Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון ולגלות עוד יותר את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד השד תאים סרטניים, כמו בתאי גזע לאחר היפוך אפופטוזיס מאת cytometry זרימה.

Abstract

הישנות סרטן זמן נחקרה על ידי אונקולוגים בעוד המנגנון המשמש כבסיס אינן ברורות. לאחרונה, אנחנו ואחרים מצאו כי תופעה בשם אפופטוזיס היפוך מוביל tumorigenicity מוגברת בדגמי תא שונים תחת גירויים שונים. מחקרים קודמים כבר התמקדו מעקב אחר תהליך זה במבחנה, אין ויוו; עם זאת, הבידוד של תאים הפוכה ממש טרם ניתן להשיג, אשר מגביל את ההבנה שלנו על ההשלכות של היפוך אפופטוזיס. כאן, אנו לנצל צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7 לתאים תווית עם caspases מופעל לאחר מוות אינדוקציה. תאים עם אותות חיוביים מסודרים נוספת על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) עבור שחזור. בדיקת מורפולוגיה תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית מסייע לאשר את מצב אפופטוטיים להיפגע לפני FACS. עלייה tumorigenicity לעתים קרובות ניתן לייחס את העלאת באחוזים של תאי סרטן (CSC)-כמו תאים. כמו כן, לאור את הטרוגניות של סרטן השד, זיהוי המקור של תאים אלה CSC דמוי יהיה קריטי לטיפול בסרטן. לפיכך, אנו מכינים תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לפני מפעילה אפופטוזיס, לבודד תאים קספאז מופעל, ביצוע הליך היפוך אפופטוזיס. ניתוח cytometry זרימה מגלה כי תאים דמויי CSC בשד מחדש יופיעו בקבוצה הפוכה, המציין תאים דמויי CSC בשד הם transited מתאי גזע ללא סרטן השד במהלך היפוך אפופטוזיס. לסיכום, פרוטוקול זה כולל את ניתוקה של תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע וזיהוי של שינויים באחוזים CSC בתאים הפוכה על ידי cytometry זרימה.

Introduction

סרטן כבר מובילה סיבת המוות, גורם מהווה נטל כלכלי כבד על מדינות ברחבי העולם1. סרטן השד מדרג גבוה מבחינת שכיחות ותמותה בחולים הנשי בין כל סוגי הסרטן1. בשל הטרוגניות סרטן, בשילוב של תרופות בדרך כלל משמש כימותרפיה כדי להשיג סרטן התא מוות2,3,4. עם זאת, מאז תרופות כימותרפיות נפוצים לעתים קרובות למקד דנ א5,6, חלבון סינתזה7,8 ו/או microtubule dynamics9, במהירות גוברת תאים הם מושפעים ביותר בזמן השבתה הדרגתית תאים כגון סרטן תאי גזע (CSC) s הם בדרך כלל פחות מושפעת10. CSCs הם, לפיכך, סביר יותר לשרוד לאחר הטיפול, כשבסופו מאוחר יותר עמידות לתרופות, סרטן נסיגה10,11. ומכאן, חיסול של CSCs הפך להיות נושא חשוב לטיפול בסרטן, המחקר על המקור של CSCs הוא הכרחי.

מחקרים נוספים על התופעה של אפופטוזיס היפוך בוצעו ב מהעשור האחרון12,13,14,15,16,17,18 , 19. לפני הופעתה של המושג הזה, זה נרחב התקבלה כי תאים בלתי הפיך עוברים אפופטוזיס לאחר קספאז ההפעלה. Caspases הם משפחה של אנזימים חלבונים ממלאים תפקידים מרכזיים בשלבים ייזום וביצוע של אפופטוזיס, כולל את היווצרות מוות מורכבים, את המחשוף של סובסטרטים במורד הזרם20. הפעלה של התליין caspases כגון קספאז 3 או קספאז 7 נחשב כמו "נקודת האל חזור" אפופטוזיס21. עם זאת, החוקרים לאחרונה הבחינו כי היפוך אפופטוזיס מופיעה במבחנה, ויוו, במהלך אילו תאים יכולים להתאושש אפופטוזיס גם לאחר קספאז הפעלה12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. יתר על כן, תכונות אגרסיביות כגון עמידות גבוהה יותר משרן אפופטוטיים להיפגע המקורי, invasiveness גבוהה יותר מזוהים ב סרטן הפוכה תאים15. לפיכך, הוצע כי אחוז תאים דמויי CSC יהיה גבוה יותר בקרב האוכלוסייה הפוך בהשוואה לתאי לא מטופל, בסופו של דבר לתרום התכונות מהעטלפים לאחר היפוך אפופטוזיס18.

בעבר, מאמצים רבים נעשו כדי לעקוב אחר אפופטוזיס היפוך במבחנה וחשוב יותר, אין ויוו, אשר במידה רבה לעזור המאשרת האוניברסליות של זה תהליך16,17,19. עם זאת, מחקר מערכתית על ההשלכות של תאים הפוכה לוקה בחסר בשל הבידוד משביעת רצון של תאים שעברו באמת היפוך אפופטוזיס. אין צורך לרכוש בתאים אפופטוטיים להיפגע טהור ולשחזר אותם ללימוד נוסף. לפיכך, אנו להשתמש בסמן באופן מסורתי מקובל היטב של התליין קספאז הפעלת הסמן של ה "נקודת האל חזור"21 של אפופטוזיס ולנצל תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) להפלות מופעל קספאז תאים צבעונית עם צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7. לצבוע מקושר covalently רצף של חומצות אמיניות קצר, DEVD, אשר ניתן לזהות ביקע מאת פעיל caspases 3/7. המחשוף מסייעת לשחרור לצבוע, אשר translocate מ ציטוזול את הגרעין איפה זה נקשר ל- DNA ופולט קרינה פלואורסצנטית חזקה. נוהל זה מונע שימוש בצובר תא אוכלוסייה שבו כמה תאים עשויים לא עברו אפופטוזיס.

CSCs או תאי הגידול. מתחילה זוהו בגידולים מוצקים רבים באמצעות יחיד או שילוב של מספר marker(s) משטח ומספרים מעט מאוד של תאים אלה מספיקים כדי טופס גידולים עכברים immunodeficient22,23, 24,25,26,27. שילוב של CD44 CD24 כבר בשימוש נפוץ מחקרים השד CSC, CD44+/CD24– תאים הוגדרו השד CSCs26,27,28,29 , 30. לאחרונה, ערכנו סדרת ניסויים כדי לאשר את היחסים המוצע בין היפוך אפופטוזיס CSCs ומדגימים כי תאים סרטניים בשד הפוכה צבר מוגברת להיוות הגידול היכולת במבחנה ויוו עם אחוז גבוה של תאים עם סמנים CSC18. למרות שאנחנו לא יכול לכלול את האפשרות כי השד CSCs לשרוד טוב יותר, ובכך להשיג מועשר לאחר היפוך אפופטוזיס, חשוב, כאשר אנחנו לבודד תאים סרטניים שאינם-גזע ונושא אותם אפופטוזיס היפוך, CSC יתעוררו בגזע במקור הלא- אוכלוסיית תאים סרטן, רומז הלא-גזע סרטן תאים יכולים לתרום העלייה באחוזים של CSCs במהלך היפוך אפופטוזיס.

מאמר זה מטרתו להדגים את המעבר מתאי גזע ללא סרטן השד תאים דמויי CSC בשד לאחר היפוך אפופטוזיס, לזהות מעבר זה על-ידי cytometry זרימה. תאים שאינם-גזע סרטניים בשד מוכנים בתחילה על-ידי בידוד CD44–/CD24+ השד תאים סרטניים על ידי FACS. לאחר מכן, אפופטוזיס הוא המושרה, אושר על ידי שינויים מורפולוגיים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, בתאים אפופטוטיים להיפגע מתויג באופן חיובי על ידי צבע ירוק זיהוי קספאז 3/7 מבודדת על ידי FACS, תרבותי נוסף בהיעדר אפופטוטיים להיפגע inducers עבור היפוך אפופטוזיס. התאים הפוך ואז מוכתמים CSC סמני לאחר 7 ימים של החלמה לניתוח cytometric זרימה. תאים עם CD44+/CD24 סמנים– מחדש מופיעים באוכלוסייה הפוכה, רומז כי המעבר מתאי גזע ללא סרטן תאים דמויי CSC אירעה במהלך היפוך אפופטוזיס.

היפוך אפופטוזיס נצפתה סרטן מרובות שורות תאים, כמו גם תאים נורמליים העיקרי מטופלים עם גירויים שונים מוות חוץ גופית12,13. תהליך זה גם הוביל ב דרוזופילה דגם ויוו16,17,19. ניתן לקבל הרבה מידע לגבי המנגנון הבסיסי של relapse סרטן מודלים מחלות סרטן שונות, המקור של CSCs באמצעות הטכניקה כמתואר בכתב היד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת השד הלא-גזע תאים סרטניים

  1. תרבות MCF-7, מד א-MB-231 בתאים 10 מ"ל נטולת פנול אדום בינוני רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) בקערה 100 מ מ. תרבות T47D ב- 10 מ"ל נטולת פנול אדום בינוני RPMI 1640 בתוספת 2 מ מגלוטמין, 10% חום-להשבית FBS, ו- 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין (PS) בקערה 100 מ מ. התרבות תאים ב- 37 מעלות צלזיוס 5% CO2/95% אוויר תא תרבות חממה.
    הערה: פנול אדום משפיע על זיהוי מבוסס פלורסצנטיות, אבל יש גם השפעה פוטנציאלית על הצמיחה של תאים סרטניים בשד עקב שלה אפקטים דמויי אסטרוגן31. לדוגמה, פנול אדום יכול לעורר קולטני פרוגסטרון וצמיחה של תאים MCF-731. זה גם יכול להמריץ את הצמיחה של תאים T47D31.
  2. שטיפת תאים עם 2 מ"ל של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) פעמיים. להוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA MCF-7 ו מד א-MB-231 או 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתאים T47D.
    הערה: הריכוז של טריפסין-EDTA הדרושים עבור הפרדת תאים בין סוגי תאים של סרטן השד שונים משתנים בזמן ריכוז בלתי הולם עלול להשפיע על הדפוס ביטוי של כמה סימונים פני שטח התא כגון CD44 ו- CD2432.
  3. תרבות הכלים עבור 5 דקות ב 37 ° C תחת אווירה של 5% CO2/95% אוויר. לעתים קרובות בדוק הניתוק של תאים מתחת למיקרוסקופ כדי למנוע תאים עיכול יתר על ידי טריפסין-EDTA.
  4. כאשר למעלה מ- 90% תאים לנתק, הוסף 5 מ של בינוני RPMI הושלמה למנה ' pipette זה על פני שכבת תאים מספר פעמים.
  5. העבר את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    הערה: בדרך כלל, ניתן להשיג בסביבות 6 x 106 תאים מתוך קערה 100 מ מ confluency מגיע ל-70%.
  6. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כדורי-106 תאים/100 μL FACS מאגר (PBS המכיל BSA 0.5% ו- 0.1% אזיד הנתרן) צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  7. לחלק את התאים מספר צינורות. עבור תאים MCF-7, לחלק את התאים צינורות 4: שני isotype שולט, אחד עבור CD24 יחיד מכתים כמו בקרה חיובית CD24 ואחד עבור צביעת כפול.
  8. עבור תאים T47D, לחלק את התאים צינורות 3: שניים עבור פקדים isotype ואחד עבור צביעת כפול.
  9. עבור תאים מד א-MB-231, לחלק את התאים צינורות 4: שני isotype שולט, אחד עבור CD44 יחיד מכתים כמו בקרה חיובית CD44 ואחד עבור צביעת כפול.
  10. צנטריפוגה הצינורות שוב ב 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, ולאחר מכן להוסיף בלוק Fc מדולל 1:50 במאגר FACS.
  11. דגירה הדגימות על קרח למשך 20 דקות בחושך לפני צנטריפוגה ב x 300 גרם וזורקים 4 ° C עבור 5 דק את תגובת שיקוע.
  12. להוסיף fluorochrome מצומדת נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD44 האנושית (PerCP-Cy5.5), CD24 (PE) בבית דילולים 1:40 ו- 1:10 (במאגר FACS) בכפול מכתים קבוצות. עבור פקדים חיובית, להוסיף CD44 (PerCP-Cy5.5) כדי מד א-MB-231 ולהוסיף CD24 (PE) MCF-7 תאים על ריכוז זהה, בהתאמה.
    הערה: השילוב של CD44 וסי24 כבר בשימוש נפוץ השד CSC המחקר26,27,28,29,30.
  13. עבור קבוצות שליטה isotype, להוסיף PerCP-Cy5.5 IgG2b עכבר, κ ב- 1:40 דילול של הפקד isotype נוגדנים CD44 ו PE העכבר IgG2a, κ ב- 1:10 דילול של הפקד isotype עבור CD24 נוגדנים ב 106 תאים/100 μL.
    הערה: Isotype פקדים עבור נוגדנים עניין מומלץ כמו הפקדים שלילי33.
  14. דגירה בדגימות (מתוך שלבים 1.12 ו- 1.13) ב 4 ° C בחושך במשך 30 דקות צנטריפוגה ב x 300 גרם וזורקים 4 ° C עבור 5 דק את תגובת שיקוע.
  15. לשטוף את גלולה פעמיים עם 500 μL של PBS, צנטריפוגה ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  16. Resuspend בגדר ב- 0.5 מ של PBS ואת מסנן דרך רשת ניילון 40 µm לפני הפעלת ב סדרן תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית.
  17. למטרות gating ופיצויים, כתם MCF-7 תאים עם נוגדנים anti-CD24 מצומדת-PE, כתם מד א-MB-231 תאים עם נוגדנים anti-CD44 PerCP-Cy5.5-מצומדת כפקדי חיובי. להשתמש בתאים צבעונית עם פקדים isotype כפקדי שלילי (איור 1).
  18. איסוף תאים עם CD44–/CD24+ סמני צינורות סיבוב המדרגה פוליסטירן 12 x 75 מ מ המכיל 1 מ"ל של אוסף בינונית (ללא פנול אדום RPMI 1640 בינוני בתוספת 20% לא פעיל חום FBS ו- 2% v/v PS). Centrifuge הצינורות 300 x g ו- RT עבור 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
    הערה: כמו CSC תאים בתאי סרטן השד מוגדרים CD44+/CD24– תאים26,27,28,29,30והשד הלא-גזע תאים סרטניים מוגדרים CD44–/CD24+ תאים18 (איור 1).
  19. צלחת תאים שאינם-גזע סרטניים בשד ממוינים בצלחת תרבות המכיל אוסף טרי בינוני לתרבות נוספת ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 תא תרבות חממה.

2. מוות אינדוקציה וזיהוי

  1. להכין 1 מ"מ staurosporine12,34 ב דימתיל סולפוקסיד. עבור קבוצת MCF-7 שטופלו, להוסיף 25 μL של 1 מ מ staurosporine המדיום שהושלמו של תאים MCF-7 כדי להפוך עד 10 מ"ל נפח סופי (2.5 μM staurosporine) צינור חרוטי 15 מ"ל. פיפטה לערבב את התוכן באופן שווה.
  2. הסר את המדיום תרבות מתאי, לשטוף את התאים עם 2 מ של PBS פעם אחת. לאחר מכן להוסיף את 10 מ"ל של מדיום עם 2.5 μM staurosporine MCF-7 תאים עבור 6-אייץ ' לגרום אפופטוזיס תא צפיפות מגיע ל-70% confluency.
  3. להכין 1 מ"מ פקליטקסל35,36 ב דימתיל סולפוקסיד. עבור קבוצת T47D שטופלו, להוסיף 12.5 μL של 1 מ מ פקליטקסל המדיום שהושלמו של תאים T47D כדי לפצות נפח סופי של 10 מ"ל (5 פקליטקסל μM) צינור חרוטי 15 מ"ל. פיפטה לערבב את התוכן באופן שווה.
  4. הסר המדיום התרבות התאים, לשטוף את התאים עם 2 מ של PBS פעם אחת. לאחר מכן להוסיף את 10 מ"ל של מדיום עם פקליטקסל μM 5 התאים T47D עבור h 10 לגרום אפופטוזיס תא צפיפות מגיע ל-70% confluency.
    הערה: צריך להיות מוטבת אינדוקציה והזמן את ריכוז inducers זה לגרום אפופטוזיס בכל פעם שורה חדשה בתא משמשת בפעם הראשונה.
  5. עבור קבוצת MCF-7 שטופלו הממס, להוסיף 25 μL של סטרילי דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) המדיום שהושלמו של תאים MCF-7 כדי לפצות נפח סופי של 10 מ"ל (קרי, 0.25% v/v דימתיל סולפוקסיד) צינור חרוטי 15 מ"ל. פיפטה לערבב את התוכן באופן שווה.
  6. הסר את המדיום תרבות מתאי MCF-7 שטופלו הממס, לשטוף עם 2 מ של PBS פעם. לאחר מכן להוסיף את 10 מ"ל של מדיום עם 0.25% v/v דימתיל סולפוקסיד עבור 6-אייץ ' של הפקד ממס עבור STS.
  7. עבור קבוצת T47D שטופלו הממס, להוסיף 5 μL של דימתיל סולפוקסיד סטרילי המדיום שהושלמו של תאים T47D כדי לפצות 10 מ"ל נפח סופי (קרי, 0.05% v/v דימתיל סולפוקסיד) צינור חרוטי 15 מ"ל. פיפטה לערבב את התוכן באופן שווה.
  8. הסר את המדיום תרבות מתאי T47D שטופלו הממס, לשטוף עם 2 מ של PBS פעם. לאחר מכן, הוסף את 10 מ"ל של מדיום עם 0.05% v/v דימתיל סולפוקסיד עבור 10 h של הפקד ממס עבור פקליטקסל.
  9. כדי לבחון את שינויים מורפולוגיים של תאים שטופלו, כתם תאים עם 50 ננומטר Mitotracker אדום CMXRos ו- 250 ננוגרם למ"ל Hoechst 33342, דגירה עוד כעשרים דקות ב 37 ° C תחת אווירה של 5% CO2/95% אוויר. להתבונן המורפולוגיה תא אפופטוטיים להיפגע טיפוסי תחת 60 x לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (איור 2).
    הערה: מורפולוגיה אפופטוזיס טיפוסי כולל הצטמקות תא, קרום blebbing, פיצול המיטוכונדריה גרעיני התעבות אבל עם הממברנה התאית שלם12,13,14,15 18, ,37.

3. בידוד של מוות תאים וההליך היפוך אפופטוזיס

  1. כתם הן את מוות משרן, הממס-שטופלו MCF-7 או תאים T47D עם צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7 μM 3-ריכוז תא /mL610 בחושך למשך 30 דקות ב 37 ° C תחת אווירה של 5% CO2/95% אוויר.
  2. לסנן את התאים דרך רשת ניילון 40 µm לפני הפעלת ב סדרן למיון.
  3. עבור gating למטרות, תחילה שער האוכלוסייה הגדולים (R1), להוציא את הלכלוך ידי הגרף נקודות עם פיזור קדימה ופיזור צד (איור 3).
  4. השתמש התאים ללא טיפול מבלי להוסיף לצבוע קספאז-3/7 ירוק זיהוי כפקד שלילי לשער האזור שלילי (R2) (איור 3 א).
  5. להשתמש בתאים שטופלו staurosporine12,18,34 במשך 24 שעות ביממה, מוכתם לצבוע כפקד חיובי לשער האזור חיובי (R3) (איור 3B).
  6. איסוף תאים חיוביים (R3) הקבוצות שטופלו משרן צינורות סיבוב המדרגה פוליסטירן 12 x 75 מ מ המכיל 1 מ"ל של אוסף בינוני (כמו המדיום אוסף בשלב 1.18) (דמויות 3ג-3D). Centrifuge הצינורות 300 x g ו- RT עבור 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  7. איסוף תאים שלילי (R2) מקבוצות שטופלו ממיס צינורות סיבוב המדרגה פוליסטירן 12 × 75 מ מ עם 1 מ"ל של אוסף בינוני כמו שלב 3.6 (3 דמויותה-3F).
    הערה: חלק קטן של תאים (כמו 10,000 תאים) ניתן לאסוף ולהשתמש הפעל מחדש ב סדרן כדי לבדוק את התבנית של סמן caspases פעיל. אם מעל 90% של תאים ממוינים שטופלו הממס מוצגים באזור קספאז שלילי או מעל 90% של תאים ממוינים שטופלו משרן מוצגים באזור קספאז-חיובית, תאים שנאספו אלה מאמינים כי יחסית טהורה (דמויות 3 C-3F). אחרת, באזור המיון ו/או את סדרן יש לאפס.
  8. Resuspend התאים ממוינים אוסף טרי בינוני, זרע אותם תרביות רקמה. ובכן 12 צלחות ותרבות ב 37 ° C תחת אווירה של 5% CO2/95% אוויר במשך 7 ימים עבור היפוך אפופטוזיס.

4. אישור של אפופטוזיס מופעל קספאז תאים

  1. מערבבים 10 מ מ HEPES, 140 מ מ NaCl ו- 2.5 מ"מ CaCl2 להכין מאגר מחייב annexin (pH 7.4). לאחסן המאגר ב 4 ° C ולהימנע המאגר לחשוף לאור.
  2. הכן הפתרון עובד µg/mL 100 של propidium יודיד (PI) על ידי המדללת 5 µL של 1 mg/mL PI פתרון מניות ב- 45 µL מחייב annexin המאגר. לאחסן את הפתרון ב 4 ° C ולהימנע הפתרון לחשוף לאור.
    הערה: PI מוטגן פוטנציאליים, צריך להיות מטופל לטיפול.
  3. הכינו את התאים שטופלו משרן כמו צעדים 2.1-2.5.
  4. לאסוף את משרן שטופלו MCF-7 או את התאים T47D על ידי pipetting המדיום מעל השכבה תא 3-5 x כדי לנתק את התאים. העבר את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל.
  5. צנטריפוגה 300 x g ו- RT עבור 5 דק. להשליך תגובת שיקוע.
  6. Resuspend התאים הושלמה בינונית-ריכוז תא /mL610 1.5 mL microcentrifuge צינור, כתם תאים עם צבע ירוק זיהוי קספאז 3/7 μM 3 בחושך למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  7. צנטריפוגה 300 x g ו- RT עבור 5 דק. למחוק את supernatants.
  8. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח, צנטריפוגה ב x 300 גרם וזורקים 4 ° C עבור 5 דק את supernatants.
  9. Resuspend תאי μL 100 מחייב annexin מאגר עם μL הוסף 5 של המספר המשלים annexin V ו- 1 µL של 100 µg/mL PI הפתרון עובד על כל μL 100 של השעיה תא דגירה התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: Annexin V ו- PI משמשים יחד כדי להדביק תווית בתאים אפופטוטיים להיפגע לזרום cytometry38,39,40.
  10. להוסיף 400 µL מחייב annexin מאגר, לערבב בעדינות. שומרים את הדגימות על הקרח לפני הפעלת על cytometer של זרימה.

5. מדידה של השד תאים דמויי CSC מאת Cytometry זרימה

  1. לקצור את 7-MCF הפוך בשתי הקבוצות משרן או הממס-שטופלו עם 0.05% טריפסין-EDTA. קציר תאים T47D בשתי הקבוצות משרן או הממס-שטופלו או עם 0.25% טריפסין-EDTA כמו צעדים 1.2 עד 1.5.
  2. כתם התאים עם fluorochrome מצומדת נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD44 האנושית (PerCP-Cy5.5), CD24 (PE) כמו שלב 1.12. . בינתיים, מכינים את הפקדים isotype כמו שלב 1.13.
  3. להפעיל את התאים cytometer זרימה ולגלות את אחוז תאים עם CD44+/CD24– סמנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת לצפות את המעבר מן השד הלא-גזע תאים סרטניים לתאי CSC, כמו השד, מיון הראשון של CD44–/CD24+ תאים סרטניים בשד היו נחוצים. עבור שורת תאים MCF-7, אשר בסביבות 0.15% תאים עם סמנים CSC בקרב האוכלוסייה המקורית (איור 1), שלב זה עזר לא לכלול את האפשרות של CSC העשרה במהלך היפוך אפופטוזיס. להיפך, אם היו אין תאים עם סמנים CSC בקרב האוכלוסייה המקורית, כגון עבור תאים T47D (איור 1), הליך המיון יכול להיות מושמט. אכן, gating מושפעות ההגדרה של החיובי ושלילי של כל סמן, אשר ישפיע בסופו של דבר האחוז של CSC נחוש. לכן, הפקדים המתאימים כולל פקדי isotype נוגדנים עניין, פקדים מוכתם יחיד עבור כל סמן צריך להיות בזהירות נבחר, שהוכנו עבור שער התאמה (איור 1).

עם תאי גזע ללא סרטן השד, המודל היפוך אפופטוזיס לאחר מכן היתה אפשרות ליצור. שינויים מורפולוגיים טיפוסי יכול להיות שנצפו לאחר הוספת inducers אפופטוטיים להיפגע, תאים צריך להתאושש אפופטוזיס עם מורפולוגיה דומה לאחר נסיגת סמים (איור 2). קספאז-3/7 מזהה את רצף חומצות אמיניות DEVD לצבוע זיהוי ירוק קספאז-3/7, הצורות פעיל של קספאז-3/7 מסוגלים לבקע זה אתר41. במקור, ידי קרינה פלואורסצנטית של קספאז-3/7 ירוק זיהוי לצבוע ב ציטוזול חלש בזמן אם לצבוע הוא ביקע, translocated את הגרעין, האות פלורסצנטיות הגברה לאחר שלה מחייב הדנ א בגרעין. ההבדל הברור הזה יכול להיות מאופיינת cytometry זרימה. לפיכך, תאים אלה מופעל קספאז יכול להיות מתויג, מיינו בהתבסס על שלהם גבוה יותר קרינה פלואורסצנטית בעוצמה השוואת לאלה ללא קספאז הפעלה (דמויות 3A 3D). במהלך תהליך אינדוקציה אפופטוטיים להיפגע, פקד המתאים הממס חייב להיות כלול: נאספו שטופלו הממס תאים ללא הפעלה קספאז (דמויות 3E, 3F) כדי לא לכלול את האפשרות כי ההליך FACS או הממס עצמו. הגורם למעבר, אם בכלל.

על מנת להראות כי ממוין FACS מופעל קספאז תאים אלה היו אכן מוות, אנחנו שיתוף מוכתם תאים אלה עם Annexin V ו- PI. אחד השינויים בשלב מוקדם בתאים אפופטוטיים להיפגע הוא רוברטסונית של phosphatidylserine מהצד הפנימי של קרום פלזמה אל פני השטח החיצוני של התא13,38,39,40; את הוצאתו של phosphatidylserine יכול יזוהו על-ידי Annexin V. אמנם שינוי זה אינו ייחודי אפופטוזיס, PI ניתן להבחנה אפופטוזיס של נמק בהתבסס על התקינות של קרום התא. לפיכך, תאים עם איגוד Annexin V אך ללא PI מכתים נחשבים בתאים אפופטוטיים להיפגע. מופעל קספאז תאים בקבוצות טיפול משרן אפופטוטיים להיפגע נמצאו פאי ולהיות Annexin V חיובי שלילי, רומז שהם היו מוות תאים (איור 4).

לאחר המיון השני המבוסס על הפעלת קספאז בתאים אפופטוטיים להיפגע, תאים אלה אפופטוטיים להיפגע היו נאספים, לאחר מכן תרבותי עבור שחזור. התאים הפוך היו בחיים הצליחו לצרף בתחתית המכל תרבות וממשיכים להתרבות. לאחר 7 ימים, כתמים של CD44, CD24 בוצעה בתאים הפוכה בזמן פקדים הוכנו באותו הזמן כמו בעבר. לעומת הקבוצות שטופלו הממס (איור 1), ניתוח תזרים cytometric הראה שהיו אירועים (תאים) המופיעים CD44+/CD24– רביע בקרב האוכלוסייה תא גזע ללא סרטן השד הפוכה (איור 1) . מאז כבר שללנו תאים עם CD44+/CD24– מראש אפופטוזיס, רק CD44–/CD24+ תאים שאינם-גזע סרטניים בשד נבחרו, אלה CD44+/CD24– CSC כמו תאים יכול להיות רק transited מתאי גזע ללא סרטן השד במהלך היפוך אפופטוזיס.

Figure 1
איור 1: נציג השד CSC סמן מכתים בתאי סרטן השד ב cytometry זרימה.
MCF-7, מד א-MB-231 ו T47D היו מוכתמים fluorochrome מצומדת נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD44 האנושית (PerCP-Cy5.5), CD24 (PE). התאים היו קודם פיקוח על-ידי פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס) (P1) כדי לא לכלול פסולת. Isotype פקדים CD24 ו CD44 שימשו כפקדי שלילי עבור CD24 ו- CD44 בהתאמה. תאים MCF-7 מוכתם CD24 שימש בקרה חיובית CD24, תאים מד א-MB-231 מוכתם CD44 שימש לשלוט CD44. תאים סרטניים בשד MCF-7 Non-גזע (P2) היו מיון. תאים ממוינים ותאים T47D האלה היו נענשים הליך היפוך אפופטוזיס. כמו CSC (CD44+CD24–) תאים הופיע לאחר היפוך אפופטוזיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: שינויים מורפולוגיים של תאים סרטניים בשד תחת אינדוקציה גירוי אפופטוטיים להיפגע.
תאים סרטניים בשד הראו אפופטוטיים להיפגע אופייני שינויים מורפולוגיים כולל הצטמקות תא, קרום blebbing, פיצול המיטוכונדריה (צהוב חצים הדמויות בשחור-לבן), גרעיני התעבות. גרעינים (בכחול): גרעין של תאים מוכתם Hoechst 33342 הוצגו בצבע כחול. המיטוכונדריה (בורוד): המיטוכונדריה של תאים מוכתם Mitotracker אדום CMXRos הוצגו בצבע ורוד. הממוזג: דמויות התמזגה בצבעים dual מציג המיטוכונדריה וגם גרעינים. המיטוכונדריה (באפור): המיטוכונדריה של תאים מוכתם Mitotracker אדום CMXRos הוצגו במונוכרום. חדות התערבות דיפרנציאלית (DIC): תאים שלמים. העליון: MCF-7 תאים שטופלו staurosporine (STS) עבור 6-אייץ ' אז התהפכה על ה 24 התחתונה: T47D תאים שטופלו פקליטקסל עבור 10 h עם היפוך עבור סרגלי קנה מידה ה' 24 = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ניתוח הפעלה קספאז לפי סדרן. (א) וללא רבב MCF-7 תאים ללא טיפול staurosporine (STS) שימשו שליטה שלילי (R2). (B) MCF-7 תאים שטופלו staurosporine (STS) עבור ה 24 תאים באזור R3 היו נחשבים התאים קספאז מופעל. (ג) MCF-7 תאים שטופלו staurosporine (STS) עבור ה 6 תאים באזור R3 היו ממוין FACS. (ד) ממוין FACS מופעל קספאז MCF 7 תאים לאחר טיפול staurosporine (STS) 6-אייץ ' היו הפעל מחדש. (E) שטופלו דימתיל סולפוקסיד MCF-7 תאים. (F) ממוין FACS תאים ללא הפעלה קספאז לאחר טיפול דימתיל סולפוקסיד 6-אייץ ' היו הפעלה מחדש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Annexin V ו- PI מכתים וכהים מופעל קספאז cytometry זרימה. תאים MCF-7 ו- T47D היו קודם כל פיקוח על-ידי פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס) (P1) כדי לא לכלול פסולת. תאים שהיו מטופל עם מוות inducers וללא כל מכתים שימשו כפקדי שלילי. עבור תאים שטופלו inducers אפופטוטיים להיפגע, נבחרו מופעל קספאז תאים [קרי, ירוק קספאז-3/7 חיובי תאים] (P3) כדי להראות את עוצמת קרינה פלואורסצנטית Annexin V ו- PI מכתים. כל התאים חיובי קספאז-3/7 ירוק היו חיוביים Annexin V ו- PI שלילי, רומז שהם היו אפופטוטיים להיפגע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה ישירה וברורה לגילוי את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לתאים CSC, כמו השד כתוצאה היפוך אפופטוזיס. אישור של CSC מאפייני תאים הפוכה אלה יכול להיות בסיוע באמצעות אניחוץ גופית n mammosphere היווצרות assay, ויוו xenograft השתלת עכברים immunodeficient18,24,26 ,27,42,43,44,45. כאן, אנו משתמשים בשתי שורות תאים של סרטן השד, אך פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עוד ב אחרים שורות תאים של סרטן השד. מאז התופעה בולטת בקו התא סרטן השד במספר פחות אשר CD44+/CD24– תאים קיימים במקור, הוא הציע לבחור שורות תאים כגון מד א-MB-231 שבו ישנם יותר מ- 90% של CD44+ תאים.

מאז gating חשוב בניתוח זרימה, פקדים נאותה ומספיק צריך להיות מוכן מראש. לצורך מיון, הטוהר צריך גם להיות נחוש לפני האוסף בפועל של תאים. לדוגמה, לדעת את הטוהר של המיון הראשון, רק חלק קטן של תאים (כגון 10,000 תאים) ניתן לאסוף ולהשתמש הפעל מחדש ב סדרן כדי לבדוק את התבנית של סמני CSC. אם מעל 90% מאלה ממוינת תאים הם CD44–/CD24+ לא יוצגו ב- CD44+/CD24– באזור, התאים שנאספו מאמינים כי יחסית טהורה (איור 1). אם תאים מופיע ב- CD44+/CD24– אזור, באזור המיון ו/או בסדרן מאופס. מיון צריך להתנהל סטרילי ככל האפשר על-ידי שימוש של סדרן בתוך התרבות הוד או הוספת אנטיביוטיקה אוסף, תרבות בינונית עבור תאים ממוינים.

סוגי תאים סרטן שאינו סרטן השד גם ניתן לבחור, המושרה עם גירויים שונים אפופטוטיים להיפגע להקים דגם היפוך אפופטוזיס. בזמן ההפעלה קספאז יכול להתגלות מוקדם ככל 2 h, הפעם המיון צריך להיות נבחרים בקפידה. מאז תאים באוכלוסייה אינם מסונכרנים, בשלב מסוים פעם אחת, כל תא אולי הגיע בשלבים שונים של אפופטוזיס. בינתיים, תאים ממשיך למוות מוות לאחר קספאז ההפעלה. לכן, אם inducers יוסרו רק כאשר כל התאים מגיעים קספאז הפעלה, כמה תאים אולי כבר הגיע השלב של ה-DNA פיצול, שהופך אותם אין אפשרות לשחזר גם לאחר הסרת משרן. הוא לא הציע כדי לגרום אפופטוזיס זמן רב מדי להשיג אחוז גבוה יותר של תאים מופעל קספאז אבל עם העלות של השארת מספר גדול של תאים מתים אחרי אוסף. . חוץ מזה, זמן הדגירה וריכוז לצבוע שמתייג תאים מופעל קספאז צריך להיות מותאם בכל פעם שורה חדשה בתא משמשת בפעם הראשונה.

חשש נוסף החל בהצלחה גרימת היפוך אפופטוזיס בתאים אפופטוטיים להיפגע הוא קצב התאוששות נמוך של התאים (בדרך כלל פחות מ 10%). התאים עברו אפופטוזיס פלוס ההליך מיון; לכן, הם דורשים טיפול עדין מאוד במהלך צנטריפוגה והעברה על השלבים ואוסף resuspension. בנוסף, הבחירה של צלחת או מאכל בשימוש לתרבות עוקבות לא צריך להיות תלויים על מספר התאים שנאספו אלא על המספר הצפוי של שחזורי. אחרת, התאים ניתן היה להקצות גם בדלילות הפוך ולצמוח מחדש. נתון זה סרטן שאינו-גזע תאים לגדול במהירות גבוהה יותר, עשוי להשתלט על האוכלוסייה התא מחדש בשמו החוקי46, הפעם זיהוי לא צריך להיות רחוק מדי. מהיום הראשון שחזור.

השד מבודד הראשון זו השיטה הלא-גזע תא סרטני ולאחר מכן מחיל אותם עבור מוות אינדוקציה שבו נעשה מיון השני מבוסס על הפעלת קספאז לפני התאים להיות התאושש. Re-המראה של השד תאים דמויי CSC באוכלוסייה הפוכה מזוהה על ידי cytometry זרימה. מאז הליך היפוך אפופטוזיס במבחנה מבודד התאים הסרטניים מוות טהור, מספר ניסויים עכשיו יכול להתבצע כדי להבין את ההשלכות של תאים אלה ממש הפוך. מלבד תאים סרטניים בשד, סוגי גידולים מוצקים אחרים, כמו גם המטולוגיות ממאירות כי הם עם סמנים CSC ידוע יכול להילמד, גירוי מוות שונים יכול לשמש. לפיכך, שיטה זו היא להארכה וישימים בהיקף דייר של סרטן החקירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי חדשני בטכנולוגיית קרן של חדשנות טכנולוגיה הנציבות: מימון תמיכה של המדינה מפתח מעבדה של Agrobiotechnology (CUHK), קרן מחקר Lo ביו Kwee-סאונג, קרן Hysan לי. Y.X. נתמכה על ידי studentship לתואר שני מ- CUHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40 μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus -
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

Tags

חקר הסרטן גיליון 143 תאי הגזע הסרטניים סרטן השד אפופטוזיס היפוך אפופטוזיס cytometry זרימה תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון
גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. … More

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal. J. Vis. Exp. (143), e58642, doi:10.3791/58642 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter