dat zij apoptotic cellen (Figuur 4 waren).
Nadat de tweede sortering op basis van de activering van caspase in apoptotic cellen, werden deze apoptotic cellen verzameld en vervolgens gekweekt voor herstel. De omgekeerde cellen die leefden waren in staat om de onderkant van de container cultuur hechten en coffeeshops. Na 7 dagen, werd verkleuring van de CD44 en CD24 uitgevoerd in de omgekeerde cellen terwijl besturingselementen werden voorbereid op hetzelfde moment als vóór. Vergeleken met het oplosmiddel-behandelde groepen (Figuur 1), flow cytometrische analyse bleek dat er gebeurtenissen (cellen) verschijnen in de CD44+/CD24- Kwadrant in de omgekeerde borst kanker voor niet-stam-celpopulatie (Figuur 1) . Aangezien wij reeds had uitgesloten cellen met CD44+/CD24- vooruitlopend apoptose inductie en alleen CD44-/CD24+ niet-stam borstkankercellen werden gekozen, deze CD44+/CD24- CSC-achtige cellen kunnen alleen worden doortocht van niet-stam borstkankercellen tijdens apoptosis omkering.
Figuur 1: Vertegenwoordiger borst CSC marker kleuring op borstkankercellen in stroom cytometry.
MCF-7, MDA-MB-231 en T47D werden gekleurd met fluorescerende-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen menselijke CD44 (PerCP-Cy5.5) en CD24 (PE). Cellen werden eerst omheinde door voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) (P1) uit te sluiten van puin. Isotype controles van CD24 en CD44 werden gebruikt als negatieve controles voor CD24 en CD44 respectievelijk. MCF-7 cellen gekleurd met CD24 werd gebruikt als positieve controle voor CD24 en MDA-MB-231 cellen gekleurd met CD44 werd gebruikt als positieve controle voor CD44. Non-stam MCF-7 borstkankercellen (P2) wordt gesorteerd. Deze gesorteerde cellen en T47D cellen werden onderworpen aan apoptosis omkering procedure. CSC-achtige (CD44+CD24-) cellen verscheen na apoptosis omkering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Morfologische veranderingen van borstkankercellen onder apoptotic stimulans inductie.
Borstkankercellen toonde typische apoptotic morfologische veranderingen, met inbegrip van cel krimp, membraan blebbing, mitochondriën fragmentatie (gele pijlen in de monochrome cijfers) en nucleaire condensatie. Kernen (in blauw): kernen van cellen gekleurd met Hoechst 33342 werden getoond in blauwe kleur. Mitochondriën (in p! NK): mitochondria van cellen gekleurd met Mitotracker rode CMXRos werden vertoond in roze kleur. Samengevoegde: cijfers samengevoegd in dubbele kleuren tonen zowel de mitochondriën en de kernen. Mitochondriën (in grijs): mitochondria van cellen gekleurd met Mitotracker rode CMXRos werden getoond in zwart-wit. Differentiële interferentie Contrast (DIC): hele cellen. Bovenste: MCF-7 cellen werden behandeld met staurosporine (STS) voor 6 h dan omgekeerd voor 24 h. lager: T47D cellen werden behandeld met paclitaxel voor 10u met omkering voor 24 h. schaal bars = 20 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Caspase activering analyse door sorter. (A) onbevlekt MCF-7 cellen zonder staurosporine (STS) behandeling werden gebruikt als negatieve controle (R2). (B) MCF-7 cellen behandeld met staurosporine (STS) voor 24 h. cellen in R3 gebied werden beschouwd als de cellen caspase-geactiveerd. (C) MCF-7 cellen behandeld met staurosporine (STS) voor 6 h. cellen in R3 gebied FACS-gesorteerd waren. (D) FACS-gesorteerd caspase-geactiveerde MCF-7 cellen na staurosporine (STS) behandeling van 6 h waren opnieuw uitvoeren. (E) DMSO-behandelde MCF-7 cellen. (F) FACS-gesorteerd op cellen zonder activering van caspase na DMSO behandeling voor 6 h waren opnieuw uitvoeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Annexine V en PI kleuring van caspase-geactiveerde cellen in stroom cytometry. MCF-7 en T47D cellen waren ten eerste gated door voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) (P1) uit te sluiten van puin. Cellen die onbehandelde met apoptotic inductoren en zonder enige kleuring waren werden gebruikt als negatieve controles. Voor cellen met apoptotic inductoren behandeld, caspase-geactiveerde cellen [dat wil zeggen, Caspase-3/7 groen positieve cellen] werden geselecteerd (P3) te tonen van de intensiteit van de fluorescentie van Annexin V en PI kleuring. Alle Caspase-3/7 groen positieve cellen waren Annexine V positief en PI negatief, wat suggereert dat zij apoptotic waren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een directe en duidelijke manier voor het opsporen van de overgang van niet-stam borstkankercellen in borst CSC-achtige cellen ten gevolge van apoptosis omkering. Bevestiging van de CSC-eigenschappen van deze omgekeerde cellen kan worden bijgestaan door ikn vitro mammosphere formatie assay en in vivo xenograft transplantatie in immunodeficiëntie muizen18,24,26 ,27,42,43,44,45. Hier gebruiken we twee borst kanker cellijnen, maar dit protocol kan verder worden toegepast in andere cellijnen van borst kanker. Aangezien dit verschijnsel herkenbaar in de borst kanker cellijn in welke minder aantal CD44 is+/CD24- cellen zijn oorspronkelijk, wordt voorgesteld niet te kiezen cellijnen zoals MDA-MB-231 waarin er meer dan 90% van de CD44 zijn+ cellen.
Aangezien gating belangrijk in flow analyse is, moeten goede en voldoende controles worden voorbereid. Voor het sorteren, moet de zuiverheid ook worden bepaald voordat de feitelijke verzameling cellen. Bijvoorbeeld, om te weten de zuiverheid van de eerste sortering, kan een klein deel van de cellen (zoals 10.000 cellen) worden verzameld en opnieuw uitvoeren op de sorter te controleren van het patroon van CSC markers. Als meer dan 90% van deze gesorteerd cellen zijn CD44-/CD24+ en worden niet weergegeven in de CD44+/CD24- -regio, de verzamelde cellen worden verondersteld te zijn relatief zuiver (Figuur 1). Als cellen worden weergegeven in de CD44+/CD24- -regio, de sorteer regio en/of de sorter moet worden gereset. Sorteren moet plaatsvinden zo steriel mogelijk door met behulp van een sorter binnen cultuur kap of het toevoegen van antibiotica bij het verzamelen en de voedingsbodem voor gesorteerde cellen.
Soorten van kanker cellen dan borstkanker kunnen ook worden gekozen en geïnduceerde verschillende apoptotic prikkels om de apoptosis omkering model. Terwijl activering van caspase kon zo spoedig 2 h worden opgespoord, moet de sorteer keer zorgvuldig worden geselecteerd. Aangezien cellen in de bevolking niet zijn gesynchroniseerd, wijzen op één bepaald tijdstip, elke cel bereikt verschillende stadia van apoptosis kan hebben. Ondertussen, cellen blijven gaan op een apoptotic dood na activering van caspase. Daarom, als de inductoren zijn verwijderd alleen wanneer alle cellen caspase-activering bereiken, sommige cellen bereikt kunnen hebben al de fase van de fragmentatie van DNA, waardoor ze niet in staat om te herstellen, zelfs na de verwijdering van de inductor. Er wordt niet voorgesteld om het induceren van apoptose te lang om een hoger percentage van caspase-geactiveerde cellen maar met de kosten van het verlaten van een groot aantal cellen sterven na collectie. Bovendien, de incubatietijd en de concentratie van de kleurstof die caspase-geactiveerde cellen etiketten moeten worden geoptimaliseerd wanneer een nieuwe cellijn wordt gebruikt voor de eerste keer.
Een andere zorg vanaf succesvol inducerende apoptosis omkering in de apoptotic cellen is de lage opbrengst van de cellen (meestal minder dan 10%). De cellen zijn gegaan via apoptosis plus de sorteer procedure; dus vereisen ze zeer zachte behandeling tijdens centrifugeren en overdracht op de collectie en resuspensie stappen. Ook moet de keuze voor de bord of schotel gebruikt voor latere cultuur niet afhankelijk van het aantal cellen verzameld, maar op het verwachte aantal terugvorderingen. Anders kunnen cellen te dun worden uitgetrokken om te keren en opnieuw groeien. Gezien dat niet-stam kanker cellen groeien met een hogere snelheid en kunnen domineren in de gereconstitueerd cel bevolking46, mag de detectie tijd niet te ver weg vanaf de eerste hersteldag.
Deze methode eerste isolaten borst niet-stam kankercel dan ze geldt voor de apoptotic inductie waar een tweede sortering gebeurt op basis van activering van caspase voordat cellen krijgen hersteld. Het re-uiterlijk van borst CSC-achtige cellen in de omgekeerde bevolking wordt gedetecteerd door stroom cytometry. Aangezien deze in vitro apoptosis omkering procedure pure apoptotic kankercellen isoleert, kan een aantal experimenten nu om te begrijpen de gevolgen van deze echte omgekeerde cellen worden uitgevoerd. Afgezien van borstkankercellen, andere solide tumor type evenals hematologic maligniteit die met bekende CSC markeringen kan worden bestudeerd en verschillende apoptotic stimulans kan worden gebruikt. Vandaar dat deze methode is uitbreidbaar en toepasbaar is in de reikwijdte van een grens van kanker onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de innovatieve technologie Fonds voor innovatie technologie Commissie: financiering steun van de staat sleutel laboratorium voor Agrobiotechnology (CUHK), het Lo Kwee-Seong biomedisch onderzoeksfonds en de Lee Hysan Foundation. Y.X. werd gesteund door de postdoctorale studententijd van de CUHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40 μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | - | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
References
- McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
- Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
- Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
- Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
- Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
- Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
- Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
- Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C.
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
- Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
- Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
- Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Li, J., Yuan, J.
- Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
- Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
- Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C.
- Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
- Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
- Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
- Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
- Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
- Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
- Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).
