Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare cellule di carcinoma mammario apoptotica ordinando di fluorescenza-attivato delle cellule e ulteriormente rilevare la transizione delle cellule staminali non cancro al seno al seno cancro cellule staminali-come le cellule dopo inversione di apoptosi mediante citometria a flusso.
Abstract
Recidiva del tumore lungo è stato studiato dagli oncologi, mentre i meccanismi di fondo rimangono poco chiari. Recentemente, abbiamo e altri trovato che un fenomeno denominato apoptosi inversione porta ad aumento tumorigenicità in vari modelli di cellulari sotto diversi stimoli. Gli studi precedenti si sono concentrati sul monitoraggio di questo processo in vitro e in vivo; Tuttavia, l'isolamento di cellule vero invertite ha ancora da conseguire, che limita la nostra comprensione sulle conseguenze dell'inversione di apoptosi. Qui, approfittiamo di una tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione alle cellule di etichetta con caspasi attivate dopo induzione apoptotica. Cellule con segnali positivi sono ulteriormente separate per fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per il recupero. L'esame morfologico sotto microscopia confocale aiuta a verificare lo stato di apoptotic prima FACS. Un aumento di carcinogenicità spesso può essere attribuito all'elevazione della percentuale di cellule staminali tumorali (CSC)-come le cellule. Inoltre, data l'eterogeneità di cancro al seno, identificare l'origine di queste cellule di CSC-come sarebbe fondamentale per il trattamento del cancro. Così, prepariamo le cellule staminali non cancro al seno prima di innescare l'apoptosi, isolare cellule caspase-attivata ed eseguire la procedura di inversione di apoptosi. Analisi di citometria a flusso rivela che i CSC-come le cellule del seno ri-appaiono nel gruppo invertito, che indica i CSC-come le cellule del seno sono transitate da cellule staminali non cancro al seno durante l'inversione di apoptosi. Questo protocollo prevede in sintesi, l'isolamento delle cellule di cancro al seno apoptotica e rilevamento delle modifiche in percentuale di CSC in cellule invertite tramite flusso cytometry.
Introduction
Cancro è stato delle cause principali di morte, causando il pesante fardello di paesi in tutto il mondo1. Cancro al seno truppa alta sia in termini di incidenza e mortalità in pazienti femminili tra tutti i tipi di cancro1. A causa dell'eterogeneità di cancro, una combinazione di farmaci è solitamente utilizzata in chemioterapia per raggiungere cancro delle cellule morte2,3,4. Tuttavia, poiché le droghe chemioterapeutiche comuni spesso target DNA5,6, proteina sintesi7,8 e/o microtubule dynamics9, cellule in rapida crescita sono interessati più mentre cellule quiescenti come cancro cellule staminali (CSC) s sono solitamente meno colpiti10. CSC sono, pertanto, più probabilità di sopravvivere dopo il trattamento, che poi conduce a farmacoresistenza e cancro recidiva10,11. Quindi, eliminazione delle CSCs è diventata un tema importante per il trattamento del cancro e lo studio dell'origine delle CSCs è necessario.
Sono stati effettuati ulteriori studi sul fenomeno dell'inversione di apoptosi nella decade recente12,13,14,15,16,17,18 , 19. prima della nascita di questo concetto, è stato ampiamente accettato che le cellule irreversibilmente subirà apoptosi dopo l'attivazione delle caspasi. Caspasi sono una famiglia di enzimi proteine che giocano un ruolo chiave nelle fasi di iniziazione e l'esecuzione dell'apoptosi, tra cui la formazione del complesso apoptotico e la fenditura di substrati a valle20. L'attivazione delle caspasi boia come caspasi 3 o caspasi 7 è stato considerato come il "punto di non ritorno" per apoptosi21. Tuttavia, i ricercatori hanno recentemente osservato che l'apoptosi inversione si verifica sia in vitro e in vivo, , durante il quale le cellule possono recuperare dall'apoptosi anche dopo l'attivazione di caspasi12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Inoltre, caratteristiche aggressive come maggiore resistenza alla originale induttore apoptotico e maggiore invasività vengono rilevati nel cancro invertito cellule15. Quindi, è stato proposto che la percentuale di CSC-come le cellule sarebbe superiore alla popolazione invertita rispetto alle cellule non trattate, contribuendo alla fine alle funzionalità più maligna dopo apoptosi inversione18.
In precedenza, molti sforzi sono stato apportati traccia l'inversione di apoptosi in vitro e ancora più importante, in vivo, che notevolmente aiutare a confermare l'universalità di questo processo16,17,19. Tuttavia, uno studio sistematico sulle conseguenze delle cellule invertite è carente a causa dell'isolamento insoddisfacente delle cellule che hanno effettivamente subito inversione di apoptosi. C'è la necessità di acquisire le cellule apoptotiche puro e recuperarli per ulteriore studio. Così, usiamo il marcatore tradizionalmente ben accettato di attivazione delle caspasi boia come l'indicatore del "punto di non ritorno"21 per apoptosi e utilizzare fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per discriminare caspase-attivata cellule colorate con la tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione. La tintura è covalentemente ad una sequenza di amminoacido breve, DEVD, che può essere riconosciuto e spaccati di caspases attivi 3/7. Il clivaggio aiuta a rilasciare il colorante, che sarà traslocano dal cytosol al nucleo dove si lega al DNA ed emette fluorescenza forte. Questa procedura evita di utilizzare una popolazione delle cellule di massa in cui alcune cellule possono non aver subito l'apoptosi.
CSC o cellule d'inizio del tumore sono state identificate in molti tumori solidi, utilizzando un singolo o una combinazione di diversi marker(s) superficiale e molto pochi numeri di queste cellule sono sufficienti a formare tumori in topi immunodeficienti22,23, 24,25,26,27. Una combinazione di CD44 e CD24 è stato comunemente utilizzata negli studi di seno CSC e CD44+/CD24– cellule sono state definite come il seno di CSCs26,27,28,29 , 30. recentemente, abbiamo effettuato una serie di esperimenti per confermare il rapporto proposto tra apoptosi inversione e CSCs e dimostrare che cellule di carcinoma mammario invertita acquisito capacità aumentata di formazione del tumore in vitro e in vivo con un elevata percentuale di cellule con CSC marcatori18. Anche se non potremmo escludere la possibilità che al seno CSCs sopravvivono meglio e così arricchirsi dopo inversione di apoptosi, cosa importante, quando isoliamo le cellule tumorali staminali non e soggetto a inversione di apoptosi, CSC emergerà nell'originariamente non-staminali popolazione delle cellule di cancro, suggerendo che non-staminali cancro cellule possono contribuire all'aumento della percentuale di CSCs durante l'inversione di apoptosi.
Questo articolo si propone di dimostrare la transizione da cellule staminali non cancro al seno alle cellule simil-CSC del seno dopo l'inversione di apoptosi e di rilevare questa transizione tramite flusso cytometry. Le cellule staminali non cancro al seno sono inizialmente preparate isolando CD44–/CD24+ cancro cellule di FACS al seno. Quindi, apoptosi sono indotta e confermata da cambiamenti morfologici sotto il microscopio. In seguito, le cellule apoptotiche positivamente etichettati da tintura verde rilevazione di Caspase 3/7 sono isolate da FACS e ulteriormente coltivate in assenza di induttori apoptotici per l'inversione di apoptosi. Le cellule invertite sono poi tinto con marcatori di CSC dopo 7 giorni di recupero per l'analisi cytometric di flusso. Cellule con CD44+/CD24 marcatori– ri-appaiono nella popolazione invertita, suggerendo che la transizione dalle cellule tumorali staminali non a CSC-come le cellule si è verificato durante l'apoptosi inversione.
Inversione di apoptosi è stata osservata nel cancro più linee cellulari come pure le cellule primarie normali trattati con stimoli apoptotici diversi in vitro12,13. Questo processo è stato rintracciato anche in Drosophila modello in vivo16,17,19. Molte informazioni per quanto riguarda il meccanismo di fondo di ricaduta del cancro nei modelli differenti del cancro malattia e l'origine delle CSCs possono essere ottenuti attraverso l'uso della tecnica come descritto in questo manoscritto.
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Protocol
1. preparazione del seno cancro cellule staminali Non
- Cultura MCF-7 e cellule MDA-MB-231 in 10 mL di medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 privo di rosso fenolo supplementato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) in un piatto di 100 mm. Cultura T47D in 10 mL di fenolo rosso privo RPMI 1640 supplementato con 2 mM L-Glutammina, 10% inattivati FBS e 1% v/v penicillina-streptomicina (PS) in un piatto di 100 mm. Cellule di coltura a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare di 5% CO295% aria.
Nota: Rosso fenolo colpisce rilevamento basati sulla fluorescenza ma ha anche una potenziale influenza sulla crescita delle cellule di cancro al seno a causa dei suoi effetti estrogeno-simile31. Ad esempio, rosso fenolo potrebbe stimolare il ricevitore del progesterone e la crescita di cellule MCF-731. Potrebbe inoltre incentivare la crescita di cellule di T47D31. - Lavare le cellule con 2 mL di fosfato tampone salino (PBS) due volte. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,05% a MCF-7 e MDA-MB-231 o 2 mL di 0,25% tripsina-EDTA a cellule T47D.
Nota: La concentrazione di tripsina-EDTA necessari per la separazione delle cellule fra tipi di cellule di cancro al seno diversi variare mentre una concentrazione inappropriata può influenzare il pattern di espressione di alcuni marcatori di superficie cellulare come CD44 e CD2432. - I piatti per 5 min a 37 ° C in atmosfera di 5% CO295% aria della coltura. Controllare frequentemente il distacco delle cellule sotto il microscopio di prevenire le cellule da sovra-digestione con tripsina-EDTA.
- Quando oltre il 90% cellule scollegare, aggiungere 5 mL di medium RPMI completate il piatto e pipetta sopra la superficie di strato delle cellule diverse volte.
- Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 5 min.
Nota: Solitamente, circa 6 x 106 cellule possono essere ottenute da un piatto di 100 mm quando il confluency raggiunge il 70%. - Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 106 cellule/100 μL di tampone di FACS (PBS contenente 0.5% di BSA e 0,1% di sodio azide) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Dividere le celle in diversi tubi. Per cellule MCF-7, dividere le celle in 4 tubi: due per isotipo controlli, uno per singolo CD24 colorazione come controllo positivo CD24 e uno per la doppia colorazione.
- Per le cellule T47D, dividere le celle in 3 tubi: due per controlli di isotipo e uno per la doppia colorazione.
- Per le cellule MDA-MB-231, dividere le celle in 4 tubi: due per isotipo controlli, uno per CD44 singola colorazione come controllo positivo CD44 e uno per la doppia colorazione.
- Centrifugare le provette nuovamente a 300 x g e a 4 ° C per 5 min. eliminare il supernatante e quindi aggiungere blocco Fc diluito 01:50 nel buffer di FACS.
- Incubare i campioni in ghiaccio per 20 minuti al buio prima centrifugazione a 300 x g e 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante.
- Aggiungere fluorocromo-coniugate di anticorpi monoclonali contro umano CD44 (PerCP-Cy 5.5) e CD24 (PE) a diluizioni 01:40 e 01:10 (nel buffer di FACS) in dual macchiatura gruppi. Per i controlli positivi, aggiungere CD44 (PerCP-Cy 5.5) per MDA-MB-231 e aggiungere CD24 (PE) alle cellule MCF-7 alla stessa concentrazione, rispettivamente.
Nota: La combinazione di CD44 e C24 è stato comunemente utilizzata in seno CSC Studio26,27,28,29,30. - Per i gruppi di controllo di isotipo, aggiungere PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG2b, κ presso un 01:40 diluizione come il controllo di isotipo per CD44 anticorpi e PE Mouse IgG2a, κ presso un 01:10 diluizione come il controllo di isotipo per CD24 anticorpi alle 106 cellule/100 μL.
Nota: Isotype controlli per gli anticorpi di interesse sono raccomandati come controlli negativi33. - Incubare i campioni (da passaggi 1.12 e 1.13) a 4 ° C al buio per 30 min. Centrifugare a 300 x g e 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante.
- Lavare la pallina due volte con 500 μL di PBS e centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 5 min.
- Risospendere il pellet in 0,5 mL di PBS e filtrare attraverso una rete di nylon di 40 µm prima di eseguire su un sorter fluorescenza-attivato delle cellule.
- Per scopi di gating e compensazione, macchia cellule MCF-7 con gli anticorpi anti-CD24 PE-coniugati e macchiare le cellule MDA-MB-231 con gli anticorpi anti-CD44 PerCP-Cy 5.5-coniugato come controlli positivi. Utilizzare le cellule colorate con isotipo controlli come controlli negativi (Figura 1).
- Raccogliere le cellule con CD44–/CD24+ marcatori in tubi di turno-fondo polistirolo 12x75 mm contenente 1 mL di mezzo di raccolta (privo di rosso fenolo RPMI 1640 supplementato con 20% inattivati FBS e 2% v/v PS). Centrifugare le provette a 300 x g e RT per 5 min e scartare il surnatante.
Nota: CSC-come le cellule in cellule di cancro al seno sono definite come CD44+/CD24– cellule26,27,28,29,30e il seno non-staminali cellule tumorali sono definiti come CD44–/CD24+ cellule18 (Figura 1). - Piastra di cellule di cancro non-staminali del seno ordinato nella piastra di coltura contenenti terreno collezione fresca per la ulteriore coltura a 37 ° C in 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare.
2. rilevamento e induzione apoptotica
- Preparare 1 mM staurosporine12,34 in DMSO. Per il gruppo trattato di MCF-7, aggiungere 25 μL di 1mm staurosporine al medium completato delle cellule MCF-7 di rendere fino a 10 mL di volume finale (2,5 μM staurosporine) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.
- Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta. Quindi aggiungere i 10 mL di medium con 2,5 μM staurosporine alle cellule MCF-7 per 6 h di indurre apoptosi quando raggiunge la densità delle cellule confluency di 70%.
- Preparare 1 mM paclitaxel35,36 in DMSO. Per il gruppo trattato di T47D, aggiungere 12,5 μL di paclitaxel 1 mM al medium completato delle cellule T47D per rendere ad un volume finale di 10 mL (5 μM paclitaxel) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.
- Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta. Quindi aggiungere i 10 mL di medium con 5 μM paclitaxel alle cellule T47D per 10 h per indurre apoptosi quando raggiunge la densità delle cellule confluency di 70%.
Nota: Il tempo di induzione e la concentrazione degli induttori che inducono apoptosi dovrebbe essere ottimizzati ogni volta che una nuova linea di cella viene utilizzata per la prima volta. - Per il gruppo solvente-trattato di MCF-7, aggiungere 25 μL di sterile dimetilsolfossido (DMSO) al medium completato delle cellule MCF-7 per rendere ad un volume finale di 10 mL (cioè, 0,25% v/v DMSO) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.
- Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule MCF-7 trattate solvente, lavare una volta con 2 mL di PBS. Quindi aggiungere i 10 mL di medium con 0,25% v/v DMSO per 6 h come il controllo solvente per STS.
- Per il gruppo di T47D solvente-trattati, aggiungere 5 μL di DMSO sterile al medium completato delle cellule T47D per portare a 10 mL di volume finale (cioè, 0.05% v/v DMSO) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.
- Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule T47D trattate solvente, lavare una volta con 2 mL di PBS. Quindi, aggiungere 10 mL di medium con 0.05% v/v DMSO per 10 h come il controllo solvente per il paclitaxel.
- Per osservare i cambiamenti morfologici delle cellule trattate, macchia le cellule con 50 nM Mitotracker Red CMXRos e 250 ng/mL Hoechst 33342 e incubare per un altro 20 min a 37 ° C in atmosfera di aria di 95% di 5% CO2. Osservare la morfologia delle cellule apoptotiche tipiche sotto un 60 x laser confocale scansione microscopio (Figura 2).
Nota: Apoptosi tipica morfologia include restringimento delle cellule, blebbing membrana, mitocondri frammentazione e condensazione nucleare ma con membrana cellulare intatta12,13,14,15 ,18,37.
3. isolamento di cellule apoptotiche e procedura di inversione di apoptosi
- Macchia apoptotica induttore solvente trattati e MCF-7 o cellule T47D con tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione 3 μM nella concentrazione delle cellule/ml al buio per 30 min a 37 ° C in atmosfera di 5% CO295% aria 10-6.
- Filtrare le cellule attraverso una rete di nylon di 40 µm prima di eseguire l'ordinatore per l'ordinamento.
- Per scopi di gating, primo cancello la popolazione principale (R1) ed escludere i detriti tracciando il grafico in punti con forward scatter e dispersione laterale (Figura 3).
- Utilizzare le cellule non trattate senza aggiungere il colorante di Caspase-3/7 verde rilevazione come controllo negativo al cancello della regione negativa (R2) (Figura 3A).
- Utilizzare le cellule trattate con staurosporine12,18,34 per 24 h e colorate con il colorante come controllo positivo al cancello della regione positiva (R3) (Figura 3B).
- Raccogliere le cellule positive (R3) dei gruppi trattati con induttore in tubi di turno-fondo polistirolo 12x75 mm contenente 1 mL di mezzo di raccolta (stesso come il mezzo di raccolta nel passaggio 1.18) (figure 3C-3D). Centrifugare le provette a 300 x g e RT per 5 min e scartare il surnatante.
- Raccogliere le cellule negative (R2) da gruppi trattati con solvente in provette di polistirene di turno-fondo 12 × 75 mm con 1 mL di mezzo di raccolta come al punto 3.6 (figure 3E-3F).
Nota: Una piccola porzione di celle (ad esempio 10.000 cellule) possa essere raccolti ed eseguire nuovamente ordinatore per controllare il modello del marcatore di caspases attivi. Se oltre il 90% di cellule trattate con solvente ordinate sono mostrati nella regione caspase-negativi o oltre il 90% di cellule trattate con induttore ordinate sono mostrati nella regione caspase-positivi, queste cellule prelevate sono credute per essere relativamente puro (figure 3C-3F). In caso contrario, la regione di ordinamento e/o la sequenza deve essere reimpostata. - Risospendere le cellule ordinate in mezzo collezione fresca e semi in piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti e coltura a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO295% aria per 7 giorni per l'inversione di apoptosi.
4. conferma dell'apoptosi in cellule di Caspase-attivata
- Mix 10 mM HEPES, 140 mM NaCl e 2,5 mM CaCl2 per preparare annessina-associazione tampone (pH 7,4). Conservare il tampone a 4 ° C ed evitare il buffer per esporre alla luce.
- Preparare una soluzione di lavoro 100 µ g/mL di ioduro di propidio (PI) diluendo 5 µ l di 1 mg/mL soluzione di riserva di PI in 45 µ l di tampone di annessina-associazione. Conservare la soluzione a 4 ° C ed evitare la soluzione per esporre alla luce.
Nota: PI è un potenziale mutageno e deve essere maneggiato con cura. - Preparare le cellule induttore-trattate come nei passaggi 2.1 a 2.5.
- Raccogliere l'induttore-trattati MCF-7 o cellule T47D pipettando il mezzo sopra lo strato delle cellule 3-5x per staccare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL.
- Centrifugare a 300 x g e RT per 5 min, scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule con il mezzo completato presso la concentrazione cellulare di 106/ml in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e macchiare le cellule con 3 della tintura di verde rilevazione di Caspase 3/7 μM al buio per 30 min a 37 ° C.
- Centrifugare a 300 x g e RT per 5 min. scartare i sovranatante.
- Lavare le cellule con 1 mL di PBS ghiacciata e centrifugare a 300 x g e 4 ° C per 5 min, eliminare i sovranatante.
- Risospendere le cellule in 100 μL di tampone di annessina-associazione con l'aggiungere 5 μL del coniugato Annessina V e 1 µ l di 100 µ g/mL PI soluzione di lavoro per ogni 100 µ l di sospensione cellulare e incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente.
Nota: Annessina V e PI sono insieme comunemente usate per marcare le cellule apoptotiche in flusso cytometry38,39,40. - Aggiungere 400 µ l di tampone di annessina-associazione, mix delicatamente. Mantenere i campioni sul ghiaccio prima di eseguire su un citometro a flusso.
5. misurazione del seno CSC-come le cellule tramite flusso Cytometry
- La MCF-7 invertita in entrambi i gruppi induttore o solvente-trattati con tripsina-EDTA 0,05% della raccolta. Raccogliere cellule T47D in entrambi i gruppi trattati di induttore o solvente o con 0,25% tripsina-EDTA come nei passaggi 1.2 a 1.5.
- Macchia le celle con fluorocromo-coniugate di anticorpi monoclonali contro umano CD44 (PerCP-Cy 5.5) e CD24 (PE) come descritto al punto 1.12. Nel frattempo, preparare i controlli di isotipo come descritto al punto 1.13.
- Eseguire le cellule su un citometro a flusso e rilevare la percentuale di cellule con CD44+/CD24– marcatori.
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Representative Results
Al fine di osservare il passaggio dal seno non-staminali cellule di cancro al seno CSC-come le cellule, una prima cernita di CD44–/CD24+ cellule di cancro al seno sono stati necessari. Per la linea cellulare MCF-7, che ha circa 0,15% cellule con marcatori di CSC nella popolazione originale (Figura 1), questo passaggio ha aiutato esclude la possibilità di arricchimento di CSC durante l'inversione di apoptosi. Al contrario, se non ci fosse nessuna cellula con marcatori di CSC nella popolazione originale, come per le cellule T47D (Figura 1), questa procedura di ordinamento potrebbe essere omessa. Infatti, gating interessati alla definizione degli effetti positivi e negativi di ogni indicatore, che alla fine possono influenzare la percentuale di CSC determinato. Pertanto, appropriati controlli inclusi isotipo i controlli per gli anticorpi di interesse, macchiati singoli controlli per ogni indicatore dovrebbero essere accuratamente scelti e preparati per regolazione porta (Figura 1).
Con cellule staminali non cancro al seno, il modello di inversione di apoptosi in seguito potrebbe essere stabilito. Cambiamenti morfologici tipici ha potuto essere osservati dopo aggiunta di induttori apoptotici e cellule dovrebbero recuperare dall'apoptosi con morfologia simile dopo ritiro di droga (Figura 2). Caspase-3/7 riconosce la sequenza dell'amminoacido DEVD nella tintura Caspase-3/7 verde rilevazione e le forme attive di caspase-3/7 sono in grado di fendere questo sito41. Originariamente, la fluorescenza della tintura Caspase-3/7 verde rilevazione nel cytosol è debole, mentre se il colorante è spaccato e trasloca nel nucleo, dopo il suo legame al DNA nel nucleo sarebbe amplificato il segnale di fluorescenza. Questa differenza evidente potrebbe essere distinto tramite flusso cytometry. Quindi, quelle cellule caspase-attivata potrebbero essere etichettati e ordinate in base alla loro intensità di fluorescenza superiore confronto a quelli senza l'attivazione delle caspasi (figure 3A-3D). Durante il processo di induzione apoptotica, un appropriato controllo solvente deve essere incluso: cellule trattate con solvente senza l'attivazione delle caspasi sono stati raccolti (3F e figure 3E) per escludere la possibilità che la procedura di FACS o il solvente stesso era la causa per la transizione, se presente.
Al fine di dimostrare che quelle cellule caspase-attivata di FACS-ordinati erano infatti apoptotici, abbiamo co-macchiato queste cellule con Annessina V e PI. Uno dei cambiamenti di fase iniziale in cellule apoptotiche è la traslocazione della fosfatidilserina dal lato interno della membrana del plasma sulla superficie esterna della cella13,38,39,40; questa esternalizzazione della fosfatidilserina potrebbe essere rilevata da Annexin V. Mentre questa modifica non è univoco all'apoptosi, PI può essere utilizzato per distinguere gli apoptosi da necrosi basata sull'integrità della membrana cellulare. Quindi, cellule con Annexin V che lega ma senza PI colorazione sono considerate come cellule apoptotiche. Caspase-attivata cellule nei gruppi di trattamento induttore apoptotico sono state trovate per essere Annexin V positivo e PI negative, suggerendo che erano cellule apoptotiche (Figura 4).
Dopo il secondo ordinamento basato sull'attivazione di caspase in cellule apoptotiche, queste cellule apoptotiche sono stati raccolti e successivamente coltivate per il recupero. Le cellule invertite che erano vive erano in grado di fissare il fondo del contenitore di cultura e continuano a proliferare. Dopo 7 giorni, macchiatura di CD44 e CD24 è stata effettuata nelle cellule invertite mentre i controlli sono stati preparati allo stesso tempo come prima. Rispetto ai gruppi trattati con solvente (Figura 1), l'analisi cytometric di flusso ha mostrato che ci sono stati eventi (cellule) che appaiono in CD44+/CD24– quadrante nella popolazione delle cellule del non-staminali cancro del seno inverso (Figura 1) . Poiché abbiamo già avevamo escluso cellule con CD44+/CD24– in anticipo l'induzione di apoptosi e solo CD44–/CD24+ cellule staminali non cancro al seno sono stati scelti, questi CD44+/CD24– CSC-come le cellule non potevano che essere transitato da cellule staminali non cancro al seno durante l'inversione di apoptosi.
Figura 1: Indicatore rappresentativo del seno CSC colorazione sulle cellule di cancro al seno in citometria a flusso.
MCF-7, MDA-MB-231 e T47D erano macchiati con fluorocromo-coniugate di anticorpi monoclonali contro umano CD44 (PerCP-Cy 5.5) e CD24 (PE). Le cellule sono state prima gated di forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) (P1) per escludere detriti. Controlli di isotipo di CD24 e CD44 sono stati utilizzati come controlli negativi per CD24 e CD44 rispettivamente. Le cellule MCF-7 colorate con CD24 era utilizzato come controllo positivo per CD24 e MDA-MB-231 cellule colorate con CD44 è stato utilizzato come controllo positivo per CD44. Cellule di cancro al seno MCF-7 non-staminali (P2) sono state ordinate. Queste cellule ordinate e cellule T47D sono stati sottoposti a procedura di inversione di apoptosi. CSC-come (CD44+CD24–) le cellule sono comparso dopo l'inversione di apoptosi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I cambiamenti morfologici delle cellule di cancro al seno sotto induzione apoptotica stimolo.
Cellule di cancro al seno ha mostrato apoptotico tipico cambiamenti morfologici tra cui restringimento delle cellule, blebbing membrana, mitocondri frammentazione (frecce gialle disegni in bianco e nero) e condensazione nucleare. I nuclei (in blu): nuclei delle cellule colorate con Hoechst 33342 sono stati indicati in colore blu. Mitocondri (in rosa): mitocondri delle cellule colorate con Mitotracker Red CMXRos sono stati indicati in colore rosa. Unita: figure Unite in due colori, mostrando sia i mitocondri e nuclei. Mitocondri (in grigio): mitocondri delle cellule colorate con Mitotracker Red CMXRos sono stati indicati in bianco e nero. Contrasto differenziale di interferenza (DIC): le cellule intere. Tomaia: Cellule MCF-7 sono state trattate con staurosporine (STS) per 6 h quindi invertite per 24 h. inferiore: cellule T47D sono state trattate con paclitaxel per 10 h con inversione per barre della scala h. 24 = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi di attivazione di Caspase da sorter. (A) non macchiate MCF-7 celle senza trattamento staurosporine (STS) sono stati usati come controllo negativo (R2). (B) le cellule MCF-7 trattate con staurosporine (STS) per 24 h. cellule nella regione R3 sono stati considerare come le cellule di caspase-attivata. (C) cellule MCF-7 trattati con staurosporine (STS) per h. 6 celle in R3 area erano ordinati FACS. (D), FACS-ordinato caspase-attivata MCF-7 cellule dopo trattamento staurosporine (STS) per 6 h erano eseguire nuovamente. (E), trattati con DMSO MCF-7 celle. (F) cellule di FACS-ordinati senza l'attivazione di caspase dopo trattamento di DMSO per 6 h erano re-run. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Annessina V e PI macchiatura delle cellule caspase-attivata in citometria a flusso. Cellule T47D e MCF-7 sono stati in primo luogo recintate di forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) (P1) per escludere detriti. Le cellule che erano non trattate con induttori apoptotici e senza qualsiasi colorazione sono state utilizzate come controlli negativi. Per cellule trattate con induttori apoptotici, le cellule di caspase-attivata [cioè, cellule positive di Caspase-3/7 verde] sono state selezionate (P3) per mostrare l'intensità della fluorescenza di Annexin V e PI colorazione. Tutte le cellule positive di Caspase-3/7 verde Annexin V positivo e PI negativo, suggerendo che erano apoptotic. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un modo diretto e chiaro per rilevare il passaggio di cellule staminali non cancro al seno in seno CSC-come le cellule come conseguenza di inversione di apoptosi. Conferma delle proprietà CSC di queste cellule invertite potrebbe essere assistito tramite in vitro mammosphere formazione dosaggio ed in vivo dello xenotrapianto trapianto in topi immunodeficienti18,24,26 ,27,42,43,44,45. Qui, usiamo due linee di cellule di cancro al seno, ma questo protocollo possa essere applicato in altre linee cellulari di cancro al seno. Dato che questo fenomeno è evidente nella linea cellulare di cancro al seno in cui minore numero di CD44+/CD24– cellule esistono originariamente, si consiglia di non per scegliere linee cellulari come MDA-MB-231, in cui ci sono più di 90% di CD44+ cellule.
Poiché gating è importante nell'analisi dei flussi, controlli adeguati e sufficienti devono essere preparati in anticipo. Per l'ordinamento, la purezza deve essere determinata anche prima l'insieme effettivo di celle. Ad esempio, per conoscere la purezza di ordinamento prima, una piccola porzione di celle (ad esempio 10.000 cellule) possa essere raccolti ed eseguire nuovamente ordinatore per controllare il modello degli indicatori di CSC. Se oltre 90% di queste cellule sono CD44–/CD24+ e non vengono visualizzati in CD44+/CD24– regione, le cellule prelevate sono credute per essere relativamente puro (Figura 1). Se le celle vengono visualizzate in CD44+/CD24– regione, la regione di ordinamento e/o il selezionatore deve essere reimpostato. L'ordinamento deve essere condotta come sterile possibile utilizzando un sorter all'interno cappa di cultura o l'aggiunta di antibiotici nella raccolta e nel terreno di coltura per cellule ordinate.
Tipi di cellule di cancro diverso da cancro al seno possono essere scelti e indotta con vari stimoli apoptotici per stabilire il modello di inversione di apoptosi. Mentre l'attivazione di caspase potrebbe essere rilevato più presto 2 h, il tempo di ordinamento deve essere accuratamente scelte. Poiché le cellule nella popolazione non sono sincronizzate, in un momento specifico punto, ogni cella potrebbe aver raggiunto diversi stadi dell'apoptosi. Nel frattempo, le cellule proseguire a una morte apoptotica dopo l'attivazione delle caspasi. Pertanto, se gli induttori vengono rimossi solo quando tutte le celle raggiungono l'attivazione delle caspasi, alcune cellule potrebbero aver già raggiunto la fase di frammentazione del DNA, che li rende in grado di recuperare anche dopo la rimozione dell'induttore. Non è suggerito per indurre apoptosi per troppo lungo tempo a conseguire una più alta percentuale delle cellule caspase-attivata ma con il costo di lasciare un gran numero di cellule che muoiono dopo la raccolta. Inoltre, il tempo di incubazione e la concentrazione di colorante che le etichette caspase-attivata cellule dovrebbe essere ottimizzati ogni volta che una nuova linea di cella viene utilizzata per la prima volta.
Un'altra preoccupazione a partire da indurre con successo l'inversione di apoptosi nelle cellule apoptotiche è il tasso di recupero basso delle cellule (di solito meno di 10%). Le cellule sono passati attraverso l'apoptosi e la procedura di ordinamento; di conseguenza, richiedono una gestione molto gentile durante la centrifugazione e trasferimento presso le operazioni di raccolta e risospensione. Inoltre, la scelta del vassoio o piatto utilizzato per la coltura successiva dovrebbe non essere dipende dal numero di cellule raccolte ma il numero previsto dei recuperi. In caso contrario, le cellule possono essere allocate troppo scarsamente per invertire e ri-crescere. Dato che il cancro non-staminali cellule crescono a una velocità superiore e possono dominare nel ricostituito cella popolazione46, il tempo di rilevamento non deve essere troppo lontano dal primo giorno di recupero.
Questo metodo prima isolati seno non-staminali cellula tumorale quindi li applica per induzione apoptotica dove avviene un secondo l'ordinamento basato sull'attivazione di caspase prima cellule ottenere recuperate. La ricomparsa del seno CSC-come le cellule nella popolazione invertita viene rilevata tramite flusso cytometry. Poiché questa procedura di inversione del apoptosis in vitro consente di isolare cellule tumorali apoptotiche puro, una serie di esperimenti in questo momento può svolgersi per comprendere le conseguenze di queste cellule vero invertite. Oltre alle cellule di cancro al seno, altri tipi di tumore solido così come malignità ematologica che sono con noti indicatori di CSC possono essere studiati e possono essere utilizzati vari stimoli apoptotici. Quindi, questo metodo è estensibile e applicabile a un ambito di boarder di indagine di cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla innovativa tecnologia fondo di innovazione tecnologia Commissione: supporto finanziamenti dal laboratorio chiave dello stato di Istittuto (CUHK), al fondo di ricerca biomedica Lo Kwee-Seong e Lee Hysan Foundation. Y.X. è stato sostenuto da studentship post-laurea dal CUHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40 μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | - | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
References
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