Summary
在这里, 我们提出了一个方案, 以分离凋亡乳腺癌细胞通过荧光激活细胞分类, 并进一步检测转变乳腺癌非干细胞到乳腺癌干细胞样细胞后, 细胞凋亡逆转流式细胞术。
Abstract
癌症复发长期以来一直由肿瘤学家进行研究, 而其潜在机制尚不清楚。最近, 我们和其他人发现, 一种叫做细胞凋亡逆转的现象会导致不同刺激下各种细胞模型的致瘤性增加。以前的研究重点是在体外和体内跟踪这一过程;然而, 真正的逆转细胞的分离尚未实现, 这限制了我们对细胞凋亡逆转后果的理解。在这里, 我们利用一种里海----绿色检测染料, 在凋亡诱导后, 用活化的酪蛋白标记细胞。具有正信号的细胞通过荧光激活细胞分选 (facs) 进一步进行排序, 以进行恢复。共聚焦显微镜下的形态学检查有助于证实流式细胞仪前的凋亡状态。致瘤性的增加通常可归因于癌症干细胞 (csc) 样细胞的百分比升高。此外, 鉴于乳腺癌的异质性, 确定这些 cscc 样细胞的来源对癌症治疗至关重要。因此, 我们准备乳房非干细胞之前, 触发细胞凋亡, 分离卡斯帕塞激活细胞, 并执行细胞凋亡逆转程序。流式细胞术分析显示, 乳腺 csc 样细胞在逆转组重新出现, 表明在细胞凋亡逆转过程中, 乳腺 csc 样细胞从乳腺癌非干细胞中转移。总之, 该协议包括分离凋亡乳腺癌细胞和检测 csc 百分比的变化, 通过流式细胞术。
Introduction
癌症一直是导致死亡的主要原因, 给世界各国造成沉重负担1。乳腺癌在所有类型癌症1的女性患者中的发病率和死亡率都名列前茅。由于癌症的异质性, 药物的组合通常用于化疗, 以实现癌细胞死亡2,3,4。然而, 由于常见的化疗药物通常以 dna5,6、蛋白质合成7,8和微管动力学9 为目标,快速生长的细胞受影响最大。肿瘤干细胞等静止细胞受影响通常较小.因此, csc 在治疗后更有可能存活, 这后来导致耐药和癌症复发1 0、1 1.因此, 消除 csc 已成为癌症治疗的一个重要课题, 研究 csc 的起源是必要的。
近十年来, 对细胞凋亡逆转现象进行了更多的研究:12、13、14、15、16、17、18,19. 在这一概念出现之前, 人们普遍认为, 细胞在酪蛋白酶激活后将不可逆转地发生细胞凋亡。酪蛋白是一种蛋白质酶家族, 在细胞凋亡的启动和执行阶段发挥着关键作用, 包括凋亡复合体的形成和下游底物20的裂解。激活行刑细胞的 caspassase, 如酪蛋白酶3或酪蛋白酶7已被认为是细胞凋亡的"不归点" 21。然而, 研究人员最近观察到, 细胞凋亡逆转在体外和体内都会发生,在此过程中, 即使在 caspase 激活 12,13, 14 之后, 细胞也能从细胞凋亡中恢复,15,16,17,18,19. 此外, 在逆转的癌细胞15中检测到了对原始凋亡诱导剂的更高抵抗力和更高的侵入性等攻击性特征。因此, 有人提出, csc 样细胞的百分比将高于未治疗的细胞, 最终有助于更恶性的特征后, 细胞凋亡逆转 18。
此前, 已经做出了许多努力来跟踪细胞凋亡逆转的体外, 更重要的是, 在体内, 这大大有助于确认这一过程的普遍性 16,17,19。然而, 由于真正经历了细胞凋亡逆转的细胞隔离不能令人满意, 因此缺乏对逆转细胞后果的系统研究。有必要获得纯化的凋亡细胞并将其恢复, 以便进一步研究。因此, 我们使用传统上公认的行刑者酪蛋白酶活化标记作为细胞凋亡的 "不归点"21的标记, 并利用荧光激活细胞分选 (facs) 来鉴别被染色的酪蛋白酶活化细胞用里海---------------------------------该染料共价地连接到一个短的氨基酸序列 devd, 它可以被活性的酪蛋白识别和裂解。裂解有助于释放染料, 它将从细胞溶胶转移到细胞核, 在那里它与 dna 结合并发出强烈的荧光。此过程避免使用大量细胞群, 其中一些细胞可能没有经历过细胞凋亡。
在许多实体肿瘤中, csc 或肿瘤引发细胞被发现, 使用的是单个或多个表面标记的组合, 这些细胞的数量很少足以在免疫缺陷的小鼠22,23形成肿瘤。 24,25,26,27。cd44 和 cd24 的组合已被广泛用于乳腺癌研究, cd44+/cd24-细胞被定义为乳房 csc26,27,28,29,30. 最近, 我们进行了一系列实验, 以证实细胞凋亡逆转与 csc 之间的关系, 并证明逆转乳腺癌细胞在体外和体内获得了更大的肿瘤形成能力。csc 标记18的细胞百分比升高。虽然我们不能排除乳房 csc 更好地存活, 从而在细胞凋亡逆转后得到丰富的可能性, 但重要的是, 当我们分离非干细胞并使其发生细胞凋亡逆转时, csc 就会出现在最初的非干细胞中癌细胞群, 这表明非干细胞可以促成在细胞凋亡逆转过程中 csc 的百分比增加。
本文旨在展示细胞凋亡逆转后从乳腺癌细胞向乳腺 csc 样细胞的过渡, 并通过流式细胞术检测这种转变。乳腺非干细胞最初是通过流式细胞仪分离 cd44-/cd24+乳腺癌细胞来制备的。然后, 细胞凋亡是由形态学变化在显微镜下诱导和确认的。随后, 利用流式细胞仪分离了 ccasase 的凋亡细胞阳性标记, 并在没有凋亡诱导剂的情况下进行进一步培养, 以实现细胞凋亡逆转。经过7天的流式细胞仪分析, 将倒立的细胞用 csc 标记染色。具有 cd44+/cd24标记的细胞在逆转的人群中重新出现, 这表明在细胞凋亡逆转过程中发生了从非干细胞向 csc 样细胞的过渡。
在多种癌细胞系以及在体外使用不同凋亡刺激治疗的正常原代细胞中观察到细胞凋亡逆转 12,13。这一过程也在体内16、17、19 中被追踪到. 通过使用本手稿中所述的技术, 可以获得许多关于不同癌症疾病模型中癌症复发的潜在机制和 csc 起源的信息。
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Protocol
1. 乳腺癌非干式癌细胞的制备
- 培养 mcf-7 和 mda-mb-231 细胞在10毫升的无酚罗斯威尔公园纪念研究所 (rpmi) 1640 培养基补充10% 热灭活胎牛血清 (fbs) 在一个100毫米的菜。在10毫升的苯酚红素 rpmi 1640 培养基中培养 t47d, 辅以 2 mm l-谷氨酰胺、10% 的热灭活 fbs 和 1% v/v 青霉素-链霉素 (ps), 在100毫米的盘子中。在37°c 空气细胞培养孵化器中培养细胞,在37°c 下培养细胞2/95%。
请注意:酚红影响荧光检测, 但由于其雌激素样的作用 31, 对乳腺癌细胞的生长也有潜在的影响.例如, 苯酚红可以刺激孕激素受体和 mcf-7 细胞31的生长。它还可以刺激 t47d 细胞31的生长。 - 用2毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗细胞两次。在 mcf-7 和 mda-mb-231 或 2 ml 中加入0.05% 的胰蛋白酶 edta 到 t47d 细胞中的2毫升。
请注意:不同乳腺癌细胞类型间分离细胞所需的胰蛋白酶 edta 浓度各不相同, 而不适当的浓度可能会影响 cd44 和 cd2432等某些细胞表面标记物的表达模式。 - 在 5% co/95% 空气的气氛下, 在37°c 下培养盘子 5分钟。经常在显微镜下检查细胞脱离, 以防止细胞通过胰蛋白酶-edta 过度消化。
- 当超过90% 的细胞分离时, 在盘子中加入5毫升完成的 rpmi 培养基, 并将其在细胞层表面上进行几次移液。
- 将细胞转移到一个15毫升的锥形管和离心机在 300 x g和4°c 下5分钟。
请注意:通常情况下, 当融合达到70% 时, 大约 6 x10 6 细胞可以从100毫米的盘中获得。 - 将上清液丢弃, 并在 1.5 ml 微离心管中的 fbs 中, 将颗粒重新悬浮在 10 6 细胞100μl 的流式细胞酶缓冲液 (pbs 中含有 0.5% bsa 和0.1% 的氮化钠) 中。
- 把细胞分成几个管子。对于 mcf-7 细胞, 将细胞分为4个管: 2个用于同型对照, 1个用于 cd24 单染色, 作为 cd24 阳性对照, 1个用于双染色。
- 对于 t47d 细胞, 将细胞分为3个管: 两个用于同型控制, 另一个用于双重染色。
- 对于 mda-mb-231 细胞, 将细胞分为4个管: 2个用于同型对照, 1个用于 cd44 单染色, 作为 cd44 阳性对照, 1个用于双染色。
- 在 300 x g和4°c 下再次离心管 5分钟, 丢弃上清液, 然后在流式细胞仪缓冲液中加入 fc 块稀释的1:50。
- 在黑暗中将样品在冰上加氢 20分钟, 然后在 300 x g和4°c 离心5分钟。
- 在双染色组中加入针对人类 cd44 (percp-cy5.5) 和 cd24 (pe) 的氟铬共轭单克隆抗体 (1:40 和1:40 稀释 (在流式细胞仪缓冲液中)。对于阳性对照, 在 mda-mb-231 中加入 cd44 (MDA-MB-), 并在相同浓度下分别在 mcf-7 细胞中添加 cd24 (pe)。
请注意:cd44 和 c24 的结合已被广泛用于乳腺癌研究26,27,28, 29,30。 - 对于同型对照组, 在1:40 稀释时加入 percp-cy5.5 小鼠 igg2b, 作为 cd44 抗体和 pe 小鼠 IgG2b 的同型对照, 在1:40 稀释时作为 cd24 抗体的同型对照, 在 106细胞/100μl。
请注意:对感兴趣的抗体的异型控制被推荐为阴性对照 33。 - 在黑暗中将样品 (从步骤1.12 和 1.12) 中培养 30分钟, 在 300 x g和4°c 离心5分钟。
- 用500μl 的 pbs 和离心机在 300 x g和4°c 下清洗两次颗粒5分钟。
- 将颗粒重新装入 0.5 ml 的 pbs, 并通过40μm 的尼龙网过滤, 然后在荧光激活的细胞分选器上运行。
- 为门控和补偿目的, 用 pe 结合抗 cd24 抗体染色 mcf-7 细胞, 用 percp-cy5.5-共轭抗 cd44 抗体染色 mda-mb-231 细胞作为阳性对照。使用使用具有同型对照染色的细胞作为阴性对照 (图 1)。
- 收集细胞与 cd44-/cd24+标记在圆底聚苯乙烯 12 x 75 毫米管含有1毫升的收集介质 (苯酚红红 rpmi 1640 补充20% 热灭活 fbs 和 2% v/v ps)。以 300 x g和 rt 离心管 5分钟, 并丢弃上清液。
请注意:乳腺癌细胞中的 cscc 样细胞被定义为 cd44+/cd24-细胞26、27、28、29、30和乳腺癌非干细胞被定义为 cd44-/cd24+细胞18 (图 1)。 - 将已分类的乳房非干细胞放入含有新鲜收集培养基的培养皿中, 在25°c 条件下, 在 5% co 2 细胞培养孵化器中进一步培养。
2. 凋亡诱导和检测
- 在 dmso 中准备 1 mm stauro研 ine12,34 。对于经过处理的 mcf-7 组, 在 mcf-7 细胞的培养基中加入 25μl 1 mm 的 staurosporine, 在 15 ml 锥形管中构成高达10毫升的最终体积 (2.5μm staurosporine)。将内容均匀混合的移液器。
- 从细胞中取出培养基, 用2毫升的 pbs 清洗细胞一次。然后将2.5 微米足生素培养基的10毫升加入 mcf-7 细胞 6小时, 诱导细胞密度达到70% 的融合时凋亡。
- 准备 1 mm 紫杉醇 35,36在 dmso.对于经过处理的 t47d 组, 在 t47d 细胞的培养基中加入 12μμl 1 mm 紫杉醇, 在15毫升锥形管中构成10毫升 (5μm 紫杉醇) 的最终体积。将内容均匀混合的移液器。
- 从细胞中取出培养基, 用2毫升的 pbs 清洗细胞一次。然后将5μm 紫杉醇培养基的10毫升加入 t47d 细胞 10小时, 当细胞密度达到70% 的融合时, 诱导细胞凋亡。
请注意:当首次使用新的细胞系时, 应优化诱导细胞凋亡的诱导时间和诱导剂的浓度。 - 对于溶剂处理的 mcf-7 组, 在 mcf-7 细胞的完整培养基中加入25μl 的二甲基亚硫醚 (dmso), 使其最终体积达到10毫升 (即 0.25% v/v dmso), 在 15 ml 锥形管中。将内容均匀混合的移液器。
- 从溶剂处理的 mcf-7 细胞中去除培养基, 用2毫升的 pbs 清洗一次。然后加入培养基的10毫升, 用 0.25% v/v dmso 6小时作为 sts 的溶剂控制。
- 对于溶剂处理的 t47d 组, 在 t47d 细胞的培养基中加入5μl 无菌 dmso, 使其在 15 ml 锥形管中的最终体积达到10毫升 (即 0.05% v/v dmso)。将内容均匀混合的移液器。
- 从溶剂处理的 t47d 细胞中取出培养基, 用2毫升的 pbs 清洗一次。然后, 加入10毫升的培养基, 0.05% v/v dmso 为10小时的溶剂控制。
- 观察处理细胞的形态变化, 用 50 nm Mitotracker 器 red cmxros 和 250 ngml hoechst 33342 染色细胞, 在 5% co 2/95% 空气的气氛下, 在37°c 下再孵育 20分钟.在60x 共聚焦激光扫描显微镜下观察典型的凋亡细胞形态 (图 2)。
请注意:典型的凋亡形态包括细胞收缩、膜漂白、线粒体分裂和核凝结, 但细胞膜完整12、13、14、15 ,18,37。
3. 凋亡细胞的分离与细胞凋亡逆转过程
- 在空气5% 的气氛中, 在37°c 的空气中, 用 3μm casasase-------绿色检测染料在黑暗中的 10 6/ml 细胞浓度中染色 30分钟, 同时使用凋亡诱导剂和溶剂处理的 mcf-7 或 t47d细胞。
- 在分拣机上进行分类之前, 先通过40μm 尼龙网过滤细胞进行分类。
- 为了门控目的, 首先对主要种群 (r1) 进行门控, 并通过绘制具有正向散射和侧向散射的点的图形来排除碎片 (图 3)。
- 使用未经处理的细胞, 而不添加 casase----绿色检测染料作为负对照来启动负区域 (r2) (图 3a)。
- 使用用 staurosporine12,18,34处理24小时的细胞, 用染料染色作为阳性控制, 以确定阳性区域 (r3) (图 3b)。
- 从含有 1 ml 收集介质的圆底聚苯乙烯 12 x 75 mm 管中的电感处理基团中收集阳性细胞 (r3) (与步骤1.18 中的收集介质相同) (图 3c-3d)。以 300 x g和 rt 离心管 5分钟, 并丢弃上清液。
- 收集负细胞 (r2) 从溶剂处理组在圆底聚苯乙烯12x75 毫米管与1毫升的收集介质如步骤 3.6 (图 3e-3f)。
请注意:一小部分细胞 (如 10, 000个细胞) 可以收集并在分拣器上重新运行, 以检查活动 caspases 标记的模式。如果90% 以上的分类溶剂处理细胞显示在卡斯帕塞阴性区, 或90% 以上的分类诱导处理细胞显示在酪蛋白酶阳性区, 这些收集的细胞被认为是相对纯净的 (图 3c-3f)。否则, 应重置排序区域和/或分拣器。 - 在新鲜采集培养基中对已分类细胞进行再利用, 在12井组织培养板中播种, 在 5% co2/95% 空气的气氛下培养,为期 7天, 用于细胞凋亡逆转。
4. 里海活化细胞凋亡的确认
- 混合 10 mm hepes、140 mm 氯化钠和 2.5 mm ccl2 , 制备环素结合缓冲液 (ph 7.4)。将缓冲区存放在 4°c, 避免将缓冲区暴露在光线下。
- 在45μl 的环素结合缓冲液中稀释 1 mgml pi 库存溶液的 5μl, 制备碘化物 (pi) 的100μgml 工作溶液。将溶液存放在 4°c, 避免将溶液暴露在光线下。
请注意:pi 是一种潜在的诱变剂, 应小心处理。 - 按照步骤2.1 至2.5 中的步骤 d-5 准备电感处理的细胞。
- 通过将培养基移过细胞层3-5x 以分离细胞, 收集电感处理的 mcf-7 或 t47d 细胞。将细胞转移到15毫升的锥形管。
- 以 300 x g离心, rt 5分钟, 丢弃上清液。
- 在 1.5 ml 微离心管中, 以 10 6/升的细胞浓度将完成培养基的细胞在13°c 时在黑暗中重新使用, 在黑暗中进行30分钟的绿色检测。
- 以 300 x g离心, rt 5分钟, 丢弃上清液。
- 用1毫升的冰凉 pbs 和离心机在 300 x g和4°c 清洗细胞 5分钟, 丢弃上清液。
- 将细胞在100μl 的环素结合缓冲液中重新悬浮, 加入5μl 的环素 v 共轭和 1μl 100μgl pi 工作溶液, 使每个100μl 的细胞悬浮液在室温下孵育细胞15分钟。
请注意:环素 v 和 pi 通常一起用于标记流式细胞术中的凋亡细胞 38,39,40. - 加入400μl 的环素结合缓冲液, 轻轻搅拌。在流式细胞仪上运行之前, 请将样品放在冰上。
5. 流式细胞仪测量乳腺 csc 样细胞
- 在两种电感或溶剂处理组中, 以0.05% 的色氨酸 edta 采集反向 mcf-7。在两个诱导或溶剂处理组中收获 t47d 细胞, 或以0.25% 的色氨酸 edta, 如步骤1.2 至1.5。
- 如步骤1.12 所述, 用荧光结合单克隆抗体对人类 cd44 (percp-cy5.5) 和 cd24 (pe) 染色细胞。同时, 准备步骤1.13 中的同型控件。
- 在流式细胞仪上运行细胞, 并使用 cd44+/cd24标记检测细胞的百分比。
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Representative Results
为了观察从乳腺癌非干细胞向乳腺癌样细胞的过渡, 需要对 cd44-/cd24+乳腺癌细胞进行首次分类。对于在原始人群中含有 csc 标记的 mcf-7 细胞系约占0.15 的细胞 (图 1), 这一步骤有助于排除在细胞凋亡逆转过程中 csc 富集的可能性。相反, 如果原始填充中没有带有 csc 标记的单元格, 例如 t47d 单元格 (图 1), 则可以省略此排序过程。事实上, 门控影响了每个标记的正反两极定义, 这最终将影响到确定的 csc 的百分比。因此, 适当的控制, 包括对感兴趣的抗体的同型控制, 每个标记的单一染色控制应仔细选择, 并准备用于门调整 (图 1)。
对于乳腺非干细胞, 随后可以建立细胞凋亡逆转模型。在添加凋亡诱导剂后, 可以观察到典型的形态学变化, 药物戒断后, 细胞将从类似形态的细胞凋亡中恢复 (图 2)。里海-"认识到在里海-" 绿色检测染料中的氨基酸序列 devd "和 caspase---" 的活性形式能够将该位点裂开 41.最初, 在细胞溶胶中, 里海绿色检测染料的荧光较弱, 而如果染料被切割并转移到细胞核, 荧光信号在与细胞核中的 dna 结合后就会被放大。流式细胞术可以区分这种明显的差异。因此, 与没有酪蛋白酶活化的细胞相比, 这些囊酶活化细胞可以根据其更高的荧光强度进行标记和分类 (图 3a-3d)。在凋亡诱导过程中, 必须包括适当的溶剂控制: 收集了没有酪蛋白酶活化的溶剂处理细胞 (图3e 和 3E), 以排除流式细胞仪程序或溶剂本身被采用的可能性。过渡的原因, 如果有的话。
为了证明这些 fas 分类的酪蛋白活化细胞确实是凋亡的, 我们将这些细胞与附件素 v 和 pi 共染色。凋亡细胞的早期变化之一是磷脂酰丝氨酸从质膜内侧转移到细胞的外表面13,38,39,40;这种磷脂酰丝氨酸的外化可以通过附件素 v 检测到。虽然这种变化并不是细胞凋亡所独有的, 但 pi 可用于根据细胞膜的完整性区分细胞凋亡和坏死。因此, 具有亚非素 v 结合但没有 pi 染色的细胞被视为凋亡细胞。凋亡诱导治疗组中的环切激活细胞为亚克辛 v 阳性, pi 为阴性, 提示它们为凋亡细胞 (图 4)。
在凋亡细胞中进行第二次基于酪蛋白酶活化的分选后, 收集这些凋亡细胞并随后进行培养以进行恢复。活着的倒置细胞能够附着培养容器底部并继续增殖。7天后, 在反向细胞中进行 cd44 和 cd24 染色, 同时制备对照。与溶剂治疗组 (图 1) 相比, 流式细胞仪分析显示, 在逆转的乳腺癌非干细胞群中, cd44+/cd24-象限中出现了事件 (细胞) (图 1)。.由于我们已经排除了 cd44+/cd24-在细胞凋亡诱导之前, 并且只选择了 cd44-/cd24 + 乳腺癌非干细胞, 因此这些 cd44+/ cd24-csc样细胞只能是在细胞凋亡逆转过程中从乳腺非干细胞转出。
图 1: 有代表性的乳腺 csc 标记染色对乳腺癌细胞流式细胞术。
mcf-7、mda-mb-231 和 t47d 被用荧光结合单克隆抗体染色, 抗人类 cd44 (percp-cy5.5) 和 cd24 (pe)。细胞首先通过正向散射 (fsc) 和侧向散射 (p1) 进行门控, 以排除碎片。cd24 和 cd44 的异型对照分别作为 cd24 和 cd44 的阴性对照。用 cd24 染色的 mcf-7 细胞作为 cd24 的阳性对照, 用 cd44 染色的 mda-mb-231 细胞作为 cd44 的阳性对照。对非干性 mcf-7 乳腺癌细胞 (p2) 进行了分类。这些被分类的细胞和 t47d 细胞受到细胞凋亡逆转的处理。细胞凋亡逆转后出现 csc 样 (cd44+cd24-) 细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 凋亡刺激诱导下乳腺癌细胞的形态变化。
乳腺癌细胞表现出典型的凋亡形态学变化, 包括细胞收缩、膜漂白、线粒体分裂 (单色数字中的黄色箭头) 和核凝结。细胞核 (蓝色): 用 hoechst 33342 染色的细胞核以蓝色显示。线粒体 (粉红色): 被线粒体染色的细胞红 cmxros 显示为粉红色。合并: 数字合并成双色, 同时显示线粒体和细胞核。线粒体 (灰色): 线粒体的细胞染色与线粒体跟踪器红 cmxros 显示在单色。微分干扰对比度 (dic): 整个细胞。上: mcf-7 细胞用 staurosporine (sts) 治疗 6小时, 然后反转24小时。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 通过分选器进行的里海酶活化分析.(a) 未染色的 mcf-7 细胞, 不经司体孢菌素 (sts) 处理, 作为阴性对照 (r2)。(b) 用 stauro研 (sts) 处理24小时的 mcf-7 细胞, r3 区的细胞被视为卡斯帕塞激活细胞。(c) 用 stauro研 (sts) 处理6小时的 mcf-7 细胞, 对 r3 区的细胞进行 fps 分类。(d) 在足孢菌素 (sts) 治疗6小时后, fps 分类的卡斯帕塞激活的 mcf-7 细胞被重新运行。(e) dmso 处理的 mcf-7 细胞。(f) dmso 治疗6小时后, 在没有酪蛋白酶活化的情况下, fns 的分类细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 流式细胞术中的环素 v 和 pi 染色.mcf-7 和 t47d 细胞首先通过正向散射 (fsc) 和侧向散射 (psc) (p1) 进行门控, 以排除碎片。未通过凋亡诱导剂处理且未染色的细胞被用作阴性对照。对于使用凋亡诱导剂处理的细胞, 选择了环素活化细胞 (即环孢菌素--绿色阳性细胞) (p3), 以显示亚克辛 v 和 pi 染色的荧光强度。所有的环孢菌素----绿色阳性细胞均为亚克辛 v 阳性和 pi 阴性, 提示它们为凋亡。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议描述了一种直接和明确的方法来检测乳房非干细胞过渡到乳腺癌样细胞的细胞凋亡逆转的结果。应用体外哺乳动物球形成法和免疫缺陷小鼠体内异种移植法 (18,24, 26)可帮助确认这些逆转细胞的 csc 特性 27,42,43,44,45。在这里, 我们使用两个乳腺癌细胞系, 但这一协议可以进一步应用于其他乳腺癌细胞系。由于这种现象在最初存在的 cd44+/cd24-细胞数量较少的乳腺癌细胞系中很明显, 建议不要选择 mda-mb-231 等细胞系, 其中90% 以上的 cd44 +细胞。
由于门控在流量分析中很重要, 因此应提前做好适当和充分的控制。对于分类, 纯度也应在实际收集细胞之前确定。例如, 要知道第一次排序的纯度, 可以收集一小部分细胞 (如 10, 000个单元格) 并在分拣器上重新运行, 以检查 csc 标记的模式。如果这些分类细胞的90% 以上是 cd44-/cd24+ , 并且没有显示在 cd44+/cd24-区域中, 则被收集的细胞被认为是相对纯净的 (图 1)。如果单元格出现在 cd44+/cd24区域中, 则应重置排序区域和/或分选器。分类应尽可能无菌, 或者在培养罩内使用分拣器, 或在分类细胞的收集和培养培养基中添加抗生素。
乳腺癌以外的癌细胞类型也可以选择和诱导与各种凋亡刺激建立细胞凋亡逆转模型。虽然早在2小时内就可以检测到酪蛋白酶激活, 但应该仔细选择排序时间。由于种群中的细胞不同步, 在一个特定的时间点, 每个细胞可能已经达到不同的凋亡阶段。同时, 细胞在酪蛋白酶激活后继续出现凋亡死亡。因此, 如果只有当所有细胞都达到酪蛋白活化时, 才会将诱导剂取出, 则某些细胞可能已经达到 dna 分裂阶段, 即使在诱导剂去除后也无法恢复。不建议诱导细胞凋亡太长时间, 以实现较高比例的酪蛋白激活细胞, 但代价是让大量细胞在收集后死亡。此外, 每当首次使用新的细胞系时, 应优化标记卡斯帕塞活化细胞的培养时间和染料浓度。
另一个值得关注的问题是成功诱导凋亡细胞凋亡逆转的细胞恢复率较低 (通常小于 10%)。细胞经历了细胞凋亡和分选过程;因此, 它们需要非常温和的处理, 在离心和转移在收集和重新悬浮步骤。另外, 用于后续培养的盘子或盘子的选择不应取决于收集的细胞数量, 而应取决于预期的恢复数量。否则, 单元格的分配可能过于稀疏, 无法反转和重新生长。鉴于非干细胞生长速度较快, 可能在重组细胞46 中占主导地位, 检测时间不应与第一个恢复日太远。
这种方法首先分离乳房非干细胞, 然后将其应用于凋亡诱导, 在细胞恢复之前, 根据酪蛋白酶的激活进行第二次分选。流式细胞仪检测乳房 cscc 样细胞在反向人群中的再现。由于这种体外凋亡逆转程序分离出纯凋亡癌细胞, 现在可以进行一些实验来了解这些真正逆转细胞的后果。除了乳腺癌细胞, 其他固体肿瘤类型, 以及血液恶性肿瘤, 是已知的 csc 标志物可以研究和各种凋亡刺激可以使用。因此, 这种方法是可扩展的, 适用于癌症调查的寄宿者范围。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到创新科技署创新科技基金的支持: 由农业生物技术国家重点实验室 (中大)、罗桂成生物医学研究基金及李希山基金会提供资助。y. x. 得到了中大研究生学生的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40 μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | - | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
References
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