Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Flöde flödescytometrisk påvisa nybildade Stem Cell-liknande bröstcancerceller efter apoptos återföring

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera apoptotiska bröstcancerceller genom fluorescens-aktiverad cell sortering och ytterligare upptäcka övergången av bröstcancerceller att stamceller-liknande bröstcancerceller icke-stammen efter apoptos återföring av flödescytometri.

Abstract

Återfall har länge studerats av onkologer medan de bakomliggande mekanismerna är oklara. Nyligen hittade vi och andra som ett fenomen som heter apoptos återföring leder till ökad tumorigenicitetsprov i olika cellmodeller under olika stimuli. Tidigare studier har fokuserat på spåra denna process in vitro- och in vivo; isolering av verkligt omvända celler har dock ännu ska uppnås, vilket begränsar vår förståelse om konsekvenserna av apoptos återföring. Här, utnyttja vi kaspas-3/7 grön Detection färgämne till etikett celler med aktiverade kaspaserna efter apoptotiska induktion. Celler med positiva signaler sorteras ytterligare av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) för återställning. Morfologisk undersökning under konfokalmikroskopi hjälper till att bekräfta apoptotiska status innan FACS. En ökning av tumorigenicitetsprov kan ofta härledas till höjden procentandel av cancer stamceller (CSC)-som celler. Dessutom skulle ges heterogenitet av bröstcancer, att identifiera ursprunget av dessa CSC-liknande celler vara kritiska cancerbehandling. Således förbereda vi bröstcancerceller för icke-stammen innan utlöser apoptos, isolera kaspas-aktiverade celler och utföra apoptos återföring procedur. Flödescytometri Flödesanalys avslöjar att bröst CSC-liknande celler visas igen i gruppen omvända indikerar bröst CSC-liknande celler är transiterat från icke-stammen bröstcancerceller under apoptos återföring. Sammanfattningsvis innehåller detta protokoll isolering av apoptotiska bröstcancerceller och upptäckt av förändringar i CSC procentsats i omvänd celler av flödescytometri.

Introduction

Cancer har varit en ledande dödsorsak, orsakar tung börda till länder i hela världen1. Bröstcancer rankas högt både när det gäller incidens och dödlighet hos kvinnliga patienter bland alla typer av cancer1. På grund av cancer heterogenitet används vanligtvis en kombination av läkemedel för kemoterapi för att uppnå cancer cell death2,3,4. Eftersom vanliga cellgifter rikta ofta DNA5,6, påverkade proteinsyntes7,8 eller mikrotubulära dynamics9, snabbt växande celler är dock mest medan quiescent celler såsom cancer stamceller (CSC) s är oftast mindre drabbade10. CSCs är därför mer benägna att överleva efter behandlingen, som senare leder till läkemedelsresistens och cancer återfall10,11. Därför, eliminering av CSCs har blivit ett viktigt ämne för cancerbehandling och studie av CSCs ursprung är nödvändigt.

Fler studier på fenomenet apoptos återföring har utförts i det senaste decenniet12,13,14,15,16,17,18 , 19. före uppkomsten av detta begrepp, det har varit allmänt accepterat att celler oåterkalleligt kommer att genomgå apoptos efter kaspas aktivering. Kaspaserna är en familj av protein enzymer som spelar viktiga roller i de inledande och utförande stadierna av apoptos, inklusive bildandet av den komplexa apoptotiska och klyvning av nedströms substrat20. Aktivering av bödeln kaspaserna såsom kaspas 3 eller kaspas 7 har betraktats som den ”point of no return” för apoptos21. Dock konstaterats forskare nyligen att apoptos återföring sker både in vitro- och in vivo, under vilka celler kan återhämta sig från apoptos även efter kaspas aktiveringen12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Dessutom aggressiva funktioner såsom högre motstånd mot ursprungliga apoptotiska inducerare och högre invasivitet upptäcks i omvänd cancer cells15. Det föreslogs därför att procentandelen av CSC-liknande celler skulle vara högre i den omvända befolkningen jämfört med obehandlade cellerna, så småningom bidrar till mer maligna funktioner efter apoptos återföring18.

Tidigare, många ansträngningar har gjorts att spåra apoptos återföring och viktigare, in vivo som kraftigt bidra till bekräftar denna process16,17,19universalitet. Dock saknas en systemisk studie om konsekvenserna av omvänd celler på grund av den otillfredsställande isoleringen av celler som har verkligen genomgått apoptos återföring. Det finns ett behov av att förvärva pure apoptotiska celler och återställa dem för vidare studier. Således använder vi den traditionellt väl accepterade markören för bödeln kaspas aktivering som markeringen av ”point of no return”21 för apoptos och utnyttja fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) att diskriminera kaspas-aktiverade celler målat med kaspas-3/7 grön Detection färgämne. Färgen är kovalent kopplad till en kort aminosyrasekvens, DEVD, som kan identifieras och klyvs av aktiva kaspaserna 3/7. Klyvning hjälper släppa färgämnet, som kommer translocate från cytosolen till kärnan där det binder till DNA och avger stark fluorescens. Detta förfarande undviks med hjälp av en bulk cell befolkningen i vilken vissa celler inte kan ha genomgått apoptos.

CSCs eller tumör-inleda celler har identifierats i många solida tumörer med hjälp av en enda eller en kombination av flera ytan marker(s) och mycket få siffror av dessa celler är tillräckliga för att bilda tumörer i nedsatt immunförsvar möss22,23, 24,25,26,27. En kombination av CD44 och CD24 har vanligen använts i bröstet CSC studier och CD44+/CD24– celler har definierats som bröstet CSCs26,27,28,29 , 30. nyligen, vi har utfört en serie experiment för att bekräfta det föreslagna förhållandet mellan apoptos återföring och CSCs och demonstrera att omvända bröstcancerceller fick ökad tumör-bilda förmåga in vitro- och in vivo med en förhöjd procentandelen celler med CSC markörer18. Även om vi inte kunde utesluta möjligheten att bröst CSCs överleva bättre och därmed få berikad efter apoptos återföring, ännu viktigare, när vi isolerar icke-stammen cancerceller och ämne dem till apoptos omsvängning, CSC kommer att dyka upp i ursprungligen icke-stammen cancer cell befolkningen, tyder på att icke-stammen cancer celler kan bidra till ökningen av procentandelen av CSCs under apoptos återföring.

Denna artikel syftar till att demonstrera övergången från icke-stammen bröstcancerceller till bröst CSC-liknande celler efter apoptos återföring och upptäcka denna övergång av flödescytometri. De bröstcancer cellerna icke-stammen är initialt beredda genom att isolera CD44–/CD24+ breast cancerceller av FACS. Sedan är apoptos induceras och bekräftas av morfologiska förändringar under mikroskopet. Efteråt, apoptotiska celler positivt-märkt av kaspas 3/7 grön upptäckt dye har isolerats av FACS och ytterligare odlade i avsaknad av apoptotiska inducerare för apoptos återföring. Återförda cellerna färgas sedan med CSC markörer efter 7 dagars återhämtning för flöde flödescytometrisk analys. Celler med CD44+/CD24– markörer visas igen i den omvända befolkningen, vilket tyder på att övergången från icke-stammen cancerceller till CSC-liknande celler har inträffat under apoptos återföring.

Apoptos återföring har observerats i flera cancer cell linjer samt normal primära celler behandlas med olika apoptotiska stimuli i vitro12,13. Denna process har också spårats i Drosophila modell i vivo16,17,19. Mycket information om den underliggande mekanismen av cancer återfall i olika cancer sjukdomsmodeller och ursprunget till CSCs kan erhållas genom användning av tekniken som beskrivs i detta manuskript.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av bröst icke-stammen cancerceller

  1. Kultur MCF-7 och MDA-MB-231 celler i 10 mL fenol red-gratis Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) i en 100 mm maträtt. Kultur T47D i 10 mL av phenol red-gratis RPMI 1640 medium kompletteras med 2 mM L-glutamin, 10% Värmeinaktiverade FBS, och 1% v/v Penicillin-Streptomycin (PS) i en 100 mm maträtt. Kultur celler vid 37 ° C i en 5% CO2/95% luft cell kultur inkubator.
    Obs: Fenol-röd påverkar fluorescens-baserad detektion men har också en potentiell påverkan på tillväxten av bröstcancerceller på grund av dess östrogenliknande effekter31. Till exempel kunde fenolrött stimulera progesteronreceptorn och tillväxt av MCF-7 celler31. Det kan också stimulera tillväxten av T47D celler31.
  2. Tvätta cellerna med 2 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS) två gånger. Tillsätt 2 mL 0,05% trypsin-EDTA till MCF-7 och MDA-MB-231 eller 2 mL av 0,25% trypsin-EDTA till T47D celler.
    Obs: Koncentrationen av trypsin-EDTA behövs för separation av celler bland olika bröst cancer celltyper varierar medan en olämplig koncentration kan påverka uttrycksmönstret av vissa cell yta markörer såsom CD44 och CD2432.
  3. Kultur rätter för 5 min vid 37 ° C under en atmosfär av 5% CO2/95% luft. Regelbundet kontrollera avskildheten av celler under lupp att förhindra celler från över rötning av trypsin-EDTA.
  4. När över 90% celler lossa, tillsätt 5 mL av slutförda RPMI medium till skålen och Pipettera det över cell lager ytan flera gånger.
  5. Överföra cellerna till en 15 mL koniska rör och centrifugera vid 300 x g och 4 ° C i 5 min.
    Obs: Vanligtvis kan runt 6 x 106 celler erhållas från en 100 mm maträtt när konfluens når 70%.
  6. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pellets på 106 celler/100 μL av FACS buffert (PBS som innehåller 0,5% BSA och 0,1% natriumazid) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
  7. Dela celler i flera rör. För MCF-7 celler, dela upp cellerna i 4 rör: två för isotypen kontroller, en för CD24 enda färgning som CD24 positiv kontroll och en för dubbla färgning.
  8. För T47D celler, dela upp cellerna i 3 rör: två för isotypen kontroller och en för dubbla färgning.
  9. För MDA-MB-231 celler, dela upp cellerna i 4 rör: två för isotypen kontroller, en för CD44 enda färgning som CD44 positiv kontroll och en för dubbla färgning.
  10. Centrifugera rören igen vid 300 x g - och 4 ° C i 5 min. avlägsna supernatanten och Lägg sedan till Fc block utspädd 1:50 i FACS buffert.
  11. Inkubera proverna på is i 20 min i mörkret innan centrifugering vid 300 x g och 4 ° C i 5 min. Tag bort supernatanten.
  12. Lägg till fluorokrom-konjugerad monoklonal antikroppar mot mänskliga CD44 (PerCP-Cy5.5) och CD24 (PE) på 1:40 och 1:10 utspädningar (i FACS buffert) i dual färgning grupper. För positiva kontroller, lägga till CD44 (PerCP-Cy5.5) till MDA-MB-231 och lägga till CD24 (PE) i MCF-7 celler på samma koncentration, respektive.
    Obs: Kombinationen av CD44 och C24 har vanligen använts i bröstet CSC studie26,27,28,29,30.
  13. Lägg till PerCP-Cy5.5 mus IgG2b, κ vid en 1:40 för isotypen kontrollgrupperna, utspädning som isotypen kontroll för CD44 antikroppar och PE mus IgG2a, κ på en 1:10 utspädning som isotypen kontroll för CD24 antikroppar på 106 celler/100 μL.
    Obs: Isotypen kontroller för antikropparna i intresse rekommenderas som negativa kontroller33.
  14. Inkubera proverna (från steg 1.12 och 1.13) vid 4 ° C i mörker för 30 min. Centrifugera vid 300 x g och 4 ° C i 5 min. Tag bort supernatanten.
  15. Tvätta pelleten två gånger med 500 μL av PBS och centrifugera vid 300 x g och 4 ° C i 5 min.
  16. Återsuspendera pelleten i 0,5 mL PBS och filtrera genom en 40 µm nylon mesh innan du kör på en fluorescens-aktiverad cell sorterare.
  17. För gating och ersättning, fläcken MCF-7 celler med PE-konjugerad anti-CD24 antikroppar och fläcken MDA-MB-231 celler med PerCP-Cy5.5-konjugerad anti-CD44 antikroppar som positiva kontroller. Använda celler fläckade isotypen kontroller som negativa kontroller (figur 1).
  18. Samla in celler med CD44–/CD24+ markörer i runda-botten polystyren 12 x 75 mm rör som innehåller 1 mL av samling medium (fenolrött-fri RPMI 1640 medium kompletteras med 20% Värmeinaktiverade FBS och 2% v/v PS). Centrifugera rören på 300 x g och RT för 5 min och kasta bort supernatanten.
    Obs: CSC-liknande celler i bröstcancerceller definieras som CD44+/CD24– celler26,27,28,29,30, och bröst icke-stammen cancerceller definieras som CD44–/CD24+ celler18 (figur 1).
  19. Tallrik i sorterade bröstcancer icke-stam celler i kultur skålen som innehåller färsk samling medium för ytterligare kultur vid 37 ° C i 5% CO2 cell kultur inkubator.

2. apoptotiska induktion och upptäckt

  1. Laga 1 mM staurosporine12,34 i DMSO. Tillsätt 25 μL i 1 mM staurosporine avslutade medlet av MCF-7 celler för att göra upp till 10 mL slutlig volym (2,5 μM staurosporine) i en 15 mL koniska rör för gruppen behandlade MCF-7. Överför med pipett för att blanda innehållet jämnt.
  2. Ta bort odlingssubstratet från cellerna, tvätta cellerna med 2 mL PBS en gång. Lägg sedan till 10 mL medium med 2,5 μM staurosporine till MCF-7 celler för 6 h att inducera apoptos när cell densiteten når 70% konfluens.
  3. Laga 1 mM paklitaxel35,36 i DMSO. För gruppen behandlade T47D tillsätt 12,5 μl 1 mM paklitaxel till färdiga medlet av T47D celler gör upp till en slutlig volym av 10 mL (5 μM paklitaxel) i en 15 mL koniska rör. Överför med pipett för att blanda innehållet jämnt.
  4. Ta bort odlingssubstratet från cellerna och tvätta cellerna med 2 mL PBS en gång. Lägg sedan till 10 mL medium med 5 μM paklitaxel till T47D celler för 10 h att inducera apoptos när cell densiteten når 70% konfluens.
    Obs: Induktionstiden och koncentrationen av de inducerare som inducerar apoptos bör optimeras varje gång en ny cellinje används för första gången.
  5. För gruppen behandlade med lösningsmedel MCF-7 tillsätt 25 μL i sterila dimetyl sulfoxid (DMSO) avslutade medlet av MCF-7 celler gör upp till en slutlig volym av 10 mL (dvs 0,25% v/v DMSO) i en 15 mL koniska rör. Överför med pipett för att blanda innehållet jämnt.
  6. Ta bort odlingssubstratet från lösningsmedlet behandlades MCF-7 celler, tvätta med 2 mL PBS en gång. Lägg sedan till 10 mL medium med 0,25% v/v DMSO för 6 h som lösningsmedel kontroll för STS.
  7. Tillsätt 5 μL i sterila DMSO avslutade medlet av T47D celler gör upp till 10 mL slutlig volym (dvs. 0,05% v/v DMSO) i en 15 mL koniska rör för gruppen lösningsmedel-behandlade T47D. Överför med pipett för att blanda innehållet jämnt.
  8. Ta bort odlingssubstratet från lösningsmedel behandlade T47D celler, tvätta med 2 mL PBS en gång. Lägg sedan till medium med 0,05% v/v DMSO för 10 h 10 mL som lösningsmedel kontroll för paklitaxel.
  9. Att iaktta de morfologiska förändringarna av behandlade cellerna, fläckar celler med 50 nM Mitotracker röda CMXRos och 250 ng/mL Hoechst 33342, och inkubera i en annan 20 min vid 37 ° C under en atmosfär av 5% CO2/95% luft. Observera den typiska apoptotiska cellmorfologi under en 60 x confocal laserscanning Mikroskop (figur 2).
    Obs: Typiska apoptos morfologi innehåller cell krympning, membran blebbing, mitokondrierna fragmentering och nukleär kondensation men med intakt cellulära membran12,13,14,15 ,18,37.

3. isolering av apoptotiska celler och apoptos återföring förfarande

  1. Fläcken både apoptotiska inducerare och lösningsmedel-behandlades MCF-7 eller T47D celler med 3 μM kaspas-3/7 grön Detection färgämne cell koncentration 106/ml i mörkret under 30 minuter vid 37 ° C under en atmosfär av 5% CO2/95% luft.
  2. Filtrera cellerna genom en 40 µm nylon mesh innan du kör på Sorteraren för sortering.
  3. För gating ändamål, första utfärda utegångsförbud för den stora befolkningen (R1) och utesluta skräp genom att rita diagrammet i prickar med framåt scatter och side scatter (figur 3).
  4. Använda obehandlad cellerna utan att lägga till kaspas-3/7 grön Detection färgämnet som en negativ kontroll till gate regionen negativa (R2) (figur 3A).
  5. Använda celler behandlas med staurosporine12,18,34 för 24 h och färgas med färgämnet som positiv kontroll för att utfärda utegångsförbud för regionen positiv (R3) (figur 3B).
  6. Samla positiva celler (R3) från inducerare-behandlade grupperna i runda-botten polystyren 12 x 75 mm rör innehållande 1 mL samling medium (samma som samling medium i steg 1,18) (figur 3C-3D). Centrifugera rören på 300 x g och RT för 5 min och kasta bort supernatanten.
  7. Samla in negativa celler (R2) från lösningsmedel-behandlade grupper i runda-botten polystyren 12 × 75 mm rör med 1 mL av samling medium som i steg 3.6 (figurerna 3E-3F).
    Obs: En liten del av celler (såsom 10.000 celler) kan samlas och kör igen på Sorteraren att kontrollera mönstret av aktiva kaspaserna markör. Om över 90% av sorterade lösningsmedel-behandlade celler visas i regionen kaspas-negativa eller över 90% av sorterade inducerare-behandlade celler visas i regionen kaspas-positiv, tros dessa insamlade celler vara relativt ren (siffrorna 3 C-3F). Annars bör regionen sortering eller Sorteraren återställas.
  8. Resuspendera sorterade cellerna i fräsch samling medium och utsäde dem i 12-väl vävnadsodling plattor och kultur vid 37 ° C under en atmosfär av 5% CO2/95% luft för 7 dagar för apoptos återföring.

4. bekräftelse av apoptos i kaspas-aktiverade celler

  1. Blanda 10 mM HEPES, 140 mM NaCl och 2,5 mM CaCl2 förbereda annexin-bindande buffert (pH 7,4). Lagra bufferten vid 4 ° C och undvika bufferten till blottan till ljus.
  2. Förbereda en 100 µg/mL arbetslösning propidium jodid (PI) genom att späda 5 µL av 1 mg/mL stamlösning PI i 45 µL av annexin-bindande buffert. Förvara lösningen vid 4 ° C och undvika lösningen till blottan till ljus.
    Obs: PI är en potentiell mutagen och bör hanteras med försiktighet.
  3. Förbereda inducerare-behandlade cellerna som i steg 2.1 till 2.5.
  4. Samla de inducerare behandlades MCF-7 eller T47D celler genom pipettering medium över det cell-lagret 3-5 x för att lossa cellerna. Överföra cellerna till en 15 mL koniska rör.
  5. Centrifugera vid 300 x g och RT för 5 min. Kassera supernatanten.
  6. Omsuspendera cellerna med färdiga medium cell koncentration 106/ml i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och färga celler med 3 μM kaspas 3/7 grön upptäckt färgämne i mörkret under 30 minuter vid 37 ° C.
  7. Centrifugera vid 300 x g och RT för 5 min. Kassera supernatanterna.
  8. Tvätta cellerna med 1 mL iskallt PBS och centrifugera vid 300 x g och 4 ° C i 5 min. kasta supernatanterna.
  9. Att resuspendera cellerna i 100 μL av annexin-bindande buffert med den Lägg till 5 μL av annexin V konjugatet och 1 µL av 100 µg/mL PI fungerande lösning till varje 100 μL av cellsuspensionen och inkubera cellerna för 15 min i rumstemperatur.
    Obs: Annexin V och PI används ofta tillsammans att märka apoptotiska celler i flödet flödescytometri38,39,40.
  10. Tillsätt 400 µL av annexin-bindande buffert, blanda försiktigt. Hålla proverna på is innan du kör på en flödescytometer.

5. mätning av bröstcancer CSC-liknande celler av flödescytometri

  1. Skörda den återförda MCF-7 i båda inducerare - eller lösningsmedel-behandlade grupperna med 0,05% trypsin-EDTA. Harvest T47D celler i båda inducerare - eller lösningsmedel-behandlade grupper eller med 0,25% trypsin-EDTA som i steg 1,2 till 1,5.
  2. Färga celler med fluorokrom-konjugerad monoklonal antikroppar mot mänskliga CD44 (PerCP-Cy5.5) och CD24 (PE) som i steg 1.12. Under tiden Förbered isotypen kontrollerna som i steg 1.13.
  3. Kör cellerna på en flödescytometer och upptäcka procentandelen av celler med CD44+/CD24– markörer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att observera övergången från bröst icke-stammen cancerceller till bröst CSC-liknande celler, en första sortering av CD44–/CD24+ bröstcancerceller behövdes. För MCF-7 cell raden, som har cirka 0,15% celler med CSC markörer i den original-befolkningen (figur 1), detta steg hjälpte utesluta möjligheten av CSC anrikning under apoptos återföring. Tvärtom, om det fanns inga celler med CSC markörer i den original-befolkningen, kan som för T47D celler (figur 1), proceduren sortering utelämnas. Faktiskt, gating påverkade definitionen av positiva och negativa av varje markör, som så småningom skulle påverka andelen CSC bestäms. Därför bör lämpliga kontroller inklusive isotypen kontroller för antikroppar av intresse, enda färgade kontroller för varje markör noggrant valt och förberedd för gate justering (figur 1).

Med icke-stammen bröstcancerceller, kunde apoptos återföring modellen därefter fastställas. Typiska morfologiska förändringar kunde observeras efter tillägger apoptotiska inducerare och celler bör återställa från apoptos med liknande morfologi efter abstinens (figur 2). Kaspas-3/7 erkänner den amino syra ordnar DEVD i kaspas-3/7 grön Detection färgen och de aktiva formerna av kaspas-3/7 kunna klyva denna webbplats41. Ursprungligen, fluorescensen av kaspas-3/7 grön Detection färgämnet i cytosol är svag medan om färgen är klyvs och flyttad till kärnan, fluorescens signalen skulle förstärkas efter dess bindning till DNA i cellkärnan. Denna uppenbara skillnad kunde särskiljas genom flödescytometri. Därför kunde dessa kaspas-aktiverade celler märkas och sorterade ut baserat på deras högre fluorescens intensitet jämföra dem utan kaspas aktivering (siffror 3A-3D). Under processen apoptotiska induktion en lämpligt lösningsmedel kontroll måste inkluderas: lösningsmedel-behandlade celler utan kaspas aktivering samlades (siffror 3E och 3F) för att utesluta att förfarandet FACS eller vätskan själv var orsaka för övergång, om någon.

För att visa att dessa FACS-sorterade kaspas-aktiverade celler var verkligen apoptotiska, färgade vi tillsammans dessa celler med Annexin V och PI. En av de tidig skede förändringarna i apoptotiska celler är på flyttning av fosfatidylserin från insidan av plasmamembranet till utsidan av cellen13,38,39,40; Detta externalisering av fosfatidylserin kunde ha upptäckts av Annexin V. Denna förändring är inte unikt för apoptos, kan PI användas för att skilja apoptos från nekros baserat på integriteten i cellmembranet. Således anses celler med Annexin V bindande men utan PI färgning apoptotiska celler. Kaspas-aktiverade celler i apoptotiska inducerare behandlingsgrupperna befanns vara Annexin V positiv och PI negativ, vilket tyder på att de var apoptotiska celler (figur 4).

Efter den andra sortering baserat på kaspas aktivering i apoptotiska celler, dessa apoptotiska celler samlades in och därefter odlade för återvinning. De omvända celler som levde kunde bifoga kultur behållare botten och fortsätta att härja. Efter 7 dagar utfördes färgning av CD44 och CD24 i omvänd cellerna medan kontroller var beredda på samma tid som innan. Jämfört med lösningsmedel-behandlade grupperna (figur 1), flöde flödescytometrisk analys visade att det var händelser (celler) som förekommer i CD44+/CD24– kvadrant i omvänd bröst icke-stammen cancer cell befolkningen (figur 1) . Eftersom vi redan hade uteslutit celler med CD44+/CD24– i förväg apoptos induktion och endast CD44–/CD24+ icke-stammen bröstcancerceller valdes, dessa CD44+/CD24– CSC-liknande celler endast kunde transiterat från icke-stammen bröstcancerceller under apoptos återföring.

Figure 1
Figur 1: Representativa bröst CSC markör färgning på bröstcancerceller i flödescytometri.
MCF-7, MDA-MB-231 och T47D var fläckade fluorokrom-konjugerad monoklonal antikroppar mot mänskliga CD44 (PerCP-Cy5.5) och CD24 (PE). Cellerna var först gated framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) (P1) för att utesluta skräp. Isotypen kontroller av CD24 och CD44 användes som negativa kontroller för CD24 och CD44 respektive. MCF-7 celler fläckade CD24 användes som positiv kontroll för CD24 och MDA-MB-231 cellerna färgas med CD44 användes som positiv kontroll för CD44. Icke-stammen MCF-7 bröstcancer cancerceller (P2) sorterades. Dessa sorteras och T47D celler utsattes för apoptos återföring förfarande. CSC-liknande (CD44+CD24–) celler dök upp efter apoptos återföring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Morfologiska förändringar av bröstcancer cancerceller under apoptotiska stimulans induktion.
Bröstcancerceller visade typisk apoptotiska morfologiska förändringar inklusive cell krympning, membran blebbing, mitokondrierna fragmentering (gula pilar i monokrom siffrorna) och nukleär kondensation. Atomkärnor (i blått): kärnor av celler som färgas med Hoechst 33342 visades i blå färg. Mitokondrierna (i rosa): mitokondrier av celler som färgas med Mitotracker röd CMXRos visades i rosa färg. Sammanslagna: siffror samman i dubbla färger visar både mitokondrier och kärnor. Mitokondrier (i grå): mitokondrier av celler som färgas med Mitotracker röd CMXRos visades i svartvitt. Differentiell störningar kontrast (DIC): hela celler. Övre: MCF-7 celler var behandlade med staurosporine (STS) för 6 h sedan återförs för 24 h. nedre: T47D celler behandlades med paklitaxel för 10 h med återföring för 24 h. skala barer = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kaspas aktiveringen analys av sorterare. (A) ofärgade MCF-7 celler utan staurosporine (STS) behandling användes som negativ kontroll (R2). (B) MCF-7 celler behandlas med staurosporine (STS) för 24 h. celler i R3 regionen betraktades som kaspas-aktiveras cellerna. (C) MCF-7 celler behandlas med staurosporine (STS) för 6 h. celler i R3 regionen var FACS-sorterade. (D), FACS-sorterade kaspas-aktiverat MCF-7 celler efter staurosporine (STS) behandling för 6 h var kör igen. (E), behandlade med DMSO MCF-7 celler. (F) FACS-sorterade celler utan kaspas aktivering efter DMSO behandling för 6 h var åter kör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Annexin V och PI färgning av kaspas-aktiverade celler i flödescytometri. MCF-7 och T47D celler var för det första gated framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) (P1) för att utesluta skräp. Celler som var obehandlad med apoptotiska inducerare och utan någon färgning användes som negativa kontroller. För celler behandlas med apoptotiska inducerare, kaspas-aktiverade celler [dvs kaspas-3/7 grön positiva celler] valdes (P3) för att Visa fluorescensintensiteten hos Annexin V och PI färgning. Alla kaspas-3/7 grön positiva celler var Annexin V positiv och PI negativ, vilket tyder på att de var apoptotiska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det här protokollet beskriver ett direkt och tydligt sätt för att upptäcka icke-stammen bröstcancerceller övergång till bröst CSC-liknande celler till följd av apoptos återföring. Bekräftelse av CSC egenskaperna hos dessa omvända celler kan biträdas av använder jagn vitro mammosphere bildandet analys och i vivo xenograft transplantation i nedsatt immunförsvar möss18,24,26 ,27,42,43,44,45. Här använder vi två bröst cancer cellinjer, men detta protokoll ytterligare kan tillämpas i andra breast cancer cellinjer. Eftersom detta fenomen framgår i raden breast cancer cell i vilken färre antal CD44+/CD24– celler finns ursprungligen, det föreslås inte för att välja cellinjer som MDA-MB-231 där det finns mer än 90% av CD44+ celler.

Eftersom gating är viktigt i Flödesanalys, bör korrekt och tillräcklig kontroller förberedas i förväg. För sortering, bör renheten också bestämmas före själva insamlingen av celler. Till exempel för att veta renheten av första sortering, kan en liten del av celler (såsom 10.000 celler) samlas och kör igen på Sorteraren att kontrollera mönstret av CSC markörer. Om över 90% av dessa sorterade celler är CD44–/CD24+ och visas inte i CD44+/CD24– regionen, de insamlade cellerna tros vara relativt ren (figur 1). Om celler visas i CD44+/CD24– region, regionen sortering och/eller Sorteraren ska återställas. Sortering bör utföras så sterilt som möjligt antingen genom att använda en sorterare släpper kultur huva eller lägga till antibiotika vid insamling och odlingsmedium för sorterade celler.

Typer av cancer cell än bröstcancer kan också utses och inducerad med olika apoptotiska stimuli att upprätta apoptos återföring modellen. Medan kaspas aktiveringen kunde upptäckas så tidigt som 2 h, väljas sortering tiden noggrant. Eftersom cellerna i befolkningen inte är synkroniserade, vid en viss tidpunkt punkt, varje cell kan ha nått olika stadier av apoptos. Under tiden hålla celler händer till en apoptotiska död efter kaspas aktivering. Därför, om inducerare tas bort först när alla celler nå kaspas aktivering, vissa celler kan ha redan nått scenen av DNA-fragmentering, vilket gör dem oförmögna att återhämta sig även efter inducerare avlägsnande. Det föreslås inte för att inducera apoptos för alltför lång tid att uppnå en högre procentandel av kaspas-aktiverade celler men med kostnaden för att lämna ett stort antal celler dör efter samlingen. Inkubationstiden och färgämne koncentrationen som etiketter kaspas-aktiverade celler bör dessutom optimeras varje gång en ny cellinje används för första gången.

Ett annat bekymmer per framgångsrikt inducera apoptos återföring i apoptotiska celler är låga återvinningsgraden av cellerna (vanligen mindre än 10%). Cellerna har gått igenom apoptos plus sortering förfarandet. Därför kräver de mycket varsam hantering under centrifugering och överföring på insamling och resuspension stegen. Valet av plattan eller skålen används för efterföljande kultur bör också, inte beroende på antalet celler samlas in men på det förväntade antalet återställningar. Annars skulle celler kunna tilldelas alltför glest för att vända och åter växa. Med tanke på att icke-stammen cancer celler växer vid en högre hastighet och kan dominera i de åter utgjorde cell befolkningen46, bör tiden upptäckt inte vara alltför långt bort från den första vilodag.

Denna metod första isolat bröstet icke-stammen cancercell sedan tillämpar dem för apoptotiska induktion där en andra sortering görs baserat på kaspas aktivering innan celler får återkrävas. Re-uppkomsten av bröstcancer CSC-liknande celler i omvända befolkningen detekteras av flödescytometri. Eftersom proceduren återföring i vitro apoptos isolater ren apoptotiska cancerceller, kan ett antal experiment nu utföras för att förstå konsekvenserna av dessa verkligt omvända celler. Förutom bröstcancerceller, andra solid tumörtyper samt hematologisk malignitet som är med kända CSC markörer kan studeras och olika apoptotiska stimulans kan användas. Denna metod är därför utdragbara och gäller för en boarder omfattas av cancer undersökning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av innovativa teknologi fond av Innovation Technology kommissionen: finansiering stöd från de statliga nyckel laboratorium av Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong biomedicinsk forskningsfonden och stiftelsen Lee Hysan. Y.X. stöddes av doktorandtjänst från CUHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40 μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus -
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

Tags

Cancerforskning fråga 143 cancerstamceller bröstcancer apoptos apoptos återföring flödescytometri fluorescens-aktiverad cell sortering
Flöde flödescytometrisk påvisa nybildade Stem Cell-liknande bröstcancerceller efter apoptos återföring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. … More

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal. J. Vis. Exp. (143), e58642, doi:10.3791/58642 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter