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Cancer Research

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules apoptotiques de cancer du sein par un tri de fluorescence-lancée de cellules et plus détecter le passage de cellules non souches du cancer du sein de cellules de cellules souches-comme pour le cancer du sein après le renversement de l’apoptose par cytométrie en flux.

Abstract

Récidive du cancer a longtemps étudié par les oncologues tandis que les mécanismes sous-jacents demeurent obscures. Récemment, nous et autres découvrirent qu’un phénomène appelé apoptose inversion entraîne tumorigénicité accrue dans différents modèles de cellule sous différents stimuli. Des études antérieures ont surtout portés sur le suivi de ce processus in vitro et in vivo ; Toutefois, l’isolement de cellules réelle inversées doit encore à atteindre, qui limite notre compréhension sur les conséquences de l’inversion de l’apoptose. Ici, nous profitons d’un colorant de la Caspase-3/7 vert détection pour marquer les cellules avec des caspases activés après l’induction de l’apoptose. Cellules avec des signaux positifs sont plus triés par cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour la récupération. L’examen morphologique en microscopie confocale permet de confirmer le statut d’apoptotic avant FACS. Une augmentation de la tumorigénicité peut souvent être attribuée à l’élévation du pourcentage de cellules de souches du cancer (SCC)-comme des cellules. Aussi, compte tenu de l’hétérogénéité du cancer du sein, identifier l’origine de ces cellules CSC serait essentiel pour le traitement du cancer. Ainsi, nous préparons des cellules-souches non cancéreuses du sein avant le déclenchement de l’apoptose, isoler les cellules activées caspase et effectuez la procédure d’inversion de l’apoptose. Analyse en cytométrie en flux révèle que cellules mammaires CSC ré-apparaissent dans le groupe inversé, indiquant les cellules mammaires CSC sont transités de cellules-souches non cancéreuses du sein au cours de l’inversion de l’apoptose. En résumé, ce protocole inclut l’isolement des cellules de cancer du sein apoptotic et détection des variations en pourcentage de la CSC dans les cellules inversées par cytométrie en flux.

Introduction

Le cancer a été des principales causes de la mort, provoquant le lourd fardeau aux pays dans le monde1. Le cancer occupe un rang élevé, tant en termes d’incidence et de mortalité chez les femmes entre tous les types de cancer1. En raison de l’hétérogénéité du cancer, une combinaison de médicaments est habituellement utilisée en chimiothérapie pour atteindre cancer cell death2,3,4. Cependant, puisque la communes médicaments chimiothérapeutiques ciblent souvent ADN5,6, synthèse7,8 et/ou microtubule dynamique des protéines9, les cellules à croissance rapide sont touchés le plus tout en les cellules quiescentes comme cancer stem cell (CSC) s sont généralement moins touchées10. CSC n’est donc plus susceptibles de survivre après le traitement, qui conduit plus tard à la résistance aux médicaments et le cancer rechute10,11. Par conséquent, élimination des CSC est devenu un sujet important pour le traitement du cancer et étude de l’origine des CSC est nécessaire.

D’autres études sur le phénomène de l’inversion de l’apoptose ont été réalisées dans les dix dernières années12,13,14,15,16,17,18 , 19. avant l’émergence de ce concept, il a été largement acceptée que les cellules subiront irréversiblement l’apoptose après l’activation de la caspase. Caspases sont une famille d’enzymes de protéines qui jouent un rôle clé dans les stades initiation et l’exécution de l’apoptose, y compris la formation de complexes apoptotiques et le clivage des substrats en aval20. Activation des caspases bourreau comme caspase 3 ou caspase 7 a été considérée comme le « point de non retour » pour l’apoptose21. Toutefois, les chercheurs ont observé récemment que l’apoptose inversion produit deux études in vitro et in vivo, au cours de laquelle les cellules peut récupérer l’apoptose même après caspase activation12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. en outre, caractéristiques agressives comme une résistance plus élevée à l’original inducteur d’apoptose et techniques plus invasives sont détectés dans le cancer inversé cellules15. Par conséquent, il a été proposé que le pourcentage de cellules semblables à des CSC serait plus élevé dans la population inversée par rapport aux cellules non traitées, éventuellement contribuer aux fonctionnalités plus malignes après l’apoptose inversion18.

Auparavant, beaucoup s’est efforcé de suivre le renversement de l’apoptose in vitro et, plus important encore, in vivo, qui contribuent grandement à confirmer l’universalité de ce processus16,17,19. Cependant, une étude systémique sur les conséquences des cellules inversées manque en raison de l’isolement insatisfaisante des cellules qui ont véritablement fait l’objet d’inversion de l’apoptose. Il est nécessaire d’acquérir des cellules apoptotiques pure et les récupérer pour complément d’étude. Ainsi, nous utilisons le marqueur traditionnellement reconnu de l’activation des caspases bourreau comme marqueur du « point of no return »21 d’apoptose et utiliser la cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour discriminer les caspases activées cellules colorées avec de la teinture de la Caspase-3/7 vert détection. Le colorant est lié par covalence à une séquence d’acide aminés court, hanane, qui peut être reconnu et clivé par active caspases 3/7. Le clivage aide à libérer la teinture, qui va effectuer des transferts du cytosol vers le noyau où il se lie à l’ADN et émet une fluorescence forte. Cette procédure évite d’utiliser une population de cellules en vrac dans lequel certaines cellules ne peuvent pas avoir subi l’apoptose.

CCF ou déclenchant les tumeurs des cellules ont été identifiés dans nombreuses tumeurs solides à l’aide d’un seul ou une combinaison de plusieurs marqueurs de surface et très peu de nombre de ces cellules ne suffisent pas à former des tumeurs dans des souris immunodéficientes22,23, 24,25,26,27. Une combinaison de CD44 et CD24 a été couramment utilisée dans les études du sein CSC et CD44+/CD24– cellules ont été définis comme la poitrine CSC26,27,28,29 , 30. récemment, nous avons effectué une série d’expériences pour confirmer la relation proposée entre le renversement de l’apoptose et CCS et démontrer que les cellules cancéreuses mammaires inversé acquise capacité accrue de formation tumorale in vitro et in vivo avec un pourcentage élevé de cellules avec des marqueurs de CSC18. Bien que nous ne pourrions pas exclure la possibilité que du sein CSCs survivent mieux et ainsi obtenir enrichis après le renversement de l’apoptose, ce qui est important, lorsque nous isoler des cellules souches non cancéreuses et sujet à l’inversion de l’apoptose, CSC verront le jour dans l’origine non souches population de cellules de cancer, ce qui suggère que non-souches du cancer, les cellules peuvent contribuer à l’augmentation du pourcentage de CSC au cours de l’inversion de l’apoptose.

Cet article a pour but de démontrer le passage de cellules-souches non cancéreuses du sein à CSC-comme les cellules du sein après le renversement de l’apoptose et de détecter cette transition par cytométrie en flux. Les cellules souches non cancéreuses sont préparés au départ en isolant CD44–/CD24+ sein des cellules cancéreuses par FACS. Puis, l’apoptose est induite et confirmé par des changements morphologiques sous le microscope. Par la suite, les cellules apoptotiques positivement marqué par le colorant vert détection Caspase 3/7 sont isolées par FACS et ensuite mis en culture en l’absence d’apoptotic inducteurs d’inversion de l’apoptose. Les cellules inversés sont ensuite colorées avec des marqueurs de la CSC après 7 jours de récupération pour cytométrie. Cellules avec CD44+/CD24– marqueurs reparaissent dans la population inversée, ce qui laisse supposer que transition entre cellules souches non cancéreuses et des cellules semblables à CSC est apparue au cours de l’inversion de l’apoptose.

Inversion de l’apoptose a été observée dans le cancer de plusieurs lignées cellulaires comme les cellules primaires normales traitées avec des stimuli apoptotiques différents en vitro12,13. Ce processus a également été suivi chez la drosophile modèle in vivo16,17,19. Beaucoup d’informations concernant le mécanisme sous-jacent de rechute du cancer dans les modèles de la maladie de cancer différents et l’origine des CSC peut être obtenue par l’utilisation de la technique que décrit dans ce manuscrit.

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Protocol

1. préparation du cancer du sein Non-souches de cellules cancéreuses

  1. La culture MCF-7 et les cellules MDA-MB-231 dans 10 mL de milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sans rouge de phénol additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) dans un plat de 100 mm. Culture T47D dans 10 mL d’un milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol additionné de 2 mM de L-glutamine, 10 % inactivés par la chaleur SVF et 1 % v/v pénicilline-streptomycine (PS) dans un plat de 100 mm. Cellules de culture à 37 ° C dans une étuve de culture de cellule air 5 % CO295 %.
    Remarque : Rouge de phénol affecte la détection par fluorescence, mais a également une influence potentielle sur la croissance des cellules cancéreuses du sein en raison de ses effets oestrogène31. Par exemple, rouge de phénol pourraient stimuler les récepteurs de progestérone et la croissance de cellules MCF-731. Il pourrait également stimuler la croissance des cellules de T47D31.
  2. Laver les cellules avec 2 mL de phosphate solution saline tamponnée (PBS) deux fois. Ajouter 2 mL de 0.05 % trypsine-EDTA à MCF-7 et MDA-MB-231 ou 2 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA aux cellules T47D.
    Remarque : La concentration de la trypsine-EDTA nécessaire pour la séparation des cellules entre les types de cellules du cancer du sein différents varient alors qu’une concentration inadéquate peut affecter le modèle d’expression de certains marqueurs de surface cellulaire comme CD44 et CD2432.
  3. La culture la vaisselle pendant 5 min à 37 ° C sous une atmosphère d’air de 95 % 5 % CO2. Vérifiez régulièrement le détachement des cellules au microscope afin d’empêcher les cellules provenant de la digestion par la trypsine-EDTA.
  4. Lorsque plus de 90 % des cellules détachement, ajouter 5 mL de milieu rempli de RPMI au plat et il pipette au-dessus de la surface de couche de cellule plusieurs fois.
  5. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min.
    Remarque : Habituellement, environ 6 x 106 cellules peuvent provenir d’un plat de 100 mm quand la confluence atteint 70 %.
  6. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pellets à 106 cellules/100 μL de tampon de FACS (PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,1 % d’azide de sodium) dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
  7. Diviser les cellules en plusieurs tubes. Pour les cellules MCF-7, diviser les cellules en 4 tubes : deux pour l’isotype contrôles, l’un pour CD24 unique coloration comme CD24 contrôle positif et une autre pour la double coloration.
  8. Pour les cellules T47D, diviser les cellules en 3 tubes : deux isotypes contrôles et une double coloration.
  9. Pour les cellules MDA-MB-231, diviser les cellules en 4 tubes : deux pour l’isotype contrôles, l’un pour CD44 unique coloration comme CD44 contrôle positif et une autre pour la double coloration.
  10. Centrifuger les tubes à nouveau à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min. éliminer le surnageant et ajoutez bloc Fc dilué 01:50 dans le tampon de FACS.
  11. Incuber les échantillons sur la glace pendant 20 min dans le noir avant la centrifugation à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  12. Ajouter fluorochrome-conjuguées des anticorps monoclonaux contre CD44 humain (PerCP-Cy5.5) et la coloration CD24 (PE) à 01:40 et 01:10 dilutions (dans un tampon FACS) dans le deux groupes. Pour les contrôles positifs, ajouter CD44 (PerCP-Cy5.5) à MDA-MB-231 et ajouter CD24 (PE) pour les cellules MCF-7 à la même concentration, respectivement.
    Remarque : La combinaison du CD44 et C24 a été couramment utilisée dans poitrine CSC étude26,27,28,29,30.
  13. Pour les groupes de contrôle isotype, ajouter PerCP-Cy5.5 souris IgG2b, κ à un 01:40 dilution comme le contrôle de l’isotype d’anticorps CD44 et PE souris IgG2a, κ à un 01:10 dilution comme le contrôle de l’isotype d’anticorps CD24 à 106 cellules/100 μL.
    Remarque : Isotype contrôles pour des anticorps d’intérêt sont recommandés comme témoins négatifs33.
  14. Incuber les échantillons (à partir de mesures 1.12 et 1.13) à 4 ° C dans l’obscurité pour 30 min. centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  15. Laver le culot deux fois avec 500 μl de PBS et centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min.
  16. Resuspendre le culot dans 0,5 mL de PBS et filtrer sur une maille en nylon de 40 µm avant d’exécuter sur une trieuse fluorescence-lancée de cellules.
  17. Aux fins de blocage et indemnisation, tache des cellules MCF-7 avec des anticorps anti-CD24 PE conjugué et tacher les cellules MDA-MB-231 avec anticorps anti-CD44 PerCP-Cy5.5-conjugué comme témoins positifs. Utiliser des cellules colorées avec isotype contrôles comme des contrôles négatifs (Figure 1).
  18. Prélever des cellules avec CD44–/CD24+ marqueurs dans des tubes de fond rond en polystyrène 12 x 75 mm contenant 1 mL de milieu (exempt de rouge de phénol RPMI 1640 milieu additionné de 20 % inactivés par la chaleur FBS et 2 % v/v PS) de la collection. Centrifuger les tubes à 300 x g et RT pendant 5 min et éliminer le surnageant.
    Remarque : CSC-cellules en cellules cancéreuses mammaires sont définis comme CD44+/CD24– cellules26,27,28,29,30et la poitrine non-souches de cellules cancéreuses sont définis comme CD44–/CD24+ cellules18 (Figure 1).
  19. Plaque des triée non souches cellules cancéreuses du sein dans la boîte de Petri contenant le support de la nouvelle collection pour mise en culture à 37 ° C dans un incubateur de culture 5 % CO2 cellules.

2. détection et Induction de l’apoptose

  1. Préparer 1 mM la staurosporine12,34 dans le DMSO. Dans le groupe traité de MCF-7, ajouter 25 μL de la staurosporine 1 mM au milieu rempli des cellules MCF-7 de faire jusqu'à 10 mL de volume final (2,5 μM staurosporine) dans un tube conique de 15 mL. Pipette pour mélanger le contenu uniformément.
  2. Enlever le milieu de culture des cellules, laver les cellules avec 2 mL de PBS une fois. Puis ajouter les 10 mL de milieu avec 2,5 μM staurosporine à cellules MCF-7 pendant 6 h d’induire l’apoptose lorsque la densité cellulaire atteint 70 % confluence.
  3. Préparer 1 mM paclitaxel35,36 dans le DMSO. Dans le groupe traité de T47D, ajouter 12,5 μL de paclitaxel de 1 mM au milieu rempli de cellules T47D pour faire à un volume final de 10 mL (5 μM paclitaxel) dans un tube conique de 15 mL. Pipette pour mélanger le contenu uniformément.
  4. Enlever le milieu de culture des cellules et laver les cellules avec 2 mL de PBS une fois. Puis ajouter les 10 mL de milieu à 5 μM paclitaxel aux cellules T47D pour 10 h d’induire l’apoptose lorsque la densité cellulaire atteint 70 % confluence.
    Remarque : Le temps d’induction et la concentration des inducteurs qui induisent l’apoptose doivent être optimisés chaque fois qu’une nouvelle ligne de cellule est utilisée pour la première fois.
  5. Pour le groupe traité au solvant de MCF-7, ajouter 25 μL de stérile de diméthylsulfoxyde (DMSO) au milieu des cellules MCF-7 pour faire à un volume de 10 mL (c.-à-d., 0,25 % v/v DMSO) dûment rempli dans un tube conique de 15 mL. Pipette pour mélanger le contenu uniformément.
  6. Enlever le milieu de culture des cellules MCF-7 traitées solvants, laver une fois avec 2 mL de PBS. Puis ajouter les 10 mL de milieu avec 0,25 % v/v DMSO pendant 6 h sous le contrôle de solvant pour STS.
  7. Pour le groupe traité au solvant de T47D, ajouter 5 μl de DMSO stérile au milieu rempli de cellules T47D à compléter au volume final de 10 mL (soit 0,05 % v/v DMSO) dans un tube conique de 15 mL. Pipette pour mélanger le contenu uniformément.
  8. Enlever le milieu de culture des cellules T47D traitées solvants, laver une fois avec 2 mL de PBS. Puis, ajoutez les 10 mL de milieu avec 0,05 % v/v DMSO pendant 10 h que le solvant contrôle de paclitaxel.
  9. Pour observer les changements morphologiques des cellules traitées, détachant les cellules avec 50 nM Mitotracker rouge CMXRos et 250 ng/mL Hoechst 33342 et incuber pendant encore 20 min à 37 ° C sous une atmosphère d’air de 95 % 5 % CO2. Observer la morphologie des cellules apoptotic typique sous un 60 x confocal laser scanning microscope (Figure 2).
    Remarque : La morphologie typique de l’apoptose comprend le rétrécissement de la cellule, blebbing membrane, fragmentation des mitochondries et condensation nucléaire mais avec membrane cellulaire intacte12,13,14,15 ,18,37.

3. isolement des cellules apoptotiques et procédure d’inversion de l’apoptose

  1. Tacher apoptotic inducteur et solvant traités-MCF-7 ou cellules de T47D avec 3 colorant de Caspase-3/7 vert détection μM à la concentration cellulaire de 106/ml dans l’obscurité pendant 30 min à 37 ° C sous une atmosphère d’air de 95 % 5 % CO2.
  2. Filtrer les cellules à travers une maille en nylon de 40 µm avant d’exécuter dans la trieuse de pages pour le tri.
  3. Pour le blocage des fins, d’abord porte la population majeure (R1) et exclure les débris en traçant le graphique en points avec forward scatter et diffusion latérale (Figure 3).
  4. Utiliser les cellules non traitées sans ajouter le colorant de Caspase-3/7 vert détection comme témoin négatif pour la région négative (R2) de la porte (Figure 3 a).
  5. Utiliser des cellules traitées avec la staurosporine12,18,34 pendant 24 h et colorées avec le colorant comme témoin positif pour porte la région positive (R3) (Figure 3 b).
  6. Prélever des cellules positives (R3) appartenant aux groupes traités inducteur en tubes fond rond en polystyrène 12 x 75 mm contenant 1 mL de milieu de collection (le même que le milieu de la collection à l’étape 1.18) (Figures 3C-3D). Centrifuger les tubes à 300 x g et RT pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  7. Recueillir les cellules négatives (R2) de groupes traités solvant dans des tubes de polystyrène fond rond 12 × 75 mm avec 1 mL de milieu de collection comme à l’étape 3.6 (Figures 3E-3F).
    Remarque : Une petite partie des cellules (par exemple 10 000 cellules) soient collectée et ré-exécuter dans la trieuse de pages pour vérifier le motif du marqueur de caspases active. Si plus 90 % des cellules de traitées par solvant-triés sont indiqués dans la région de caspase-négatives ou plus 90 % des cellules d’imprégnées d’inducteur triés sont affichés dans la région de caspase-positive, ces cellules recueillies sont censées être relativement pure (Figures 3C-3F). Dans le cas contraire, la région de tri et/ou de la trieuse doit être réinitialisée.
  8. Remettre en suspension les cellules triées dans un milieu frais de collecte et les semences dans des plaques de culture de tissu de 12 puits et de la culture à 37 ° C sous une atmosphère d’air de 95 % 5 % CO2pendant 7 jours pour l’inversion de l’apoptose.

4. confirmation de l’apoptose des caspases activées cellules

  1. Mélanger 10 mM HEPES, 140 mM NaCl et 2,5 mM CaCl2 pour préparer la liaison annexine tamponné (pH 7,4). Stocker le tampon à 4 ° C et éviter le tampon de s’exposer à la lumière.
  2. Préparer une solution de travail 100 µg/mL d’iodure de propidium (PI) en diluant 5 µL de la 1 mg/mL solution PI dans 45 µL de tampon d’annexine-liaison. Conserver la solution à 4 ° C et éviter la solution pour exposer à la lumière.
    Remarque : PI est un potentiel mutagène et doit être manipulé avec soin.
  3. Préparer les cellules traitées inducteur tout comme aux étapes 2.1 à 2.5.
  4. Percevoir les MCF-7 imprégnées d’inducteur ou les cellules T47D en pipettant également le support au-dessus de la couche cellulaire 3-5 x pour détacher les cellules. Transférer les cellules dans un tube conique 15 mL.
  5. Centrifuger à 300 x g et RT pendant 5 min. jeter le surnageant.
  6. Remettre en suspension les cellules avec un milieu rempli à la concentration cellulaire de 106/ml dans un tube de microtubes de 1,5 mL et tacher les cellules avec un colorant de le vert détection Caspase 3/7 de 3 μM dans l’obscurité pendant 30 min à 37 ° C.
  7. Centrifuger à 300 x g et RT pour 5 min. jetez les surnageants.
  8. Laver les cellules avec 1 mL de glacee PBS et centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min. jetez les surnageants.
  9. Remettre en suspension les cellules de 100 μL de tampon d’annexine-liaison avec la μL d’ajouter 5 du conjugué annexin V et 1 µL de 100 µg/mL solution de travail pour chaque 100 μl de suspension cellulaire de PI et incuber les cellules à température ambiante pendant 15 minutes.
    Remarque : Annexin V et PI sont utilisées ensemble pour marquer les cellules apoptotiques écoulement cytometry38,39,40.
  10. Ajouter 400 µL de tampon d’annexine-liaison, mélanger doucement. Conserver les échantillons sur la glace avant d’exécuter sur un cytomètre en flux.

5. mesure de poitrine CSC-cellules par cytométrie en flux

  1. Récolter le MCF-7 inversé dans les deux groupes traités inducteur ou solvant avec 0.05 % trypsine-EDTA. Récolter les cellules de T47D dans les deux groupes traités inducteur ou solvant ou avec 0,25 % de trypsine-EDTA tout comme aux étapes 1,2 à 1,5.
  2. Colorer les cellules avec des anticorps monoclonaux conjugués fluorochrome contre CD44 humain (PerCP-Cy5.5) et CD24 (PE) comme au point 1.12. Pendant ce temps, préparer les contrôles isotype comme à l’étape 1.13.
  3. Exécuter les cellules sur un cytomètre en flux et détecter le pourcentage de cellules CD44+/CD24– marqueurs.

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Representative Results

Afin d’observer la transition du sein non souches cellules cancéreuses à des cellules mammaires semblables à CSC, un premier tri de CD44–/CD24+ cellules cancéreuses du sein ont été nécessaires. Pour la lignée de cellules MCF-7, qui a environ 0,15 % cellules avec des marqueurs de CSC dans la population d’origine (Figure 1), cette étape a contribué à exclure la possibilité d’enrichissement de la CSC au cours de l’inversion de l’apoptose. Au contraire, s’il n’y a pas de cellules avec des marqueurs de CSC dans la population d’origine, comme pour les cellules T47D (Figure 1), cette procédure de tri pourrait être omise. En effet, blocage affecté la définition du positif et négatif de chaque marqueur, qui influence finalement le pourcentage du SCC déterminé. Par conséquent, des contrôles appropriés, y compris les contrôles d’isotype d’anticorps d’intérêt, unique teintés commandes pour chaque marqueur devraient être soigneusement choisis et préparés pour l’ajustement de la porte (Figure 1).

Avec cellules souches non cancéreuses, le modèle d’inversion de l’apoptose par la suite a pu être établi. Les modifications morphologiques typiques a peuvent être observées après l’ajout d’inducteurs d’apoptose et cellules devraient récupérer l’apoptose avec une morphologie similaire après retrait de médicament (Figure 2). Caspase-3/7 reconnaît la séquence d’acides aminés hanane dans la teinture de la Caspase-3/7 vert détection et les formes actives de la caspase-3/7 sont capables de cliver ce site41. A l’origine, la fluorescence de la teinture de Caspase-3/7 vert détection dans le cytosol est faible, alors que si le colorant est clivé et transloqué dans le noyau, le signal de fluorescence devrait être amplifié après sa liaison à l’ADN dans le noyau. Cette différence évidente se distinguaient par cytométrie en flux. Par conséquent, ces cellules activées caspase pourraient être étiquetés et triés selon leur intensité de fluorescence supérieur comparant à ceux sans activation des caspases (Figures 3 a-3D). Pendant le processus de l’induction d’apoptose, un contrôle de solvant approprié doit être inclus : cellules traitées par solvant-sans activation de la caspase ont été recueillies (3F et Figures 3E) d’exclure la possibilité que la procédure de FACS ou le dissolvant lui-même ne la cause de la transition, le cas échéant.

Afin de montrer que ces cellules de caspase-activé de FACS-tri étaient en effet apoptotique, nous avons teinté conjointement ces cellules avec l’annexine V et PI. Un des changements dans les cellules en apoptose précoce est la translocation de la phosphatidylsérine de la partie interne de la membrane plasmique à la surface externe de la cellule13,38,39,40; Cette externalisation de la phosphatidylsérine pouvait être détectée par l’annexine V. Alors que ce changement n’est pas unique à l’apoptose, PI peut être utilisé pour distinguer l’apoptose de nécrose basée sur l’intégrité de la membrane cellulaire. Ainsi, les cellules avec la liaison de l’annexine V mais sans tacher les PI sont considérés comme les cellules apoptotiques. Les cellules dans les groupes de traitement inducteur apoptotic caspase-activé trouvées être annexine V positif et PI négatifs, ce qui laisse supposer qu’il s’agissait de cellules apoptotiques (Figure 4).

Après que le deuxième tri basé sur l’activation de la caspase dans les cellules apoptotiques, ces cellules apoptotiques ont été recueillies et par la suite mis en culture pour la récupération. Les cellules inversées qui étaient vivants ont pu accrocher le fond de conteneur de culture et continuer à proliférer. Après 7 jours, coloration de CD44 et CD24 fut jouée dans les cellules inversées tandis que les commandes ont été préparées en même temps comme avant. Comparativement aux groupes traités solvant (Figure 1), analyse en cytométrie en flux a montré qu’il y avait des événements (cellules) apparaissant dans le CD44+/CD24– quadrant dans la population de cellules mammaires inversé non souches du cancer (Figure 1) . Étant donné que nous avions déjà exclu des cellules CD44+/CD24– avant l’induction de l’apoptose et seulement CD44–/CD24+ cellules souches non cancéreuses du sein ont été choisis, ces CD44+/CD24– des cellules semblables à CSC ne pouvaient être transité de cellules-souches non cancéreuses du sein au cours de l’inversion de l’apoptose.

Figure 1
Figure 1 : Marqueur de poitrine représentant CSC coloration sur les cellules cancéreuses du sein en cytométrie en flux.
MCF-7, MDA-MB-231 et T47D ont été colorées avec des anticorps monoclonaux conjugués fluorochrome contre CD44 humain (PerCP-Cy5.5) et CD24 (PE). Les cellules ont été tout d’abord bloquées par forward scatter (FSC) et diffusion latérale (SSC) (P1) d’exclure les débris. Isotype contrôles CD24 et CD44 ont été utilisés comme témoins négatifs pour CD24 et CD44 respectivement. Les cellules MCF-7 colorées au CD24 était utilisé comme témoin positif pour CD24 et cellules MDA-MB-231, tachés de CD44 était utilisé comme témoin positif pour CD44. Non-tige MCF-7 cellules mammaires cancéreuses (P2) ont été triées. Ces cellules triées et T47D ont été soumis à la procédure d’inversion de l’apoptose. CSC-like (CD44+CD24–) cellules apparaissent après le renversement de l’apoptose. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les changements morphologiques des cellules cancéreuses du sein sous induction de stimuli apoptotiques.
Cellules cancéreuses du sein ont montré apoptotique typique des changements morphologiques dont rétrécissement de la cellule, blebbing membrane, fragmentation des mitochondries (flèches jaunes dans les figures monochromes) et condensation nucléaire. Noyaux (en bleu) : noyaux de cellules colorées avec Hoechst 33342 apparaissaient dans la couleur bleue. Mitochondries (en rose) : les mitochondries des cellules colorées avec Mitotracker rouge CMXRos apparaissaient dans la couleur rose. Fusion : figures fusionnent en doubles couleurs montrant les mitochondries et les noyaux. Mitochondries (en gris) : les mitochondries des cellules colorées avec Mitotracker rouge CMXRos apparaissaient en monochrome. Contraste d’interférence différentielle (DIC) : cellules entières. Tige : Cellules MCF-7 ont été traités avec la staurosporine (STS) pendant 6 h puis inversés pour 24 h. bas : T47D cellules ont été traitées avec le paclitaxel pour 10 h avec inversion pour les barres d’échelle de 24 h. = 20 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : analyse par activation Caspase par trieur. (A) non colorés MCF-7 cellules sans traitement la staurosporine (STS) ont été utilisés comme contrôle négatif (R2). (B) des cellules MCF-7 traitement avec la staurosporine (STS) pour 24 h. cellules région R3 étaient considérés comme les cellules de caspase-activé. (C) cellules MCF-7 traitement avec la staurosporine (STS) pour 6 h. cellules région R3 étaient FACS-tri. (D), FACS-tri-activated caspase MCF-7 cellules après le traitement de la staurosporine (STS) pendant 6 h ont été ré-exécuter. (E) imprégnées de DMSO MCF-7 cellules. (F)-FACS trier des cellules sans activation de la caspase après traitement de DMSO pendant 6 h ont été ré-exécution. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : annexine V et PI coloration des caspases activées en cytométrie. Des cellules MCF-7 et T47D ont été d’abord bloquées par forward scatter (FSC) et diffusion latérale (SSC) (P1) d’exclure les débris. Les cellules qui ont été traités avec inducteurs d’apoptose et sans aucune coloration ont été utilisés comme témoins négatifs. Pour les cellules traitées avec des inducteurs d’apoptose, cellules de caspase-activé [c'est-à-dire des cellules positives vert de Caspase-3/7] ont été sélectionnés (P3) pour montrer l’intensité de la fluorescence d’annexine V et de coloration de la PI. Toutes les cellules positives de Caspase-3/7 vert étaient positifs de l’annexine V et PI négatif, ce qui laisse supposer qu’il s’agissait d’apoptose. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit une manière directe et claire pour la détection de la transition des cellules mammaires cancéreuses non souches en cellules semblables à des CSC du sein en raison de l’inversion de l’apoptose. Confirmation des propriétés de ces cellules inversés CSC pourrait assistée à l’aide j’ain vitro mammosphere formation test et in vivo xénogreffe transplantation dans des souris immunodéficientes18,24,26 ,27,42,43,44,45. Ici, nous utilisons deux lignées de cellules cancéreuses du sein, mais ce protocole peut être davantage appliqué dans d’autres lignées de cellules cancéreuses du sein. Étant donné que ce phénomène est apparent dans la lignée de cellules cancéreuses du sein quel nombre moins de CD44+/CD24– cellules existent à l’origine, on suggère ne pas de choisir des lignées cellulaires comme MDA-MB-231 dans lequel il y a plus de 90 % du CD44+ cellules.

Gating étant important dans l’analyse des flux, des contrôles appropriés et suffisants doivent être préparés à l’avance. Pour le tri, la pureté doit aussi être tranchée avant la collecte actuelle des cellules. Par exemple, pour connaître la pureté du premier tri, une petite partie des cellules (par exemple 10 000 cellules) soient collectée et ré-exécuter dans la trieuse de pages pour vérifier la configuration des marqueurs de la CSC. Si plus de 90 % de ces tri des cellules sont CD44–/CD24+ et ne sont pas affichés dans le CD44+/CD24– région, les cellules recueillies sont censées être relativement pure (Figure 1). Si les cellules apparaissent dans le CD44+/CD24– région, la région de tri et/ou la trieuse doit être réinitialisée. Tri se fasse aussi stériles que possible en utilisant un trieur à l’intérieur de la hotte de la culture ou ajouter des antibiotiques dans la collecte et le milieu de culture pour les cellules triées.

Types de cellules de cancer autre que le cancer du sein peuvent également être choisis et induite par différents stimuli apoptotiques d’établir le modèle de renversement de l’apoptose. Alors que l’activation de la caspase pourrait être détectée dès 2 h, le temps de tri doit être soigneusement sélectionné. Étant donné que les cellules dans la population ne sont pas synchronisés, à un moment précis point, chaque cellule peut avoir atteint différents stades de l’apoptose. Pendant ce temps, les cellules continuez vers une mort par apoptose après l’activation de la caspase. Donc, si les inducteurs sont supprimées uniquement lorsque toutes les cellules atteignent activation de la caspase, certaines cellules peuvent ont déjà atteint le stade de la fragmentation de l’ADN, ce qui les rend incapables de récupérer même après le retrait de l’inducteur. Il n’est pas suggéré d’induire l’apoptose depuis trop longtemps obtenir un pourcentage plus élevé de cellules activées caspase mais avec le coût de laisser un grand nombre de cellules meurent après le prélèvement. En outre, le temps d’incubation et la concentration de colorant que les labels caspase-activée de cellules doivent être optimisés chaque fois qu’une nouvelle ligne de cellule est utilisée pour la première fois.

Une autre préoccupation depuis avec succès induisant de renversement de l’apoptose dans les cellules apoptotic est le taux de récupération faible des cellules (généralement moins de 10 %). Les cellules sont passés par apoptose ajoute la procédure de tri ; par conséquent, ils nécessitent un traitement très doux pendant la centrifugation et le transfert dans les étapes de la collecte et la remise en suspension. En outre, le choix de l’assiette ou un plat utilisé pour la culture subséquente ne devrait pas être dépendant du nombre de cellules recueillies, mais sur le nombre de recouvrements. Dans le cas contraire, les cellules pourraient être allouées trop faiblement pour inverser et re-pousser. Étant donné que le cancer non souches cellules croissent à une vitesse supérieure et peuvent dominer dans la population de cellule reconstitué46, le temps de détection ne doit pas être trop loin dès le premier jour de récupération.

Cet méthode premier isolats sein non souches cellule cancéreuse puis s’applique à eux pour l’induction apoptotique où un deuxième tri est fait basée sur l’activation de la caspase avant cellules obtenir récupérés. La réapparition de cellules semblables à des CSC du sein dans la population inversée est détectée par cytométrie en flux. Étant donné que cette procédure d’inversion de l’apoptose in vitro d’isolats de cellules cancéreuses apoptotic pure, on peut effectuer un certain nombre d’expériences maintenant pour comprendre les conséquences de ces cellules réelle inversées. En dehors des cellules cancéreuses du sein, d’autres types de tumeurs solides ainsi que malignité hématologique qui sont avec des marqueurs SCC connus peut être étudiée et divers stimuli apoptotiques peut être utilisé. Par conséquent, cette méthode est extensible et applicable à une portée de pensionnaire de l’enquête du cancer.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le fonds innovante technologie d’Innovation Technology Commission : aide financière de l’état clé de laboratoire d’agrobiotechnologie (CUHK), le fonds de recherche biomédicale Lo Kwee-Seong et la fondation de Hysan Lee. Y.X. était soutenue par la bourse postdoctorale de la CUHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40 μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus -
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

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References

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