Summary
여기, 선물이 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 유방암 apoptotic 세포를 분리 하 고 추가 cytometry에 의해 apoptosis 반전 후 유방암 줄기 세포와 같은 세포에 유 방 비 줄기 암 세포의 전이 감지 하는 프로토콜.
Abstract
종양학, 암 재발 오래 공부 되었습니다 기본 메커니즘 불분명 하 게 남아 있는 동안. 최근, 우리와 다른 apoptosis 반전 이라는 현상이 다른 자극 아래 다양 한 셀 모델에서 증가 tumorigenicity 리드 발견. 이전 연구 추적 생체 외에서 그리고 vivo에서;이 과정에 초점을 맞춘 되었습니다. 그러나, 진짜 반전된 셀의 절연은 아직 달성, apoptosis 반전의 결과에 대 한 우리의 이해를 제한 하 한다. 여기, 우리가 활용 Caspase-3/7 그린 감지 염료 활성화 caspases와 레이블 셀 apoptotic 유도 후. 긍정적인 신호와 셀 더 형광 활성화 된 세포 복구 (FACS)를 정렬에 의해 밖으로 정렬 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에서 형태학 시험 FACS 전에 apoptotic 상태를 확인 하는 데 도움이 됩니다. Tumorigenicity 증가 암 줄기 세포 (CSC)의 비율에 있는 상승에 종종 표시 될 수 있습니다-세포 처럼. 또한, 유방암의이 주어진,이 CSC 같은 세포의 출처를 식별 것입니다 암 치료에 중요 한. 따라서, 우리는 apoptosis를 트리거링, caspase 활성 세포를 분리 하 고 apoptosis 반전 절차를 수행 하기 전에 유방암 비 줄기 세포를 준비 합니다. 교류 cytometry 분석이 보여준다 유 방 CSC 같은 셀 유 방 CSC 같은 세포는 apoptosis 반전 동안 유방암 비 줄기 세포에서 통과할 나타내는 반전된 그룹에 다시 나타납니다. 요약 하자면,이 프로토콜 cytometry apoptotic 유방암 세포의 분리 및 반전된 셀에 CSC 비율에서 변경의 탐지를 포함 한다.
Introduction
암 국가 전세계1무거운 부담을 일으키는 죽음의 주요 원인이 되었습니다. 유 방 암 암1의 모든 종류 중에서 여성 환자에서 모두 발생률 및 사망률 높은 순위. 암이 성분으로 인해 약물의 조합으로 암 세포 죽음2,,34를 달성 하기 위해 화학 요법에 사용 됩니다. 그러나, 일반적인 화학요법 약물은 종종 DNA5,6대상, 이후 단백질 합성7,는8 또는 microtubule 역학9, 빠르게 성장 하는 세포는 영향을 받는 동안 대부분 암 줄기 세포 (CSC) s 등 무부하 세포는 일반적으로 덜 영향을 받는10. 따라서, CSCs는 약물 내성 및 암에는 나중에 리드10,11재발 치료 후 생존 확률이. 따라서, CSCs의 암 치료에 대 한 중요 한 주제 되 고 CSCs의 기원 연구는 필요 하다.
Apoptosis 반전의 현상에 대 한 더 많은 연구는 최근 10 년간12,13,14,15,,1617,18 에서 수행 되었습니다. , 19.이 개념의 출현 하기 전에 그것은 널리 인정 되어 셀 caspase 활성화 후 apoptosis를 받아야 돌이킬 것입니다. Caspases는 apoptotic 복잡 한 형성 및 다운스트림 기판20의 분열을 포함 하 여, apoptosis의 개시 및 실행 단계에서 주요 역할을 재생 하는 단백질 효소의 가족입니다. 사형 집행 caspases caspase 3 등 7 caspase의 활성화는 "돌아올 수 없는 지점" apoptosis21로 간주 되었습니다. 그러나, 연구원은 최근 관찰 apoptosis 반전 둘 다 생체 외에서 발생 하 고 셀 동안 vivo에서, 는 caspase 활성화12,,1314 이후에 apoptosis에서 복구할 수 있습니다. , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. 또한, 적극적인 기능 반전된 암에 높은 저항 원래 apoptotic 유도 및 높은 침입을 감지와 같은 세포15. 따라서, 그것은 CSC 같은 세포의 비율 apoptosis 반전18후 더 악성 기능에 기여 하는 결국 반전 인구 치료 세포에 비해 더 높을 것 이다 제안 했다.
이전에 많은 노력 되었습니다 apoptosis 반전 생체 외에서 그리고 더 중요 한 것은, vivo에서, 추적 하이 과정16,,1719의 보편성을 확인에 도움이 크게. 그러나, 반전된 셀의 결과 대 한 체계적 연구 진정으로 apoptosis 반전 받은 셀 럽 격리 때문 부족 이다. 순수한 apoptotic 세포를 확보 하 고 추가 연구에 대 한 그들을 복구할 필요가 있다. 따라서, apoptosis에 대 한 "돌아올 수 없는 지점"21 의 표식으로 사형 집행 caspase 활성화의 전통적으로 잘 받아들여 마커를 사용 하 고 형광 활성화 셀 정렬 caspase 활성 셀 스테인드 차별 (FACS)를 활용 Caspase-3/7 그린 검출의 염료와 염료 covalently DEVD 인식 하 고 활성 caspases 3/7에 의해 죽 습 수 있는 짧은 아미노산 시퀀스에 연결 됩니다. 분열 핵 어디 그것은 DNA에 바인딩하고 강한 형광을 방출 하는 cytosol에서 이동 것 이다 염료를 해제 하는 데 도움이 됩니다. 이 절차는 일부 셀 수 없는 받은 apoptosis 대량 세포 인구를 사용 하 여 피할 수 있습니다.
CSCs 또는 종양 시작 셀 하나를 사용 하 여 많은 단단한 종양에서 발견 되었습니다 또는 여러 표면 marker(s)와이 세포의 거의 숫자의 조합 형태로 종양 immunodeficient 쥐22,23, 충분 한 24,25,,2627. CD44 CD24의 조합 일반적으로 사용 되었습니다 가슴 CSC 연구와 CD44+/CD24- 세포 유 방 CSCs26,27,,2829 으로 정의 된 , 30. 최근, apoptosis 반전와 CSCs 제안 된 관계를 확인 하 고 반전된 유방암 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서와 증가 종양 형성 능력을 얻은 것을 입증 하는 실험의 일련을 수행 했습니다 우리는 CSC 마커18셀의 높은 백분율. 우리 유 방 CSCs 더 나은 생존과 따라서 얻을 농축 apoptosis 반전 후 중요 한 것은, 우리가 비 줄기 세포 및 주제를 분리 하는 경우 가능성을 제외 하지 수 있지만 그들 apoptosis 반전, CSC는 원래 비-줄기에 나타날 것입니다. 암 세포 인구, 제안 하는 비-줄기 암 세포 apoptosis 반전 동안 CSCs의 비율에 있는 증가에 기여할 수 있다.
이 문서는 apoptosis 반전 후 유 방 CSC 같은 셀에 유방암 비 줄기 세포에서 전환 설명 cytometry 여이 변화를 감지 하 고 목표로 하고있다. 유 방 비 줄기 암 세포는 처음 CD44 분리 하 여 준비-/CD24+ FACS에 의해 암 세포 유 방. 다음, apoptosis 유도 이며 현미경 형태학 변화에 의해 확인. 이후에, apoptotic 세포 Caspase 3/7 그린 감지 염료에 의해 긍정적으로 표시 FACS에 의해 격리 되며 추가 apoptotic apoptosis 반전에 대 한 inducers의 부재에서 경작. 반전된 셀 다음 흐름 cytometric 분석에 대 한 복구의 7 일 후 CSC 마커 얼룩이 있습니다. CD44 셀+/CD24 전환 비 줄기 암 세포에서 CSC 같은 세포 apoptosis 반전 하는 동안 발생 했습니다 제안- 마커 다시 반전된 인구에 표시.
Apoptosis 반전 여러 암에 관찰 된 세포 뿐만 아니라 정상적인 1 차 셀 체 외12,13다른 apoptotic 자극으로 치료. 이 과정 또한 초파리 에 추적 되었다 vivo에서16,,1719모델. 이 원고에 설명 된 대로 기술을 사용 하 여 다른 암 질환 모델 및 CSCs의 암 재발의 기본 메커니즘에 대 한 많은 정보를 얻을 수 있습니다.
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Protocol
1. 유 방 암 세포를 비 줄기 의 준비
- 문화 MCF-7 고 페 놀 레드 무료 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 100 mm 접시에 보충의 10 mL에 MDA-MB-231 셀. 문화 T47D 10ml 2 m L-글루타민 보충 페 놀 레드 무료 RPMI 1640 매체에에서, 10% 열-비활성화 FBS, 및 1 %v / v 100 mm 접시에 페니실린 스 (PS). 문화는 5% CO2/95% 공기 세포 문화 인큐베이터에서 37 ° C에 세포.
참고: 페 놀 레드 형광 기반 탐지에 영향을 뿐만 아니라31의 에스트로겐과 같은 효과 인해 유방암 세포의 성장에 대 한 잠재적인 영향을 하고있다. 예를 들어 페 놀 레드 수 황 체 호르몬 수용 체 및 MCF-7 셀31의 성장을 자극 하 고 있다. 그것은 또한 T47D 셀31의 성장을 자극할 수 있습니다. - 워시 셀 2 mL의 인산 염을 식 염 수 (PBS)를 두 번 버퍼링. MCF-7 및 MDA-MB-231 또는 0.25 %trypsin-EDTA T47D 세포의 2 개 mL를 0.05% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다.
참고: 트립 신-EDTA의 농도 필요 다른 유 방 암 세포 유형 사이 세포의 분리 다 부적절 한 농도 식 패턴 일부 세포 표면 마커 CD44 및 CD2432등의 영향을 미칠 수 있는 동안. - 문화 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37 ° C에서 5 분 요리. 트립 신-EDTA에 의해 이상 소화에서 세포를 방지 하기 위해 현미경 세포의 분리를 자주 확인 합니다.
- 90% 이상 세포를 분리 때 접시에 완료 된 RPMI 매체의 5 mL을 추가 하 고 여러 번 셀 레이어 표면 플라스틱.
- 15 mL 원뿔 튜브와 원심 분리기에서 300 x g 와 4 ° C 5 분에 대 한 셀을 전송 합니다.
참고: 일반적으로, 약 6 x 106 세포는 confluency 70%에 도달할 경우 100 mm 접시에서 얻을 수 있습니다. - 삭제는 상쾌한 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 FACS 버퍼 (PBS 0.5 %BSA 0.1% 나트륨 아 지 드를 포함)의 106 셀/100 μ에 펠 릿을 resuspend.
- 여러 튜브로 셀을 나눕니다. MCF-7 셀, 4 관으로 셀 분할: 2 isotype 제어, 한 단일 CD24 CD24 긍정적인 제어 및 듀얼 얼룩으로 얼룩이 지기.
- T47D 셀, 3 관으로 셀 분할: 2 isotype 컨트롤과 듀얼 얼룩 한.
- MDA-MB-231 셀, 4 관으로 셀 분할: 2 isotype 제어, 한 단일 CD44 CD44 긍정적인 제어 및 듀얼 얼룩으로 얼룩이 지기.
- 원심 분리기 튜브 300 g 와 4 ° C 5 분에 다시 상쾌한, 삭제 한 다음 추가 Fc 블록 희석 FACS 버퍼에 1시 50분
- 300 x g 에서 원심 분리 전에 어둠 속에서 20 분 동안 얼음에 샘플을 품 어와 4 ° C 5 분에 대 한 삭제는 상쾌한.
- 인간의 CD44에 대 한 단일 클론 항 체 형광 색소 활용 된 추가 (PerCP-Cy5.5) CD24 (PE)는 듀얼에서 (FACS 버퍼)에 1시 40분, 1시 10분 희석에 얼룩 그룹 및. 긍정적인 컨트롤에 대 한 추가 CD44 (PerCP-Cy5.5) MDA-MB-231을 각각 같은 농도에서 MCF-7 셀 CD24 (PE) 추가.
참고: CD44 C24의 조합 유 CSC 연구26,,2728,29,30에서 일반적으로 사용 되었습니다. - Isotype 컨트롤 그룹에 대 한 추가 PerCP Cy5.5 마우스 IgG2b, 1시 40분에서 κ CD44 항 체 및 PE 마우스 IgG2a, κ 1시 10분에 isotype 컨트롤로 희석 106 셀/100 μ에서 CD24 항 체 isotype 제어로 희석.
참고: 관심의 항 체 Isotype 컨트롤 부정적인 컨트롤33으로 권장 됩니다. - 300 x g 에서 30 분 원심 분리기에 대 한 어둠 속에서 4 ° C에서 (1.12, 1.13 단계)에서 샘플을 품 어와 4 ° C 5 분에 대 한 삭제는 상쾌한.
- PBS와 원심 분리기에서 300 x g 와 4 ° C 5 분의 500 μ로 두 번 펠 릿을 세척.
- 형광 활성화 셀 정렬에서 실행 하기 전에 0.5 ml PBS 및 40 µ m 나일론 메쉬 통해 필터의 펠 릿을 resuspend.
- 게이팅 및 보상 목적 MCF-7 안티-CD24 PE 활용 된 항 체와 세포 얼룩 하 고 긍정적인 컨트롤로 안티-CD44 PerCP Cy5.5 활용 된 항 체와 MDA-MB-231 셀 얼룩. 세포 (그림 1) 부정적인 컨트롤로 isotype 컨트롤과 스테인드를 사용 합니다.
- CD44 셀 수집-/CD24+ 컬렉션 매체 (페 놀 레드 무료 RPMI 1640 매체 20% 열 비활성화 FBS 및 2 %v / v PS 보충)의 1 mL를 포함 하는 라운드-하단 폴리스 티 렌 12 x 75 m m 튜브에 마커. 5 분에 대 한 g 와 RT x 300에 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한.
참고: 유방암 세포에서 CSC 같은 셀 CD44로 정의 된+/CD24- 셀26,,2728,29,30및 유 방 암 세포를 비 줄기 CD44로 정의 된다-/CD24+ 세포18 (그림 1). - 정렬된 유방암 비 줄기 세포 추가 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화에 대 한 신선한 컬렉션 매체를 포함 하는 문화 접시에 접시
2. Apoptotic 유도 및 탐지
- 1 mM staurosporine12,34 DMSO에 준비 합니다. 치료 MCF-7 그룹에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 마지막 볼륨 (2.5 μ M staurosporine)의 최대 10 mL를 만들려고 MCF-7 셀의 완성 된 매체를 1 m m staurosporine의 25 μ를 추가 합니다. 콘텐츠를 균등 하 게 혼합 플라스틱.
- 셀에서 문화 매체를 제거, 2 mL PBS의 셀을 한 번 씻어. 6 h 세포 밀도 도달 하면 70% confluency apoptosis를 유도 하기 위한 MCF-7 셀에 2.5 μ M staurosporine와 매체의 10 mL를 추가 합니다.
- 1mm paclitaxel35,36 DMSO를 준비 합니다. 대우 T47D 그룹에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 10 mL (5 μ M paclitaxel)의 최종 볼륨을 T47D 셀의 완성 된 매체를 1mm paclitaxel의 12.5 μ를 추가 합니다. 콘텐츠를 균등 하 게 혼합 플라스틱.
- 문화 매체는 셀에서 제거 하 고 2 mL PBS의 셀을 한 번 씻어. 10 h 세포 밀도 도달 하면 70% confluency apoptosis를 유도 하는 것에 대 한 T47D 셀에 5 μ M paclitaxel와 매체의 10 mL를 추가 합니다.
참고: 유도 시간 및 apoptosis를 유도 하는 inducers의 농도 새로운 셀 라인을 처음으로 사용 될 때마다 최적화 되어야 합니다. - 용 매 처리 MCF-7 그룹에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 살 균 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 25 μ MCF-7 셀 10 mL (즉, 0.25 v/v %DMSO)의 최종 볼륨을 완성 된 매체에 추가 합니다. 콘텐츠를 균등 하 게 혼합 플라스틱.
- 용 매 처리 MCF-7 셀에서 문화 매체를 제거, 2 mL PBS의로 한 번 씻어. 다음 sts 용 컨트롤로 0.25 %v / v DMSO 6 h에 대 한 매체의 10 mL를 추가 합니다.
- 용 매 처리 T47D 그룹에 대 한 살 균 DMSO의 5 μ 10 mL 마지막 볼륨 (즉, 0.05 v/v %DMSO) 15 mL 원뿔 튜브에 게 T47D 셀의 완성 된 매체를 추가 합니다. 콘텐츠를 균등 하 게 혼합 플라스틱.
- 용 매 처리 T47D 세포에서 문화 매체를 제거, 2 mL PBS의로 한 번 씻어. 그런 다음, paclitaxel에 대 한 용 매 컨트롤로 0.05 %v / v DMSO 10 h에 대 한 매체의 10 mL를 추가 합니다.
- 치료 세포의 형태학 적 변화를 관찰, 얼룩 50 셀 Mitotracker 레드 CMXRos 및 250 ng/mL Hoechst 33342, 그리고 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37 ° C에서 또 다른 20 분 동안 품 어. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (그림 2) x 60에서 전형적인 apoptotic 세포 형태를 관찰 합니다.
참고: 전형적인 apoptosis 형태학 셀 수축, 막 blebbing, 미토 콘 드리 아 조각화 및 핵 응축을 포함 하지만 그대로 세포 막12,,1314,15 ,,1837.
3. 절연 Apoptotic 세포의 Apoptosis 반전 절차
- 모두는 apoptotic 유도 및 용 매-대우 MCF-7 또는 T47D 셀 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37 ° C에서 30 분 동안 어둠 속에서 106/mL의 셀 농도에서 3 μ M Caspase-3/7 그린 감지 염료와 얼룩.
- 40 µ m 나일론 메쉬를 통해 셀 정렬 정렬에서 실행 하기 전에 필터링 합니다.
- 게이팅 목적, 먼저 주요 인구 (R1) 문 고 점 앞으로 분산형 및 사이드 분산형 (그림 3)에서 그래프를 그려서 파편을 제외 합니다.
- 부정적인 지역 (R2) 게이트를 부정적인 제어로 Caspase-3/7 그린 감지 염료를 추가 하지 않고 치료 세포를 사용 하 여 (그림 3A).
- 셀 staurosporine12,,1834 24 h에 대 한 치료와 긍정적인 컨트롤로 염료와 스테인드 긍정적인 지역 (R3) 게이트를 사용 하 여 (그림 3B).
- 라운드-하단 폴리스 티 렌 12 x 75 m m 튜브 (동일 단계 1.18에서에서 컬렉션 매체) (그림 3C-3D) 수집 매체의 1 mL를 포함 하는 유도 치료 그룹에서 긍정적인 세포 (R3)를 수집 합니다. 5 분에 대 한 g 와 RT x 300에 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 컬렉션 단계 3.6 (그림 3E-3F)에서 매체의 1 mL와 함께 라운드 하단 폴리스 티 렌 12 × 75 m m 튜브에서 용 매 처리 그룹에서 부정적인 세포 (R2)를 수집 합니다.
참고: (예: 10000 셀) 셀의 작은 부분 수집 하 고 다시 활성 caspases 표시자의 패턴을 확인 하려면 정렬에서 실행 수 있습니다. 이상 정렬된 용 매 처리 세포의 90%는 caspase 부정적인 지역에 표시 됩니다 또는 이상의 정렬 된 유도 치료 세포의 90 %caspase 긍정적인 영역에 표시 됩니다, 이러한 수집 된 셀 비교적 순수 (그림 3 C-3 층) 될 여겨진다. 그렇지 않으면, 정렬 영역 및/또는 정렬 해야 합니다 다시 설정. - 신선한 수집 매체에서 정렬된 셀을 resuspend 하 고 apoptosis 반전에 대 한 일 동안 그들을 12 음 조직 문화 접시에 5% CO2/95% 공기의 분위기에서 37 ° C에서 문화 씨앗.
4. Caspase 활성 세포 에 있는 Apoptosis의 확인
- 혼합 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 그리고 2.5 m m CaCl2 annexin 바인딩 버퍼 (pH 7.4)을 준비 하. 4 ° C에서 버퍼를 저장 하 고 빛에 노출에 버퍼를 피하십시오.
- PI 재고 솔루션 annexin 바인딩 버퍼의 45 µ L에서 1mg/mL의 5 µ L diluting 하 여 propidium 요오드 화물 (PI)의 100 µ g/mL 작업 솔루션을 준비 합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장 하 고 빛에 노출에 대 한 해결책을 피하십시오.
참고: PI는 잠재적인 돌연 이며 신중 하 게 처리 되어야 한다. - 2.1 ~ 2.5 단계에서 유도 치료 셀을 준비 합니다.
- 셀을 분리 하려면 3-5 x 셀 레이어 위에 매체를 pipetting으로 유도 치료 MCF-7 또는 T47D 세포를 수집 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송.
- 5 분 삭제는 상쾌한 g 와 RT x 300에 원심.
- Resuspend 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 106/mL의 셀 농도에서 완료 된 매체와 셀 및 셀 37 ° c.에 30 분 동안 어둠 속에서 3 μ M Caspase 3/7 그린 감지 염료와 얼룩
- 5 분은 supernatants 삭제에 대 한 300 x g 와 RT에 원심.
- 얼음 처럼 차가운 PBS와 300 x g 에서 원심 분리기의 1 mL로 세포 세척 하 고 4 ℃ 5 분에 대 한 삭제는 supernatants.
- Annexin V 켤레의 추가 5 μ와 annexin 바인딩 버퍼의 100 μ 셀 resuspend 100 µ g/mL의 1 µ L 작업 솔루션을 각 100 μ 셀 서 스 펜 션의 파이 하 고 실 온에서 15 분에 대 한 셀을 품 어.
참고: Annexin V와 PI는 일반적으로 함께 사용 흐름 cytometry38,,3940apoptotic 세포를. - 부드럽게 annexin 바인딩 버퍼, 믹스의 400 µ L를 추가 합니다. 교류 cytometer에서 실행 하기 전에 얼음 샘플을 유지.
5. 유 방 CSC 같은 셀 Cytometry 측정
- 0.05% 트립 신-EDTA와 두 유도 또는 용 매 처리 그룹에서 반전된 MCF 7 수확. T47D 셀 두 유도 또는 용 매 처리 그룹에서 또는 0.25 %trypsin-EDTA 단계 1.2 ~ 1.5로 수확.
- 인간의 CD44에 대 한 단일 클론 항 체 형광 색소 활용 된 셀 얼룩 (PerCP-Cy5.5)와 단계 1.12 같이 CD24 (PE). 한편, 준비 단계 1.13에서 isotype 컨트롤.
- 교류 cytometer 세포 실행 하 고 CD44 포함 된 셀의 비율을 감지+/CD24- 마커.
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Representative Results
전환 가슴에서 유 방 CSC 같은 셀, CD44의 첫 번째 정렬 비 줄기 암 세포를 관찰 하기 위해-/CD24+ 유방암 세포 필요 했다. MCF-7 셀 라인을 약 0.15% 원래 인구 (그림 1),이 단계에서에서 CSC 표식이 있는 셀 있었습니다 apoptosis 반전 하는 동안 CSC 농축의 가능성을 제외. 그와 반대로, 원래 인구에서 CSC 표식이 있는 셀을 확인 하 고 있었다와 같은 T47D 세포 (그림 1)에 대 한이 정렬 절차 수 있습니다. 생략할 수 있습니다. 실제로, gating 긍정 부정적인 결국 CSC 결정의 비율에 영향을 미칠 것입니다 각 마커의 정의 영향을. 따라서, 적절 한 컨트롤의 항 체 isotype 컨트롤을 포함 하 여, 각 표식에 대 한 단일 스테인드 컨트롤 해야 신중 하 게 선택 되며 게이트 조정 (그림 1)에 대 한 준비.
유 방 비 줄기 암 세포 apoptosis 반전 모델 그 후 수립 될 수 있습니다. Apoptotic inducers를 추가한 후 일반적인 형태학 상 변화를 관찰 될 수 있었다 고 셀 약물 철수 (그림 2) 후 비슷한 형태와 apoptosis에서 복구 한다. Caspase-3/7 Caspase-3/7 그린 감지 염료에 아미노산 시퀀스 DEVD 인식 하 고 활성 형태의 caspase-3/7이 사이트41쪼개 다 수 있습니다. 원래, cytosol에서 Caspase-3/7 그린 감지 염료의 형광 염료 죽 습 핵 translocated 경우 형광 신호 핵에 dna 바인딩 후 증폭 될 것 이다 동안 취약 하다. 이 명백한 차이 cytometry에 의해 구별 될 수 있습니다. 따라서, caspase 활성 셀 셔 서 수 있고 그들의 더 높은 형광 강도 비교 caspase 활성화 (그림 3A-3D) 없이 그에 따라 밖으로 정렬. Apoptotic 유도 과정에서 적절 한 용 매 컨트롤이 포함 되어야 합니다: caspase 활성화 없이 셀 용 매 처리 수집 된 (그림 3E 및 3F) FACS 프로시저 또는 용 매 자체는 가능성을 제외 하 전환, 있는 경우에 대 한 원인입니다.
FACS 정렬 caspase 활성 셀 apoptotic 실제로 했다 보여, 우리는 공동 Annexin V와 PI 이러한 셀 스테인드. Apoptotic 세포의 초기 변화 중 하나는 셀13,38,,3940;의 외부 표면에 플라즈마 막의 안쪽에서 phosphatidylserine의 전 이 외부화 phosphatidylserine의 Annexin V에 의해 검출 될 수 있습니다. 이 변화는 apoptosis를 고유 하지 않습니다, 하는 동안에서 세포 막의 무결성에 따라 괴 사 apoptosis를 구별을 위한 PI는 사용할 수 있습니다. 따라서, 셀 Annexin V 바인딩 하지만 PI 얼룩 없이 apoptotic 세포로 간주 됩니다. Apoptotic 유도 치료 그룹에서 Caspase 활성 셀 네거티브, 그들이 apoptotic 세포 (그림 4) 제안 Annexin V 긍정적인 고 파이을 발견 했다.
후 두 번째 정렬 apoptotic 세포에서 caspase의 활성화에 따라, 이러한 apoptotic 세포 수집 되었고 그 후 복구에 대 한 교양. 살아있다는 반전된 셀 문화 컨테이너 하단을 연결 하 고 증식을 계속 하 수 있었다. 7 일 후 CD44 CD24의 얼룩 수행 되었다 반전된 셀에서 컨트롤 앞으로 동시에 준비 하는 동안. 용 매 처리 그룹 (그림 1)에 비해, 흐름 cytometric 분석 이벤트 (셀)는 CD44에 있었다 보였다+/CD24- 사분면 반전된 유 방 암 비 줄기 세포 인구 (그림 1)에서 . 때문에 우리가 이미 CD44 셀 제외 했다+/CD24- apoptosis 유도 및만 CD44 사전-/CD24+ 유방암 비 줄기 세포 선택 되었다면, 이러한 CD44+/CD24- CSC 같은 셀 수만 apoptosis 반전 동안 유방암 비 줄기 세포에서 통과할.
그림 1: 대표 유 CSC 표식 cytometry에 유방암 세포에 얼룩.
MCF-7, MDA-MB-231, T47D 인간 CD44에 대 한 단일 클론 항 체 형광 색소 활용 된 물 했다 (PerCP-Cy5.5) 및 CD24 (PE). 셀 앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) (P1) 파편을 제외 하 여 문이 먼저 했다. CD24와 CD44 Isotype 컨트롤 했다 부정적인 컨트롤로 CD24와 CD44 각각 사용. MCF-7 셀 CD24로 얼룩진 CD24 긍정적인 제어로 사용 되었다 고 MDA-MB-231 셀 CD44로 얼룩진 CD44 긍정적인 제어로 사용 되었다. 비-줄기 MCF-7 유방암 세포 (P2) 정렬 했다. 이러한 정렬된 셀 및 T47D 세포 apoptosis 반전 절차를 받게 되었다. CSC 형 (CD44+CD24-) 세포 apoptosis 반전 후 등장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: apoptotic 자극 유도에서 유방암 세포의 형태학 변화.
유방암 세포 전형적인 apoptotic 세포 수축, 막 blebbing, 미토 콘 드리 아 조각화 (흑백 그림에 노란색 화살표) 및 핵 응축을 포함 한 형태학 변화를 보였다. (파란색)으로 핵: Hoechst 33342 물 세포의 핵에 파란색 표시 했다. (분홍색)에서 미토 콘 드리 아: Mitotracker 레드 CMXRos 물 세포의 미토 콘 드리 아 핑크 컬러로 표시 했다. 병합: 수치는 미토 콘 드리 아와 핵을 보여주는 듀얼 컬러로 병합. (회색)에서 미토 콘 드리 아: Mitotracker 레드 CMXRos 물 세포의 미토 콘 드리 아 흑백 표시 했다. 차동 간섭 콘트라스트 (DIC): 전체 셀. 위: MCF-7 셀 6 h에 대 한 staurosporine (STS)로 치료 후 24 h. 낮은 대 한 반전: T47D 셀 10 h 24 h. 규모 바에 대 한 반전으로 paclitaxel로 치료 했다 20 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 정렬 Caspase 활성화 분석. (A) 흠 없는 MCF-7 세포 없이 staurosporine (STS) 치료는 부정적인 제어 (R2)로 사용 되었다. (B) R3 영역의 24 헤 셀 caspase 활성 셀으로 간주 되었다 위한 MCF-7 셀 staurosporine (STS)로 치료. (C) MCF-7 세포 치료 staurosporine (STS) R3 영역의 6 헤 셀 FACS 정렬 했다. (D) FACS 정렬 caspase 활성 MCF-7 셀 6 h에 대 한 staurosporine (STS) 치료 후 다시 실행 했다. (E) DMSO 치료 MCF-7 셀. (F) FACS 정렬 셀 6 h를 위한 DMSO 처리 후 caspase 활성화 없이 다시 실행 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Annexin V 및 PI cytometry caspase 활성 셀의 얼룩. MCF-7 및 T47D 셀 앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) (P1) 파편을 제외 하 여 문이 첫째로 했다. Apoptotic inducers와 어떤 얼룩 없이 치료 되지 않은 셀은 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. Apoptotic inducers로 치료 하는 셀에 대 한 caspase 활성 셀 [즉, Caspase-3/7 그린 긍정적인] 선정 됐다 (P3) Annexin V 및 PI 얼룩의 형광 강도 표시. 모든 Caspase-3/7 그린 긍정적인 세포 Annexin V 양수와 PI 네거티브, 그들이 apoptotic 제안 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 apoptosis 반전으로 인해 유 방 CSC-같은 세포로 유방암 비 줄기 세포의 변화를 탐지 하기 위한 직접적이 고 명확한 방법을 설명 합니다. 이러한 반전된 셀의 CSC 속성의 확인 in vitro mammosphere 형성 분석 결과 그리고 vivo에서 이 종이 식 이식 immunodeficient 쥐18,24,26 사용 하 여 지원 될 수 있습니다. ,27,,4243,44,45. 여기, 우리는 두 유 방 암 세포 선, 사용 하지만이 프로토콜 추가 다른 유 방 암 세포 라인에 적용할 수 있습니다. CD44의 어떤 적은 수에서 유 방 암 세포 라인에서이 현상 이므로+/CD24- 세포는 원래 존재, 그것은 제안 하지 MDA-MB-231는 CD44의 90%는 같은 줄의 셀 선택+ 셀입니다.
게이팅 흐름 분석에 중요 한 때문에, 적절 하 고 충분 한 컨트롤을 사전에 준비 되어야 한다. 정렬, 순도 셀의 실제 컬렉션 하기 전에 결정 되어야 합니다. 예를 들어 첫 번째 정렬의 순도 알고, (예: 10000 셀) 셀의 작은 부분 수 수집 되며 CSC 마커의 패턴을 확인 하려면 정렬에서 다시 실행. 이들의 90% 이상 정렬 되 면 세포는 CD44-/CD24+ 는 CD44에 표시 되지 않습니다 및+/CD24- 지역, 수집 된 세포는 것으로 비교적 순수 (그림 1). 세포는 CD44에 표시 하는 경우+/CD24- 지역, 정렬 영역 및/또는 정렬 다시 설정 해야 합니다. 정렬 한다 실시 문화 후드 내부 정렬을 사용 하 여 또는 수집 및 정렬 된 셀에 대 한 문화 매체에서 항생제를 추가 하 여 최대한 무 균.
유방암 이외의 암 세포 유형 또한 선택 하 고 apoptosis 반전 모델을 설정 하는 다양 한 apoptotic 자극으로 유발 수 있습니다. Caspase의 활성화는 빠르면 2 h 검출 될 수, 하는 동안 정렬 시간 신중 하 게 선택 되어야 합니다. 세포 인구에서 동기화 되지 않은 때문에 하나의 특정 시간에 점, 각 세포 apoptosis의 다른 단계에 도달 했습니다 수 있습니다. 한편, 세포는 apoptotic 죽음 caspase의 활성화 후에 계속. 따라서,는 inducers 모든 셀 caspase 활성화에 도달 하는 경우에 제거 하는 경우 일부 셀 수 있습니다 이미 도달 했습니다 유도 제거 후에 복구할 수 없습니다 그들을 만드는 DNA 파편의 무대. 하지 caspase 활성 셀의 하지만 컬렉션 후 죽어 세포의 많은 수의 비용으로 더 높은 비율을 달성 하기 위해 너무 긴 시간에 대 한 apoptosis를 유도 하는 것이 좋습니다. 게다가, 보육 시간 및 caspase 활성 셀 라벨 염료 농도 최적화 되어야 합니다 새로운 셀 라인을 처음으로 사용 될 때마다.
성공적으로 유도 하는 apoptotic 세포에 있는 apoptosis 반전으로 또 다른 관심사는 세포 (보통 10%)의 낮은 복구입니다. 세포는 apoptosis 플러스 정렬 프로시저; 겪 따라서, 그들은 원심 분리 및 수집 및 물의 resuspension 단계에서 전송 하는 동안 매우 부드러운 처리를 해야합니다. 또한, 격판덮개 또는 접시 후속 문화에 대 한 사용의 선택의 여지가 있지만 복구의 예상된 번호 수집 하는 셀의 수에 의존 수 없습니다. 그렇지 않으면, 셀과 다시 성장 너무 띄엄띄엄 할당 될 수 있습니다. 그 비 줄기 암 세포는 더 높은 속도에서 성장 하 고 다시 구성된 세포 인구46에 지배 수 있습니다 감안할 때, 검출 시간 해서는 안됩니다 너무 멀리 떨어져 복구 첫날에서.
이 방법은 첫 번째 분리 유 방 암 세포를 비 줄기 다음 apoptotic 유도 두 번째 정렬 이루어집니다 세포 복구 얻을 전에 caspase의 활성화에 따라 적용. 반전에 유 방 CSC 같은 셀의 다시 모양은 cytometry에 의해 감지 됩니다. 이후이 생체 외에서 apoptosis 반전 절차 순수한 apoptotic 세포 분리, 다양 한 실험 지금이 진짜 반전된 셀의 결과 이해 하 수행할 수 있습니다. 유방암 세포, 떨어져 다른 단단한 종양 유형으로 알려진 CSC 마커는 혈액 암 공부 될 수 있다 하 고 다양 한 apoptotic 자극을 사용할 수 있습니다. 따라서,이 메서드는 확장 가능 하 고 암 사의 공격 병 범위에 적용 가능한.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 혁신적인 기술 펀드의 혁신 기술 위원회에 의해 지원 되었다:는 주 키 연구소의 Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee 성 생물 의학 연구 기금과이 Hysan 재단에서 자금 지원. Y.X.는 CUHK에서 대학원 재학에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40 μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | - | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
References
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