Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur isolieren Apoptotic Brustkrebszellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und weiter den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen zu Brustkrebs-Stammzellen-ähnliche Zellen nach Apoptose Umkehr zu erkennen, indem Durchflusszytometrie.
Abstract
Rezidiv wurde lange von Onkologen untersucht, während die zugrunde liegenden Mechanismen unklar bleiben. Vor kurzem fanden wir und andere, dass ein Phänomen namens Apoptose Umkehr zu erhöhten Tumorigenität in verschiedenen Zellmodellen unter verschiedene Reize führt. Frühere Studien konzentrierten sich auf die Verfolgung dieser Prozess in vitro und in vivo; ist aber noch die Isolierung der echten umgekehrte Zellen erreicht werden, welche Grenzen unser Verständnis über die Folgen der Apoptose Umkehr. Hier nutzen wir einen Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff Label Zellen mit aktivierte Caspasen nach Induktion der Apoptose. Zellen mit positiven Signalen werden weiter durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) zur Verwertung aussortiert. Morphologische Untersuchung unter konfokalen Mikroskopie hilft den apoptotischen stand vor FACS bestätigen. Eine Zunahme der Tumorigenität kann oft die Höhe des Anteils der Krebsstammzellen (CSC) zugeschrieben werden-wie Zellen. Auch wäre angesichts die Heterogenität der Brustkrebs, Identifizierung des Ursprungs dieser CSC-ähnliche Zellen entscheidend für die Behandlung von Krebs. So bereiten wir nicht Stamm Brustkrebszellen vor Apoptose auslösen, Caspase-aktivierten Zellen zu isolieren und die Apoptose Umkehrung Verfahren durchführen. Flow-Zytometrie-Analyse zeigt, dass die CSC-wie Brustzellen wieder erscheinen im Bereich "umgekehrte" darauf hinweist, dass die CSC-wie Brustzellen von Brustkrebszellen-Stamm während der Apoptose Umkehr gereist sind. Zusammenfassend lässt sich sagen enthält dieses Protokoll die Isolierung von apoptotischen Brustkrebszellen und Erkennung von Veränderungen in CSC Prozentsatz in umgekehrter Zellen durch Durchflusszytometrie.
Introduction
Krebs ist eine führende Ursache des Todes, verursacht schwere Last zu Ländern weltweit1gewesen. Brustkrebs zählt bei weiblichen Patienten unter allen Arten von Krebs1hoch, sowohl in Bezug auf die Inzidenz und Mortalität. Aufgrund der Heterogenität Krebs ist eine Kombination von Medikamenten in der Regel in der Chemotherapie verwendet, um Krebs Zelle Tod2,3,4zu erreichen. Jedoch da gemeinsame Chemotherapeutika oft DNA-5,6 Ziel, betroffen Synthese7,8 und/oder Mikrotubuli Proteindynamik9, schnell wachsende Zellen sind am meisten während ruhende Zellen wie Krebs-Stammzellen (CSC) s sind in der Regel weniger betroffenen10. CSCs sind daher eher nach der Behandlung überleben, später führt zu Resistenzen und Krebs10,11 Rezidiv. Daher, Beseitigung von CSCs ist ein wichtiges Thema für die Krebsbehandlung geworden und Studie über den Ursprung des CSCs ist notwendig.
Weitere Studien über das Phänomen der Apoptose Umkehrung wurden im letzten Jahrzehnt12,13,14,15,16,17,18 durchgeführt , 19. vor der Entstehung dieses Konzeptes, es hat weit angenommen worden, dass Zellen irreversibel nach der Aktivierung der Caspase Apoptose. Caspasen sind eine Familie von Protein-Enzyme, die wichtige Rolle in der Initiierung und Durchführung Stadien der Apoptose, einschließlich der Bildung von komplexen apoptotische und die Spaltung von nachgelagerten Substrate20spielen. Aktivierung von Caspasen Henker wie Caspase 3 oder Caspase 7 galt als der "Point Of No Return" für Apoptose21. Allerdings beobachteten Forscher vor kurzem, dass Umkehr Apoptose sowohl in-vitro tritt- und in-vivo, , während die Zellen sich von Apoptose auch nach Caspase Aktivierung12,13,14 erholen können , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Darüber hinaus aggressive Merkmale wie z. B. höhere Beständigkeit gegen die ursprünglichen Apoptose-Induktor und höheren Invasivität werden in der umgekehrten Krebs erkannt Zellen15. Daher wurde vorgeschlagen, dass der Anteil der CSC-ähnlichen Zellen in der umgekehrten Bevölkerung im Vergleich zu den unbehandelten Zellen schließlich einen Beitrag zu mehr bösartigen Funktionen nach Apoptose Umkehr18höher wäre.
Zuvor wurden viele Anstrengungen unternommen, die Apoptose Umkehr in-vitro- und noch wichtiger, in vivo zu verfolgen die sehr helfen bei der Bestätigung der Universalität von diesem Prozess16,17,19. Allerdings fehlt eine systemische Studie über die Folgen der umgekehrte Zellen aufgrund der unbefriedigenden Isolation von Zellen, die wirklich Apoptose Umkehr unterzogen wurden. Es muss eine reine Apoptotic Zellen zu erwerben und für weitere Studien zu erholen. Also, wir verwenden den traditionell anerkannten Marker der Henker Caspase Aktivierung als Marker für den "Point Of No Return"-21 für die Apoptose und nutzen Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) um Caspase-aktivierten Zellen befleckt Diskriminierung mit Farbstoff Caspase-3/7-Grün-Erkennung. Der Farbstoff ist kovalent verbunden mit eine kurze Aminosäuresequenz, DEVD, die erkannt und durch aktive Caspasen 3/7 abgespalten werden können. Die Spaltung hilft den Farbstoff freigeben, die aus dem Zytosol in den Zellkern translozieren wird, wo es bindet an DNA und starke Fluoreszenz emittiert. Dieses Verfahren vermeidet die Verwendung einer Bulk-Zell-Population, in der einige Zellen keine Apoptose durchgemacht haben können.
CSCs oder Tumor-initiierenden Zellen wurden in vielen soliden Tumoren, die mit einer einzigen oder eine Kombination aus mehreren Oberflächen Marker(s) und sehr wenige Zahlen dieser Zellen sind ausreichend, um Form Tumoren immungeschwächte Mäuse22,23, 24,25,26,27. Häufig wird eine Kombination von CD44 und CD24 Brust CSC Studien und CD44+/CD24– Zellen wurden definiert als die Brust CSCs26,27,28,29 , 30. vor kurzem haben wir eine Reihe von Experimenten bestätigen die vorgeschlagene Beziehung zwischen Apoptose Umkehr und CSCs zu demonstrieren, dass umgekehrte Brustkrebszellen erhöhte Tumor bilden Fähigkeit in vitro und in vivo mit gewonnen durchgeführt ein erhöhter Anteil an Zellen mit CSC Marker18. Obwohl wir nicht ausschließen konnte, dass Brust CSCs besser überleben und somit nach Apoptose Umkehr, wichtig ist, bereichert wenn wir nicht-Stamm Krebszellen und Thema isolieren entstehen ihnen zu Apoptose Umkehr, CSC in der ursprünglich nicht-stem Krebs-Zell-Population, darauf hindeutet, dass nicht-Stammzellen Krebs, wie Zellen auf die Erhöhung des Anteils von CSCs während der Apoptose Umkehr beitragen können.
Dieser Artikel soll den Übergang von Brustkrebszellen-Stamm zu CSC-wie Brustzellen nach Apoptose Umkehr zu zeigen und diesen Übergang durch Durchflusszytometrie zu erkennen. -Stamm-Brustkrebszellen bereiten wir zunächst durch die Isolierung von CD44–/CD24+ Brustkrebs Krebszellen durch FACS. Dann ist Apoptose induziert und durch morphologische Veränderungen unter dem Mikroskop bestätigt. Danach sind Apoptotic Zellen positiv gekennzeichnet durch Caspase 3/7 Grün Erkennung Farbstoff durch FACS isoliert und weiter in das Fehlen von Apoptose induzieren Apoptose Umkehr kultiviert. Die umgekehrten Zellen sind dann nach 7 Tagen Erholung für durchflusszytometrischen Analyse mit CSC-Markern gefärbt. Zellen mit CD44+/CD24– Marker erscheinen wieder in der umgekehrten Bevölkerung darauf hindeutet, dass Übergang von nicht-Stamm Krebszellen zu CSC-wie Zellen in Apoptose Umkehrung aufgetreten ist.
Apoptose Umkehr wurde in mehreren Krebs beobachtet Zelllinien sowie normale Primärzellen mit verschiedenen apoptotischen Stimuli in vitro-12,13behandelt. Dieser Prozess hat auch in Drosophila verfolgt worden Modell in-vivo16,17,19. Viele Informationen über die zugrunde liegenden Mechanismus der Krebs-Rückfall in verschiedenen Krebs-Krankheit-Modelle und die Herkunft des CSCs erhalten Sie durch den Einsatz der Technik wie in diesem Manuskript beschrieben.
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Protocol
1. Vorbereitung der Brust nicht-Stamm Krebszellen
- Kultur MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen in 10 mL Phenol Rotfrei-Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) in einer 100 mm Schale ergänzt. Kultur T47D in 10 mL Phenol Rotfrei RPMI 1640 Medium ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, Hitze-inaktivierten 10 % FBS und 1 % V/V Penicillin-Streptomycin (PS) in einer 100 mm Schale. Zellkulturen bei 37 ° C in einem 5 % CO295 % Luft Zelle Kultur Inkubator.
Hinweis: Phenol-rot wirkt Fluoreszenz-basierte Erkennung jedoch auch einen potenzielle Einfluss auf das Wachstum von Brustkrebszellen durch die Östrogen-ähnliche Effekte31. Phenol rot könnte beispielsweise Progesteron-Rezeptor und das Wachstum von MCF-7 Zellen31anregen. Es könnte auch das Wachstum von T47D Zellen31stimulieren. - Wash-Zellen mit 2 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal. Fügen Sie 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA, MCF-7 und MDA-MB-231 oder 2 mL 0,25 % Trypsin-EDTA, T47D Zellen.
Hinweis: Die Konzentration der Trypsin-EDTA benötigt für die Trennung von Zellen unter verschiedenen Brust Krebs Zelle Arten variieren, während eine unangemessene Konzentration der Expressionsmuster von einigen Zelle Oberflächenmarker wie CD44 und CD2432beeinträchtigen kann. - Kultur der Gerichte für 5 min bei 37 ° C unter einer Atmosphäre des 5 % CO295 % Luft. Überprüfen Sie regelmäßig die Loslösung der Zellen unter dem Mikroskop zu verhindern, dass Zellen von übermäßigen Verdauung durch Trypsin-EDTA.
- Wenn mehr als 90 % Zellen loslösen, die Schüssel 5 mL fertige RPMI Medium hinzu und pipette es über die Zelloberfläche Schicht mehrere Male.
- Übertragen Sie die Zellen auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g und 4 ° C für 5 min.
Hinweis: In der Regel etwa 6 x 106 Zellen aus einem 100 mm Schale erhalten Sie wenn die Konfluenz 70 % erreicht. - Den Überstand verwerfen und die Pellets auf 106 Zellen/100 μL der FACS-Puffer (PBS mit 0,5 % BSA und 0,1 % Natriumazid) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch aufzuwirbeln.
- Teilen Sie die Zellen in mehreren Rohren. Für MCF-7 Zellen teilen sich die Zellen in 4 Röhren: zwei für Isotype steuert, eine für einzelne CD24 Färbung als Positivkontrolle CD24 und eine für dual Färbung.
- Für T47D Zellen, teilen sich die Zellen in 3 Röhren: zwei für Isotype Kontrollen und eine für dual Färbung.
- Die Zellen in 4 Röhren für MDA-MB-231 Zellen unterteilen: zwei für Isotype steuert, eine für CD44 einheitliche Färbung als Positivkontrolle CD44 und für dual Färbung.
- Zentrifuge, die Rohre wieder bei 300 x g und 4 ° C für 5 min. überstand verwerfen, und dann fügen Sie Fc Block 01:50 in FACS-Puffer verdünnt.
- Brüten die Proben auf Eis für 20 min in der Dunkelheit vor Zentrifugation bei 300 X g und 4 ° C für 5 min. Überstands verwerfen.
- Fügen Sie Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Antikörper gegen menschliche CD44 (PerCP-Cy5.5) und CD24 (PE) bei 01:40 und 01:10 Verdünnungen (in FACS Puffer) im Dual Färbung Gruppen. Für positive Steuerelemente hinzufügen CD44 (PerCP-Cy5.5), MDA-MB-231 und bzw. MCF-7 Zellen in der gleichen Konzentration CD24 (PE) hinzufügen.
Hinweis: Die Kombination von CD44 und C24 hat in Brust CSC Studie26,27,28,29,30verbreitet worden. - Für die Isotype Kontrollgruppen hinzufügen PerCP-Cy5.5 Maus IgG2b, κ bei einem 01:40 Verdünnung als die Isotype-Steuerung für CD44 Antikörper und PE Maus IgG2a, κ bei einem 01:10 Verdünnung als die Isotype-Steuerung für CD24 Antikörper bei 106 Zellen/100 μL.
Hinweis: Isotype Steuerelemente für die Antikörper von Interesse sind als Negativkontrollen33empfohlen. - Brüten die Proben (aus Schritt 1.12 und 1.13) bei 4 ° C im Dunkeln für 30 min. Zentrifuge bei 300 X g und 4 ° C für 5 min. Überstands verwerfen.
- Waschen Sie das Pellet zweimal mit 500 μl PBS und Zentrifuge bei 300 X g und 4 ° C für 5 min.
- Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 0,5 mL PBS und Filter durch eine 40 µm-Nylon-Mesh vor der Ausführung auf ein Fluoreszenz-activated Cell Sorter.
- Zwecken der gating und Entschädigung Fleck MCF-7 Zellen mit PE-konjugierten Anti-CD24-Antikörpern und MDA-MB-231 Zellen mit PerCP-Cy5.5-konjugierten Anti-CD44 Antikörper als Positivkontrollen Fleck. Verwenden Sie Zellen befleckt mit Isotype Steuerelemente als Negativkontrollen (Abbildung 1).
- Sammeln Sie Zellen mit CD44–/CD24+ Marker im Rundboden Polystyrol 12 x 75 mm Röhrchen mit 1 mL der Sammlung Medium (Phenol Rotfrei RPMI 1640 Medium mit 20 % Hitze-inaktivierten FBS und 2 % V/V PS ergänzt). Die Rohre bei 300 x g und RT für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
Hinweis: CSC-wie Zellen in Brustkrebszellen sind definiert als CD44+/CD24– Zellen26,27,28,29,30und Brustkrebs Krebszellen-Stamm sind definiert als CD44–/CD24+ Zellen18 (Abbildung 1). - Platte der sortierten-Stamm Brustkrebszellen in der Kulturschale mit frischen Kollektion Medium für weitere Kultur bei 37 ° C in 5 % CO2 Zelle Kultur Inkubator.
(2) Apoptose-Induktion und Erkennung
- Bereiten Sie 1 mM Staurosporine12,34 in DMSO. Fügen Sie für die behandelten MCF-7-Gruppe 25 μl 1 mM Staurosporine auf das fertige Medium von MCF-7 Zellen um bis zu 10 mL Endvolumen (2,5 μM Staurosporine) in einem 15 mL konische Röhrchen zu machen hinzu. Pipette auf den Inhalt gleichmäßig zu mischen.
- Das Kulturmedium aus den Zellen zu entfernen, die Zellen mit 2 mL PBS einmal waschen. Fügen Sie die 10 mL Medium mit 2,5 μM Staurosporine MCF-7 Zellen für 6 h, Apoptose zu induzieren, wenn Zelldichte 70 % Konfluenz erreicht.
- Bereiten Sie 1 mM Paclitaxel35,36 in DMSO. Fügen Sie für die behandelten T47D Gruppe 12,5 μl 1 mM Paclitaxel das fertige Medium der T47D Zellen zu einem Endvolumen von 10 mL (5 μM Paclitaxel) in einem 15 mL konische Röhrchen zu machen hinzu. Pipette auf den Inhalt gleichmäßig zu mischen.
- Das Kulturmedium aus den Zellen zu entfernen, und die Zellen mit 2 mL PBS einmal waschen. Fügen Sie die 10 mL Medium mit 5 μM Paclitaxel zu den T47D Zellen für 10 h, Apoptose zu induzieren, wenn Zelldichte 70 % Konfluenz erreicht.
Hinweis: Die Induktionszeit und die Konzentration der Induktoren, die Apoptose induzieren sollte optimiert werden, wenn eine neue Zell-Linie zum ersten Mal verwendet wird. - Fügen Sie für die Lösungsmittel behandelt MCF-7-Gruppe 25 μL der sterilen Dimethyl Sulfoxid (DMSO hinzu) in einem 15 mL konische Röhrchen auf das fertige Medium von MCF-7 Zellen zu einem Endvolumen von 10 mL (d. h. 0,25 % V/V DMSO) zu machen. Pipette auf den Inhalt gleichmäßig zu mischen.
- Entfernen Sie das Kulturmedium von Lösungsmittel behandelten MCF-7 Zellen, einmal mit 2 mL PBS waschen. Dann fügen Sie die 10 mL Medium mit 0,25 % V/V DMSO für 6 h als Lösungsmittel Steuerung für STS.
- Fügen Sie für die Lösungsmittel behandelt T47D Gruppe 5 μL der sterilen DMSO das fertige Medium der T47D Zellen um bis zu 10 mL Endvolumen (d. h. 0,05 % V/V DMSO) in einem 15 mL konische Röhrchen hinzu. Pipette auf den Inhalt gleichmäßig zu mischen.
- Entfernen Sie das Kulturmedium von Lösungsmittel behandelten T47D Zellen, einmal mit 2 mL PBS waschen. Fügen Sie die 10 mL Medium mit 0,05 % V/V DMSO für 10 h als Lösungsmittel Steuerung für Paclitaxel.
- Zu die morphologischen Veränderungen der behandelten Zellen beobachten, beflecken Zellen mit 50 nM Mitotracker Red CMXRos und 250 ng/mL Hoechst 33342, und weitere 20 min bei 37 ° C unter einer Atmosphäre des 5 % CO295 % Luft inkubieren. Beobachten Sie die typischen Apoptotic Zellmorphologie unter 60 x konfokale Laser-scanning-Mikroskop (Abbildung 2).
Hinweis: Typische Apoptose Morphologie enthält Zelle Schrumpfung, Membran Blebbing, Mitochondrien Fragmentierung und nukleare Kondensation aber mit intakten zellulären Membran12,13,14,15 ,18,37.
3. Isolation der Apoptotic Zellen und Apoptose Umkehrung Verfahren
- Färben Sie die Apoptose-Induktor - und Lösungsmittel-behandelten MCF-7 oder T47D Zellen mit 3 μM Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff in der Zelle-Konzentration von 106/mL in der Dunkelheit für 30 min bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 5 % CO295 % Luft.
- Filtern Sie die Zellen durch einen 40 µm-Nylon-Mesh vor dem Ausführen auf dem Sorter für die Sortierung.
- Für die Anspritzung Zwecke, zuerst Tor der Ballungszentren (R1) und die Trümmer ausschließen, indem Sie Plotten der Graphen in den Punkten mit forward Scatter und Side Scatter (Abbildung 3).
- Die unbehandelten Zellen ohne Zugabe von Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff als Negativkontrolle verwenden, um die negativen Region (R2) Tor (Abb. 3A).
- Zellen mit Staurosporine12,18,34 24 Stunden behandelt und gefärbt mit dem Farbstoff als Positivkontrolle verwenden, um die positiven Region (R3) Tor (Abb. 3 b).
- Sammeln Sie positive Zellen (R3) aus den Induktor-behandelten Gruppen in Rundboden Polystyrol 12 x 75 mm Röhrchen mit 1 mL der Sammlung Medium (identisch mit der Kollektion Medium im Schritt 1.18) (Abb. 3C-3D). Die Rohre bei 300 x g und RT für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Sammeln Sie negative Zellen (R2) von Lösungsmittel-behandelten Gruppen in Rundboden Polystyrol 12 × 75 mm Röhrchen mit 1 mL Kollektion Medium wie in Schritt 3.6 (Abbildungen 3E-3F).
Hinweis: Ein kleiner Teil der Zellen (z. B. 10.000 Zellen) kann gesammelt und starten erneut auf dem Sorter, das Muster der aktiven Caspasen Marker zu überprüfen. Wenn mehr als 90 % der sortierten Lösungsmittel-behandelten Zellen im Großraum Caspase-Negative erscheinen oder über 90 % der sortierten Induktor-behandelten Zellen im Großraum Caspase-positiv dargestellt sind, sind diese gesammelten Zellen vermutlich relativ reines (zahlen 3 C-3F). Andernfalls sollte die Sortierung Region und/oder der Sortierer zurückgesetzt werden. - Aufschwemmen der sortierten Zellen in frischen Kollektion Medium und säen sie in 12-Well-Zellkultur-Platten und Kultur bei 37 ° C unter einer Atmosphäre des 5 % CO295 % Luft für 7 Tage für Apoptose Umkehr.
4. Bestätigung der Apoptose in Caspase-aktivierten Zellen
- Mischen Sie 10 mM HEPES, 140 mM NaCl und 2,5 mM CaCl2 annexin-Bindung Puffer (pH 7,4) vorzubereiten. Lagern Sie den Puffer bei 4 ° C und vermeiden Sie den Puffer, dem Licht auszusetzen.
- Bereiten Sie eine 100 µg/mL funktionierende Lösung des Propidium Jodid (PI) durch Verdünnung 5 µL von 1 mg/mL PI-Stammlösung in 45 µL Puffer annexin-Bindung. Lagern Sie die Lösung bei 4 ° C und vermeiden Sie die Lösung, dem Licht auszusetzen.
Hinweis: PI ist ein potenzieller Mutagen und sollten mit Vorsicht behandelt werden. - Bereiten Sie die Induktor-behandelten Zellen wie in den Schritten 2.1 bis 2.5.
- Sammeln Sie den Induktor behandelt MCF-7 oder T47D Zellen durch Pipettieren dem Medium über die Zellschicht 3-5 X, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen auf eine 15 mL konische Rohr.
- Zentrifugieren Sie bei 300 x g und RT für 5 min. überstand verwerfen.
- Aufzuwirbeln Sie die Zellen mit abgeschlossenen Medium in die Zelle-Konzentration von 106/mL in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Beflecken Sie Zellen mit 3 μM Caspase 3/7 Grün Erkennung Farbstoff in der Dunkelheit für 30 min bei 37 ° C.
- Zentrifugieren Sie bei 300 x g und RT für 5 min. verwerfen die Überstände.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 mL eiskaltem PBS und Zentrifuge bei 300 X g und 4 ° C für 5 min. verwerfen die Überstände.
- Aufschwemmen der Zellen in 100 μL von annexin-Bindung Puffer mit Add 5 μL des annexin V-Konjugats und 1 µL von 100 µg/mL PI Arbeitslösung zu jeweils 100 μl Zellsuspension und die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Annexin V und PI werden häufig zusammen verwendet Apoptotic Zellen im Flow Cytometry38,39,40beschriften. - 400 µL annexin-Bindung Puffer, Mischung sanft hinzufügen. Halten Sie die Proben auf Eis vor der Ausführung auf einem Durchflusszytometer.
5. Messung der Brust CSC-ähnliche Zellen durch Durchflusszytometrie
- Ernten Sie die umgekehrte MCF-7 in beiden Gruppen Induktor oder Lösungsmittel behandelt mit 0,05 % Trypsin-EDTA. T47D Zellen in beiden Gruppen Induktor oder Lösungsmittel behandelt oder mit 0,25 % Trypsin-EDTA wie in Schritt 1.2 bis 1.5 zu ernten.
- Färben Sie die Zellen mit Fluorochrom konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD44 (PerCP-Cy5.5) und CD24 (PE) wie in Schritt 1.12. Unterdessen bereiten Sie die Isotype-Steuerelemente wie in Schritt 1.13.
- Führen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer und erkennen den Anteil der Zellen mit CD44+/CD24– -Marker.
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Representative Results
Um den Übergang von der Brust nicht-Krebszellen zu CSC-wie Brustzellen, eine erste Sortierung der CD44 Stiel zu beobachten–/CD24+ Brustkrebs-Zellen wurden benötigt. Seit die MCF-7-Zell-Linie, die etwa 0,15 % Zellen mit CSC-Marker in der ursprünglichen Bevölkerung (Abbildung 1), dieser Schritt unterstützt CSC Bereicherung während der Apoptose Umkehr auszuschließen. Im Gegenteil, gäbe es keine Zellen mit CSC-Marker in der ursprünglichen Bevölkerung, könnte wie z. B. für T47D Zellen (Abbildung 1), diese Sortierung Prozedur verzichtet werden. Anspritzung betroffen in der Tat, die Definition der positiven und negativen der einzelnen Marker, die schließlich den Prozentsatz der CSC bestimmt beeinflussen würde. Daher sollte angemessene Kontrollen einschließlich Isotype Kontrollen für Antikörper von Interesse, einzelne gefärbten Steuerelemente für jede Markierung sorgfältig ausgewählt und vorbereitet für Tor einstellen (Abbildung 1).
Mit nicht-Stamm Brustkrebszellen konnte danach die Apoptose-Umkehr-Modell hergestellt werden. Typische morphologische Veränderungen konnte beobachtet werden, nach dem Hinzufügen von Apoptose induzieren und Zellen sollten erholen sich von Apoptose mit ähnliche Morphologie nach Drogenentzug (Abbildung 2). Caspase-3/7 erkennt die Aminosäure-Sequenz DEVD in der Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff und die aktiven Formen der Caspase-3/7 sind in der Lage, diese Seite41zu Spalten. Ursprünglich ist die Fluoreszenz des Farbstoffs Caspase-3/7-Grün-Erkennung im Zytosol schwach, während wenn der Farbstoff ist gespalten und in den Zellkern umgesiedelt, das Fluoreszenzsignal nach seiner Bindung an die DNA im Zellkern verstärkt werden würde. Dieser offensichtliche Unterschied könnte durch Durchflusszytometrie unterschieden werden. Daher könnte die Caspase-aktivierten Zellen gekennzeichnet und anhand ihrer höheren Fluoreszenz Intensität im Vergleich zu denen ohne Caspase-Aktivierung (Abbildungen 3A-3D) aussortiert. Während der Apoptose-Induktion-Prozess muss eine entsprechende Ansteuerung Lösungsmittel enthalten sein: Lösungsmittel-behandelten Zellen ohne Aktivierung der Caspase gesammelt wurden (Zahlen 3E und 3F) um die Möglichkeit auszuschließen, die das FACS-Verfahren oder das Lösungsmittel selbst war die Ursache für den Übergang, wenn überhaupt.
Um zu zeigen, dass diese FACS sortiert Caspase-aktivierten Zellen in der Tat Apoptotic waren, gefärbt, wir gemeinsam diese Zellen mit Annexin V und PI. Eines der frühen Stadium Veränderungen im Apoptotic Zellen ist die Translokation von Phosphatidylserin von der inneren Seite der Plasmamembran auf die Außenfläche der Zelle13,38,39,40; Diese Externalisierung von Phosphatidylserin konnte von Annexin V nachgewiesen werden. Während diese Änderung nicht einzigartig, Apoptose, lässt PI Apoptose von Nekrose basierend auf die Integrität der Zellmembran zu unterscheiden. Somit sind Zellen mit Annexin V Bindung aber ohne PI Färbung als apoptotische Zellen betrachtet. Caspase-aktivierten Zellen in die Apoptose-Induktor Behandlungsgruppen wurden festgestellt, dass Annexin V positive und PI negativ, darauf hindeutet, dass sie Apoptotic Zellen (Abbildung 4 waren).
Nach der zweiten Sortierung auf Aktivierung der Caspase in apoptotischen Zellen basierend, wurden diese Apoptotic Zellen gesammelt und anschließend für die Wiederherstellung kultiviert. Die umgekehrten Zellen, die noch am Leben waren konnten Kultur Behälterboden legen und weiter zu vermehren. Nach 7 Tagen Färbung des CD44 und CD24 in den umgekehrten Zellen erfolgte während Kontrollen zur gleichen Zeit wie vor vorbereitet wurden. Verglichen mit dem Lösungsmittel-behandelten Gruppen (Abbildung 1), durchflusszytometrischen Analyse zeigte, dass gab es Ereignisse (Zellen) erscheinen in der CD44+/CD24– -Quadranten in der umgekehrten Brust-Stamm Krebs-Zell-Population (Abbildung 1) . Da wir bereits Zellen mit CD44 ausgeschlossen hatte+/CD24– im Vorfeld der Apoptose-Induktion und nur CD44–/CD24+ -Stem Brustkrebszellen wurden ausgewählt, diese CD44+/CD24– CSC-ähnliche Zellen konnte nur sein durchquert von Brustkrebszellen-Stamm während der Apoptose Umkehr.
Abbildung 1: Repräsentative Brust CSC Marker Flecken auf Brustkrebszellen in Durchflusszytometrie.
MCF-7, MDA-MB-231 und T47D waren voller Flecken mit Fluorochrom konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD44 (PerCP-Cy5.5) und CD24 (PE). Zellen wurden zuerst durch forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) (P1), Schmutz auszuschließen bewachte. Isotype Kontrollen von CD24 und CD44 wurden als Negativkontrollen für CD24 und CD44 verwendet. MCF-7 Zellen befleckt mit CD24 diente als Positivkontrolle für CD24 und MDA-MB-231 Zellen befleckt mit CD44 diente als Positivkontrolle für CD44. Non-Stamm MCF-7 Brustkrebszellen (P2) wurden sortiert. Diese sortierten Zellen und T47D Zellen wurden Apoptose Umkehrung Verfahren unterzogen. CSC-ähnliche (CD44+CD24–) Zellen nach Apoptose Umkehr erschienen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Morphologische Veränderungen von Brustkrebszellen unter Apoptotic Reiz Induktion.
Brustkrebs-Zellen zeigten typische Apoptotic morphologische Veränderungen einschließlich Zelle Schrumpfung, Membran Blebbing, Mitochondrien Fragmentierung (gelbe Pfeile in den monochromen Figuren) und nukleare Kondensation. Kerne (in blau): Kernen der Zellen befleckt mit Hoechst 33342 wurden in blauer Farbe dargestellt. Mitochondrien (in rosa): Mitochondrien der Zellen befleckt mit Mitotracker rot CMXRos zeigten sich in rosa Farbe. Zusammengeführte: Zahlen in zwei Farben mit Mitochondrien und Kerne verschmolzen. Mitochondrien (in grau): Mitochondrien der Zellen befleckt mit Mitotracker rot CMXRos zeigten sich in Monochrom. Differential Interferenz-Kontrast (DIC): ganze Zellen. Obermaterial: MCF-7 Zellen wurden behandelt mit Staurosporine (STS) für 6 h dann umgekehrt für 24 h niedriger: T47D Zellen wurden behandelt mit Paclitaxel für 10 h mit Umkehrung für 24 Std. Maßstabsleisten = 20 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Caspase-Aktivierungsanalyse durch Sorter. (A) ungefärbten MCF-7 Zellen ohne Staurosporine (STS) Behandlung dienten als Negativkontrolle (R2). (B) MCF-7 Zellen behandelt mit Staurosporine (STS) für 24 Std. Zellen in R3-Region als die Caspase-aktivierten Zellen galten. (C) MCF-7 Zellen behandelt mit Staurosporine (STS) für 6 h. Zellen in R3 Region FACS sortiert wurden. (D) FACS sortiert Caspase aktivierte MCF-7 Zellen nach der Staurosporine (STS) Behandlung für 6 h waren erneut ausführen. (E) DMSO behandelt MCF-7 Zellen. (F) FACS sortiert Zellen ohne Aktivierung der Caspase nach DMSO Behandlung für 6 h waren erneut ausgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Annexin V und PI Färbung des Caspase-aktivierten Zellen in Durchflusszytometrie. MCF-7 und T47D Zellen wurden zunächst durch forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) (P1), Schmutz auszuschließen bewachte. Zellen, die unbehandelt mit Apoptose induzieren und ohne jede Färbung waren dienten als Negativkontrollen. Für Zellen mit Apoptose induzieren behandelt, Caspase-aktivierten Zellen [d. h. Caspase-3/7 Grün positive Zellen] ausgewählt wurden (P3) der Fluoreszenzintensität von Annexin V und PI Färbung zeigen. Alle Caspase-3/7 Grün positive Zellen wurden Annexin V positiv und negativ, PI darauf hindeutet, dass sie Apoptotic waren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine direkte und klare Weise zur Erkennung von den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen in Brust CSC-ähnliche Zellen infolge Apoptose Umkehr. Bestätigung der CSC Eigenschaften dieser umgekehrte Zellen könnte gefördert werden, mit der ichn Vitro Mammosphere Bildung Assay und in Vivo Xenograft-Transplantation in immungeschwächte Mäuse18,24,26 ,27,42,43,44,45. Hier verwenden wir zwei Brustkrebszelllinien, aber dieses Protokolls kann weiter in andere Brustkrebszelllinien angewendet werden. Da dieses Phänomen zeigt sich in der Brust Krebs-Zell-Linie welche weniger Zahl der CD44 ist+/CD24– Zellen ursprünglich vorhanden, es empfiehlt sich nicht, um Zell-Linien wie MDA-MB-231 zu wählen, in denen gibt es mehr als 90 % des CD44+ Zellen.
Da gating-Flow-Analyse wichtig ist, sollten angemessene und ausreichende Kontrollen im Voraus vorbereitet werden. Für die Sortierung, sollte die Reinheit auch vor der eigentlichen Entnahme von Zellen festgelegt werden. Beispielsweise um die Reinheit der ersten Sortierung kennen, kann ein kleiner Teil der Zellen (z. B. 10.000 Zellen) gesammelt und erneut ausführen, auf dem Sorter, das Muster der CSC-Marker zu überprüfen. Wenn mehr als 90 % davon sortiert Zellen sind CD44–/CD24+ und erscheinen nicht in der CD44+/CD24– -Region, die gesammelten Zellen sind vermutlich relativ reines (Abbildung 1). Wenn Zellen in die CD44 erscheinen+/CD24– -Region, die Sortierung Region und/oder der Sortierer sollte zurückgesetzt werden. Sortieren sollte so steril wie möglich entweder über einen Sorter in Kultur Kapuze oder Hinzufügen von Antibiotika in der Sammlung und Kulturmedium für sortierten Zellen durchgeführt werden.
Krebs-Zelltypen als Brustkrebs können auch gewählt und induzierte mit verschiedenen apoptotischen Stimuli, die Apoptose-Umkehr-Modell zu etablieren. Während Caspase Aktivierung ab 2 Uhr nachgewiesen werden konnte, sollte die Sortierung Zeit sorgfältig ausgewählt werden. Da Zellen in der Bevölkerung nicht synchronisiert sind, zu einem bestimmten Zeitpunkt darauf, jede Zelle kann verschiedene Stufen der Apoptose erreicht haben. Unterdessen halten Zellen zu einem apoptotischen Tod nach der Aktivierung der Caspase geht. Daher, wenn die Induktoren entfernt werden, nur, wenn alle Zellen Caspase Aktivierung erreichen, einige Zellen möglicherweise bereits die Stufe der DNA-Fragmentierung, so dass sie nicht in der Lage, auch nach Entfernung der Induktor erholen erreicht. Es wird nicht empfohlen, induzieren Apoptose für zu lange Zeit, einen höheren Prozentsatz von Caspase-aktivierten Zellen aber mit den Kosten für eine große Anzahl von Zellen sterben nach der Entnahme aus zu erreichen. Außerdem sollte die Inkubationszeit und die Farbstoff-Konzentration, die Caspase-aktivierten Zellen Etiketten optimiert werden, wenn eine neue Zell-Linie zum ersten Mal verwendet wird.
Ein weiteres Anliegen ab erfolgreich induziert Apoptose Umkehr in der Apoptotic Zellen ist der geringe Verwertungsquote von Zellen (in der Regel weniger als 10 %). Die Zellen sind durch Apoptose- plus -Sortierung Verfahren gegangen; Daher erfordern sie sehr schonenden Umgang während der Zentrifugation und Transfer an der Sammlung und Wiederfreisetzung Schritte. Die Wahl der Platte oder Schüssel verwendet für die nachfolgende Kultur sollten auch nicht abhängig von der Anzahl der Zellen gesammelt, aber auf der erwarteten Anzahl von Rückforderungen. Andernfalls können Zellen zu dünn bereitgestellt werden, um umzukehren und wieder wachsen. Angesichts dieser nicht-Stamm Krebszellen wachsen mit einer höheren Geschwindigkeit und kann in der neu konstituierten Zelle Bevölkerung46dominieren, sollte die Erkennungszeit nicht allzu weit entfernt vom ersten Erholungstag an sein.
Dieser Methode erste Isolate Brust nicht-Stamm Krebszelle dann gilt sie für die Apoptose Induktion wo eine zweite Sortierung erfolgt basierend auf Aktivierung von Caspase bevor Zellen wiederhergestellt werden. Das Wiedererscheinen des CSC-wie Brustzellen in der umgekehrten Bevölkerung wird durch Durchflusszytometrie erkannt. Da dieses in-vitro- Apoptose Umkehrung Verfahren reine Apoptotic Zellen isoliert, kann eine Reihe von Experimenten jetzt durchgeführt werden, um die Folgen dieser echten umgekehrte Zellen zu verstehen. Abgesehen von Brustkrebszellen andere solide Tumorarten sowie hämatologischen malignen Erkrankungen, die mit bekannten CSC-Marker untersucht werden kann und verschiedene Apoptotic Reiz eingesetzt werden. Daher ist diese Methode erweiterbar und auf eine Grenze Bereich Krebs Untersuchung anwendbar.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Innovative Technologie der Innovation Technologie Kassenkommission: Finanzierung Unterstützung durch den Staat Schlüssel Labor der Agrobiotechnologie (CUHK), Lo Qixi-Seong Biomedical Research Fund und Lee Hysan Foundation. Y.X. wurde von der postgradualen Zugehörigkeit aus der CUHK unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40 μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | - | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
References
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