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Cancer Research

Detección del flujo Cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la Apoptosis

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar células de cáncer de mama apoptóticas clasificación celular activado por fluorescencia y más detectar la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama cáncer células madre células después de la revocación de la apoptosis por citometría de flujo.

Abstract

La recurrencia del cáncer durante mucho tiempo ha sido estudiada por oncólogos mientras que los mecanismos subyacentes siguen siendo confusos. Recientemente, nosotros y otros encontraron que un fenómeno llamado inversión de apoptosis conduce a mayor colonización en varios modelos de celular bajo diferentes estímulos. Estudios previos se han centrado en el seguimiento de este proceso in vitro e in vivo; sin embargo, el aislamiento de células real invertidas tiene todavía ser alcanzado, que limita nuestro entendimiento sobre las consecuencias de la revocación de la apoptosis. Aquí, aprovechamos un tinte verde detección de caspasa-3/7 a las células de etiqueta con caspasas activadas después de la inducción de apoptosis. Células con señales positivas se clasifican más lejos hacia fuera por celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación para la recuperación. Examen bajo microscopia confocal ayuda a confirmar el estado de apoptosis antes de FACS. Un aumento en la colonización se puede atribuir a menudo a la elevación en el porcentaje de células madre de cáncer (CSC)-como las células. Además, dada la heterogeneidad del cáncer de mama, identificando el origen de estas células de CSC-como sería fundamental para el tratamiento del cáncer. Así, preparamos las células de cáncer no madre mama antes de accionar apoptosis, aislar células caspasa activa y realizar el procedimiento de revocación de la apoptosis. Análisis de citometría de flujo revela que mama CSC-como las células vuelve a aparecerán en el grupo inverso, indicando mama CSC-como las células se transitó de las células de cáncer no madre mama durante apoptosis revocación. En Resumen, este protocolo incluye el aislamiento de apoptotic células de cáncer de mama y la detección de cambios en porcentaje de CSC en células invertidas por citometría de flujo.

Introduction

Cáncer ha sido la principal causa de muerte, haciendo que la pesada carga a los países a nivel mundial1. El cáncer de mama es alta tanto en términos de incidencia y mortalidad en pacientes femeninos entre todos los tipos de cáncer1. Debido a la heterogeneidad del cáncer, una combinación de fármacos se utiliza generalmente en la quimioterapia para lograr cáncer célula muerte2,3,4. Sin embargo, puesto que los medicamentos quimioterapéuticos comunes a menudo destino ADN5,6, proteína síntesis7,8 o microtúbulos dinámica9, las células de rápido crecimiento son afectados la mayoría mientras que células quiescentes como cáncer células madre (CSC) s son generalmente menos afectados10. CSCs son, por lo tanto, más posibilidades de sobrevivir después del tratamiento, que más adelante conduce a resistencia a los medicamentos y el cáncer recidiva10,11. Por lo tanto, eliminación del CSC se ha convertido en un tema importante para el tratamiento del cáncer y estudio del origen de las CMC es necesario.

Se han realizado más estudios sobre el fenómeno de la reversión de la apoptosis en la última década12,13,14,15,16,17,18 , 19. antes de la aparición de este concepto, ha sido ampliamente aceptado que las células irreversiblemente sufrirá apoptosis después de la activación de caspasas. Caspasas son una familia de enzimas de proteína que desempeñan papeles claves en las etapas de iniciación y ejecución de la apoptosis, incluyendo la formación de la apoptosis complejas y la división de downstream sustratos20. Activación de las caspasas verdugo como caspasa 7 caspasa 3 ha sido considerada como el "punto de no retorno" para apoptosis21. Sin embargo, los investigadores observaron recientemente que apoptosis revocación ocurre in vitro y en vivo, en que las células pueden recuperar de apoptosis incluso después de la activación de caspasa12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. por otra parte, de características agresivas tales como mayor resistencia a la original inductor de apoptosis y mayor invasividad se detectan en el cáncer invertido células15. Por lo tanto, se propuso que el porcentaje de CSC-como las células sería mayor en la población invertida en comparación con las células sin tratar, eventualmente contribuir a las características más malas después de apoptosis revocación18.

Anteriormente, muchos esfuerzos se hicieron un seguimiento de la inversión de apoptosis in vitro y lo más importante, en vivo, que de gran ayuda para confirmar la universalidad de este proceso16,17,19. Sin embargo, carece de un estudio sistémico sobre las consecuencias de las células invertidas debido al aislamiento insuficiente de las células que han sufrido realmente apoptosis revocación. Hay que adquirir las células apoptotic puro y recuperarlos para un estudio más profundo. Por lo tanto, utilizamos el marcador bien aceptado tradicionalmente de la activación de caspasas verdugo como el marcador del "punto de no retorno"21 para apoptosis y utilizar celular activado por fluorescencia (FACS) para discriminar caspase-activado Células teñidas de clasificación con colorante verde detección de caspasa-3/7. El tinte es covalente a una secuencia corta de aminoácidos, DEVD, que puede ser reconocido y hendida por activa caspasas 3/7. El escote ayuda a liberar el tinte, que se translocan desde el citosol al núcleo donde se une al ADN y emite fluorescencia fuerte. Este procedimiento evita el uso de una población de células a granel en la que algunas células pueden no han experimentado apoptosis.

CSC o células iniciadoras del tumor se han identificado en muchos tumores sólidos con una sola o una combinación de varios marcador superficial y muy pocos números de estas células son suficientes para los tumores en ratones inmunodeficientes,22,23, forma 24,25,26,27. Una combinación de CD44 y CD24 se ha utilizado comúnmente en estudios de mama CSC y CD44+/CD24– las células han sido definidas como la mama CSC26,27,28,29 , 30. recientemente, hemos realizado una serie de experimentos para confirmar la relación propuesta entre la revocación de la apoptosis y las CMC y demostrar que las células de cáncer de mama invertida ganaron mayor capacidad de formación de tumor in vitro e in vivo con un elevado porcentaje de células con marcadores de CSC18. Aunque no podríamos excluir la posibilidad de que mama CSCs sobreviven mejores y así conseguirán enriquecidos después de la revocación de la apoptosis, cuando aislamos las células cancerosas no madre y sujeto a revocación del apoptosis, CSC surgirá en el originalmente no-vástago de población de células de cáncer, lo que sugiere que no tallo cáncer de las células pueden contribuir al aumento en el porcentaje de CSC durante apoptosis revocación.

Este artículo pretende demostrar la transición de las células de cáncer no madre mama a Mama CSC-como las células después de la revocación de la apoptosis y detectar esta transición mediante citometría de flujo. Las células de vástago no cáncer de mama se preparan inicialmente aislando CD44–/CD24+ de mama las células cancerosas por FACS. Entonces, apoptosis es inducida y confirmado por cambios morfológicos bajo el microscopio. Luego, las células apoptotic positivamente marcado por el tinte verde detección de caspasas 3/7 son aisladas por FACS y más cultivadas en ausencia de inductores de apoptosis apoptosis inversión. Las células invertidas luego se tiñen con marcadores de CSC después de 7 días de recuperación para el análisis cytometric del flujo. Células con CD44+/CD24– marcadores vuelve a aparecerán en la población invertida, sugiriendo que la transición de las células cancerosas no madre a CSC-como las células ha sufrido durante apoptosis revocación.

Revocación de apoptosis se ha observado en el cáncer de varias líneas celulares como las células normales de primaria tratados con estímulos apoptóticos diferentes en vitro12,13. Este proceso también ha sido trazado en Drosophila en vivo16,17,19del modelo. Toda la información sobre el mecanismo subyacente de la recaída del cáncer en modelos de enfermedad de cáncer diferentes y el origen de las CMC puede obtenerse mediante el uso de la técnica como se describe en este manuscrito.

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Protocol

1. preparación de mama las células cancerosas no madre

  1. Cultura MCF-7 y MDA-MB-231 células en 10 mL de rojo de fenol libre Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) en un plato de 100 mm. Cultura T47D en 10 mL de rojo de fenol libre RPMI 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, 10% inactivado con calor FBS y 1% v/v penicilina-estreptomicina (PS) en un plato de 100 mm. Células en cultivo a 37 ° C en un incubador 95% aire célula cultura de 5% CO2.
    Nota: Rojo de fenol afecta la detección basada en fluorescencia pero también tiene una influencia potencial sobre el crecimiento de las células de cáncer de mama debido a sus efectos similares al estrógeno31. Por ejemplo, rojo de fenol puede estimular el receptor de la progesterona y el crecimiento de las células de MCF-731. También podría estimular el crecimiento de las células de T47D31.
  2. Células de lavado con 2 mL de fosfato tampón salino (PBS) dos veces. Añadir 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA MCF-7 y MDA-MB-231 o 2 mL de 0.25% tripsina-EDTA a las células T47D.
    Nota: La concentración de tripsina-EDTA necesaria para la separación de las células entre tipos de células de cáncer de mama diferentes varían mientras que una concentración inadecuada puede afectar el patrón de expresión de algunos marcadores de superficie celular como CD44 y CD2432.
  3. La cultura los platos por 5 min a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire. Comprobar con frecuencia el desprendimiento de las células bajo el microscopio para evitar que las células del exceso de digestión con tripsina-EDTA.
  4. Cuando más del 90% células separarla, añadir 5 mL de Medio RPMI completo en el plato y pipeta sobre la superficie de la capa de celular varias veces.
  5. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
    Nota: Generalmente, alrededor de 6 x 106 células pueden obtenerse de un plato de 100 mm, cuando la confluencia alcanza el 70%.
  6. Deseche el sobrenadante y resuspender las pelotillas en 106 células/100 μL de tampón FACS (PBS con 0,5% BSA y 0.1% de azida sódica) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  7. Las células se dividen en varios tubos. Para las células MCF-7, se dividen las células en 4 tubos: isotipo dos controles, uno para CD24 solo manchas como control positivo CD24 y uno para la doble tinción.
  8. Para las células T47D, dividir las células en 3 tubos: dos controles de isotipo y uno para la doble tinción.
  9. Para las células MDA-MB-231, dividir las células en 4 tubos: isotipo dos controles, uno para CD44 solo manchas como control positivo de CD44 y uno para la doble tinción.
  10. Centrifugar los tubos a 300 x g y 4 ° C por 5 min deseche el sobrenadante y luego añadir bloque Fc diluido 1:50 en tampón FACS.
  11. Incubar las muestras en hielo por 20 min en la oscuridad antes de la centrifugación a 300 x g y 4 ° C por 5 min descarte el sobrenadante.
  12. Añadir conjugado con fluorocromo anticuerpos monoclonal contra CD44 humano (PerCP-Cy5.5) y CD24 (PE) en diluciones de 1:40 y 1:10 (en tampón FACS) en la doble tinción grupos. Para los controles positivos, añadir CD44 (PerCP-Cy5.5) a MDA-MB-231 y CD24 (PE) las células MCF-7 en la misma concentración, respectivamente.
    Nota: La combinación de CD44 y C24 se ha utilizado comúnmente en el pecho CSC estudio26,27,28,29,30.
  13. Para los grupos de control de isotipo, añadir PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ en un 1:40 dilución como control de isotipo de anticuerpos de CD44 y PE IgG2a de ratón, κ en un 1:10 dilución como control de isotipo de anticuerpos CD24 en 106 células/100 μL.
    Nota: Isotipo de anticuerpos de interés se recomienda utilizar como controles negativos33.
  14. Incubar las muestras (de pasos 1.12 y 1.13) a 4 ° C en la oscuridad durante 30 minutos centrifugar a 300 x g y 4 ° C por 5 min descarte el sobrenadante.
  15. Lavar el pellet dos veces con 500 μL de PBS y centrifugar a 300 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
  16. Resuspender el precipitado en 0,5 mL de PBS y el filtro a través de una malla de nylon de 40 μm antes de ejecutar en un clasificador de células activado por fluorescencia.
  17. Fines de control y compensación, mancha las células MCF-7 con los anticuerpos anti-CD24 conjugado con PE y mancha las células MDA-MB-231 con anticuerpos anti-CD44 conjugado con PerCP-Cy5.5 como controles positivos. Uso de células teñidas con isotipo controles como controles negativos (figura 1).
  18. Recoger las células con CD44–/CD24+ marcadores en tubos fondo redondo poliestireno 12 x 75 mm con 1 mL de medio de colección (sin rojo de fenol RPMI 1640 suplementado con 20% inactivado con calor FBS y 2% v/v PS). Centrifugar los tubos a 300 x g y RT por 5 min y descarte el sobrenadante.
    Nota: CSC-como las células en células de cáncer de mama se definición como CD44+/CD24– células26,27,28,29,30y no tallo las células de cáncer de mama se definen como CD44–/CD24+ células18 (figura 1).
  19. Las células de vástago no cáncer de mama ordenados en la placa de cultivo que contiene medio de colección fresca para seguir cultivándolos a 37 ° C en incubadora cultura 5% CO2 célula de la placa.

2. apoptosis inducción y detección

  1. Preparar 1 mM estaurosporina12,34 en DMSO. Para el grupo tratado de MCF-7, añadir 25 μL de estaurosporina de 1 mM al medio terminado de células MCF-7 hacer hasta 10 mL de volumen final (2,5 μM staurosporina) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.
  2. Retire el medio de cultivo de las células, las células con 2 mL de PBS la colada una vez. Luego añadir 10 mL de medio con 2,5 μM estaurosporina células MCF-7 de 6 h inducir apoptosis, cuando la densidad celular llega a confluencia de 70%.
  3. Preparar 1 mM paclitaxel35,36 en DMSO. Para el grupo tratado de T47D, añadir 12,5 μL de paclitaxel de 1 mM al medio terminado de T47D células que conforman a un volumen final de 10 mL (5 μM paclitaxel) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.
  4. Retire el medio de cultivo de las células y lavar una vez las células con 2 mL de PBS. Luego añadir 10 mL de medio con 5 μM paclitaxel a las células de T47D para 10 h inducir apoptosis, cuando la densidad celular llega a confluencia de 70%.
    Nota: El tiempo de inducción y la concentración de los inductores que inducen la apoptosis deben optimizarse cada vez que una nueva línea celular se utiliza por primera vez.
  5. Para el grupo de MCF-7 Tratado de solvente, añadir 25 μL de dimetilsulfóxido estéril (DMSO) al medio completo de las células MCF-7 para hacer hasta un volumen final de 10 mL (es decir, 0.25% v/v DMSO) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.
  6. Retire el medio de cultivo de las células de MCF-7 tratadas solvente, lavar una vez con 2 mL de PBS. Luego añadir 10 mL de medio con 0.25% v/v DMSO durante 6 h como el control de solvente para STS.
  7. Para el grupo de T47D tratados con solvente, añadir 5 μL de DMSO estéril al medio terminado de T47D células que conforman a volumen final de 10 mL (es decir, 0.05% v/v DMSO) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.
  8. Retire el medio de cultivo de las células tratadas solvente de T47D, lavar una vez con 2 mL de PBS. Luego, añada los 10 mL de medio con 0.05% v/v DMSO para 10 h como el control de solvente para paclitaxel.
  9. Observar los cambios morfológicos de las células tratadas, teñir células con 50 nM Mitotracker Red CMXRos y 250 ng/mL Hoechst 33342 e incubar durante otros 20 minutos a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire. Observar la morfología de la célula apoptótica típicas bajo un 60 x láser confocal de barrido microscopio (figura 2).
    Nota: Morfología de la apoptosis típico incluye blebbing de membrana, contracción celular y condensación nuclear, fragmentación de las mitocondrias con la membrana celular intacta12,13,14,15 ,18,37.

3. aislamiento de células apoptóticas y procedimiento de revocación de Apoptosis

  1. Mancha tanto la apoptosis inductor solventes tratados y MCF-7 o T47D celdas con tinte verde detección de caspasa-3/7 de 3 μM en la concentración celular de 106/ml en la oscuridad durante 30 min a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire.
  2. Filtro de las células a través de una malla de nylon de 40 μm antes de ejecutar en el clasificador para ordenar.
  3. Para fines de sincronización, primero la población principal (R1) de la puerta y excluir los desechos trazando el gráfico de puntos con dispersión hacia delante y dispersión lateral (figura 3).
  4. Utilice las células no tratadas sin añadir el colorante verde de caspasa-3/7 detección como un control negativo para la región negativa (R2) de la puerta (Figura 3A).
  5. Utilice las células tratadas con staurosporina12,18,34 por 24 h y teñidas con el tinte como control positivo para la región positiva (R3) la puerta (figura 3B).
  6. Recoger las células positivas (R3) de los grupos tratados con inductor de tubos fondo redondo poliestireno 12 x 75 mm con 1 mL de medio de colección (igual que el medio de colección en paso 1.18) (figuras 3C-3D). Centrifugar los tubos a 300 x g y RT por 5 min y descarte el sobrenadante.
  7. Recoger las células negativas (R2) de los grupos tratados con solvente en tubos de poliestireno fondo redondo 12 × 75 mm con 1 mL de medio de colección como en el paso 3.6 (figuras 3E-3F).
    Nota: Una pequeña porción de células (como las 10.000 células) puede ser recopilada y vuelva a ejecutar en el clasificador para verificar el patrón del marcador activa caspasas. Si sobre el 90% de células tratadas con solvente ordenadas se muestran en la región de caspasa-negativo o más 90% de células tratadas con inductor seleccionadas se muestran en la región de caspasa-positivo, estas células colectadas se creen para ser relativamente puro (figuras 3C-3F). De lo contrario, debe restablecerse la región clasificación o clasificador.
  8. Resuspender las células ordenadas en medio de la colección fresca y semilla les en placas de cultivo de tejidos de 12 pozos y cultivo a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire durante 7 días para la reversión de la apoptosis.

4. confirmación de la Apoptosis en caspasa activa las células

  1. Mezcla 10 mM HEPES, 140 mM NaCl y CaCl2 de 2,5 mM para preparar el enlace de anexina tampón (pH 7.4). Almacenar el buffer a 4 ° C y evitar el buffer para exponer a la luz.
  2. Prepare una solución de trabajo de 100 μg/mL de yoduro de propidio (PI) por dilución 5 μl de 1 mg/mL solución en 45 μl de tampón de annexin-enlace PI. La solución a 4 ° C y evitar que la solución para exponer a la luz.
    Nota: PI es un mutágeno potencial y debe ser manejado con cuidado.
  3. Preparar las células tratadas con inductor como en los pasos 2.1 y 2.5.
  4. Recoger el tratamiento inductor de la MCF-7 o T47D células mediante pipeteo el medio sobre la capa de células de 3-5 veces para separar las células. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL.
  5. Centrifugar a 300 x g y RT por 5 min, descartar el sobrenadante.
  6. Resuspender las células con medio completo en la concentración celular de 106/ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y mancha las células 3 μM caspasas 3/7 detección de verde medio de contraste en la oscuridad durante 30 min a 37 ° C.
  7. Centrifugar a 300 x g y RT para 5 min descartar los sobrenadantes.
  8. Lavar las células con 1 mL de PBS y centrifugar a 300 x g de helado y 4 ° C por 5 min descartar los sobrenadantes.
  9. Resuspender las células en 100 μL de tampón de Unión anexina con el añadir 5 μL del conjugado anexina V y 1 μl de 100 μg/mL PI trabajo solución cada 100 μL de suspensión celular e incubar las células durante 15 min a temperatura ambiente.
    Nota: Anexina V y PI se utilizan juntos para etiquetar las células apoptotic en el flujo cytometry38,39,40.
  10. Añadir 400 μL de tampón de Unión anexina, mezcla suavemente. Mantener las muestras en hielo antes de ejecutar en un citómetro de flujo.

5. medición de mama CSC-como las células mediante citometría de flujo

  1. Cosecha el MCF-7 invertida en ambos grupos tratados con inductor o solvente con 0.05% tripsina-EDTA. Cosecha de células T47D en ambos grupos tratados con inductor o solvente o con 0.25% tripsina-EDTA como en los pasos 1.2 a 1.5.
  2. Teñir las células con los anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD44 humano (PerCP-Cy5.5) y CD24 (PE) como en el paso 1.12. Mientras tanto, preparar los controles de isotipo en los pasos 1.13.
  3. Las células en un citómetro de flujo y detectar el porcentaje de células con CD44+/CD24– marcadores.

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Representative Results

Para observar la transición del pecho no tallo las células cancerosas de mama CSC-como las células, una primera clasificación de CD44–/CD24+ se necesitan las células de cáncer de mama. Para la línea de células MCF-7, que alrededor del 0.15% células con marcadores de CSC en la población original (figura 1), este paso contribuyó a excluir la posibilidad de enriquecimiento del CSC durante apoptosis revocación. Por el contrario, si hay no hay células con marcadores de CSC en la población original, como para las células T47D (figura 1), este procedimiento de clasificación podría omitirse. De hecho, gating afectó la definición de lo positivo y negativo de cada marcador, que eventualmente podrían influir en el porcentaje de CSC determinado. Por lo tanto, controles apropiados incluidos los controles de isotipo de anticuerpos de interés, solo manchados controles para cada marcador deben ser cuidadosamente elegidos y preparados para el ajuste de la puerta (figura 1).

Con células de vástago no cáncer de mama, después de eso se pudo establecer el modelo de reversión de la apoptosis. Se pudieran observar cambios morfológicos típicos después de la adición de inductores de la apoptosis y las células deben recuperarse de apoptosis con morfología similar después de retiro de la droga (figura 2). Caspasa-3/7 reconoce la secuencia del aminoácido DEVD en el tinte verde de caspasa-3/7 detección y las formas activas de caspasa-3/7 son capaces de unirse a este sitio41. Originalmente, la fluorescencia del tinte verde detección de caspasa-3/7 en cytosol es débil, mientras que si el tinte es hendido y translocado al núcleo, se amplifica la señal de fluorescencia después de su unión a ADN en el núcleo. Esta diferencia podría distinguirse mediante citometría de flujo. Por lo tanto, esas células activada por caspasa podrían etiquetar y resuelto en base a su intensidad de fluorescencia mayor comparando a aquellos sin la activación de caspasas (figuras 3A-3D). Durante el proceso de inducción de apoptosis, debe incluirse un control apropiado de disolvente: se recolectaron células tratadas con solvente sin la activación de caspasas (3F y figuras 3E) para excluir la posibilidad de que el procedimiento de FACS o el solvente sí mismo era la causa para la transición, si cualquier.

Para demostrar que los FACS y ordenada caspase-activado las células eran en efecto apoptotic, nos Co teñido estas células con anexina V y PI. Uno de los cambios de etapa temprana en células apoptóticas es la translocación de fosfatidilserina de la cara interna de la membrana del plasma a la superficie externa de la célula13,38,39,40; Esta externalización de fosfatidilserina podría ser detectado por anexina V. Aunque este cambio no es exclusivo de apoptosis, PI puede utilizarse para distinguir apoptosis de necrosis basada en la integridad de la membrana celular. Así, las células con el atascamiento de la anexina V pero sin la coloración de la PI se consideran células apoptóticas. Células caspasa activa en los grupos de tratamiento inductor de la apoptosis se encontraron anexina V positivo y PI negativas, sugiriendo que eran células apoptóticas (figura 4).

Después de la segunda clasificación se basa en la activación de caspasas en células apoptóticas, estas células apoptotic fueron recogidas y posteriormente cultivadas para la recuperación. Las células invertidas que estaban vivas fueron capaces de fijar la base del contenedor de la cultura y siguen proliferando. Después de 7 días, de CD44 y CD24 se efectuó tinción en las células invertidas mientras que los controles fueron preparados al mismo tiempo como antes. En comparación con los grupos tratados con disolvente (figura 1), análisis cytometric del flujo demostró que hubo eventos (células) que aparecen en el CD44+/CD24– de cuadrante en la población de la célula de vástago no cáncer mama invertida (figura 1) . Puesto que ya habíamos excluido células con CD44+/CD24– antes de la inducción de apoptosis y sólo CD44–/CD24+ las células de cáncer no madre mama fueron elegidas, estas CD44+/CD24– CSC-como las células sólo pueden ser transitó desde las células de cáncer no madre mama durante apoptosis revocación.

Figure 1
Figura 1: Marcador de mama representante CSC tinción en las células de cáncer de mama en citometría de flujo.
MCF-7 y MDA-MB-231 y T47D fueron manchados con los anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD44 humano (PerCP-Cy5.5) y CD24 (PE). Las células primero fueron cerradas por forward scatter (FSC) y lado scatter (SSC) (P1) para excluir los residuos. Controles de isotipo de CD24 y CD44 se utilizaron como controles negativos para CD24 y CD44 respectivamente. Las células MCF-7 con CD24 fue utilizado como control positivo para CD24 y MDA-MB-231 células teñidas con CD44 se utilizó como control positivo para CD44. Células de cáncer de mama no madre MCF-7 (P2) fueron ordenadas. Estas células ordenadas y T47D fueron sometidos al procedimiento de revocación de apoptosis. CSC-como (CD44+CD24–) células aparecieron después de la revocación de la apoptosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cambios morfológicos de las células de cáncer de mama bajo inducción de estímulos apoptóticos.
Las células de cáncer de mama mostraron apoptotic típico cambios morfológicos, incluyendo la contracción celular, blebbing de membrana, fragmentación de las mitocondrias (flechas amarillas en las figuras monocromas) y condensación nuclear. Núcleos (en azul): núcleos de células teñidos con Hoechst 33342 fueron demostrados en color azul. Las mitocondrias (en rosa): las mitocondrias de las células teñidas con Mitotracker Red CMXRos fueron demostradas en color rosa. Combinado: figuras combinan en dos colores que muestran núcleos y mitocondrias. Las mitocondrias (en gris): las mitocondrias de las células teñidas con Mitotracker Red CMXRos fueron demostradas en monocromo. Contraste de interferencia diferencial (DIC): células enteras. Parte superior: Las células MCF-7 fueron tratadas con staurosporina (STS) para 6 h luego invierten para 24 h. bajo: T47D células fueron tratadas con paclitaxel para 10 h con la revocación para las barras de escala de 24 h. = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de activación de caspasas por clasificador. (A) sin mancha MCF-7 células sin tratamiento de estaurosporina (STS) fueron utilizados como control negativo (R2). (B) las células MCF-7 trataron con staurosporina (STS) para 24 h. las células en la región R3 fueron miradas como las células de caspase-activado. (C) las células MCF-7 trataron con staurosporina (STS) para células de 6 h. en región R3 fueron ordenados de FACS. (D) clasificado de FACS caspase-activado MCF-7 células después del tratamiento de estaurosporina (STS) para 6 h se vuelva a ejecutar. (E) tratados con DMSO MCF-7 células. (F) FACS ordenados células sin activación de la caspasa después del tratamiento de DMSO para 6 h era volver a correr. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: anexina V y PI coloración de caspase-activado células en citometría de flujo. Las células MCF-7 y T47D fueron en primer lugar cerradas por forward scatter (FSC) y lado scatter (SSC) (P1) para excluir los residuos. Las células que estaban sin tratamiento con inductores de la apoptosis y sin una tinción se utilizaron como controles negativos. Para las células tratadas con inductores de apoptosis, caspasa activa células [es decir, verde de caspasa-3/7 positivo] fueron seleccionadas (P3) para mostrar la intensidad de fluorescencia de anexina V y la coloración de la PI. Todas las células positivas de caspasa-3/7 de verde eran positivo de anexina V y PI negativo, sugiriendo que eran apoptóticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe una manera directa y clara para la detección de la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama CSC-como las células como resultado de la revocación de la apoptosis. Confirmación de las propiedades de la CSC de estas células invertidas podría ser asistido usando n vitro mammosphere formación ensayo y en vivo xenograft trasplante en ratones inmunodeficientes18,24,26 ,27,42,43,44,45. Aquí, utilizamos dos líneas de células de cáncer de mama, pero este protocolo puede ser aún más aplicado en otras líneas celulares de cáncer de mama. Puesto que este fenómeno es evidente en la línea de celular del cáncer de mama en que menor número de CD44+/CD24– las células existen originalmente, se sugiere no para elegir líneas celulares como MDA-MB-231, en el que hay más del 90% de CD44+ células.

Puesto que la sincronización es importante en el análisis de flujo, controles adecuados y suficientes deben estar preparados de antemano. Para la clasificación, la pureza se debe determinar antes de la colección real de las células. Por ejemplo, para saber la pureza de la primera clasificación, se puede recogió una pequeña porción de células (como las 10.000 células) y vuelva a ejecutar en el clasificador para verificar el patrón de marcadores de CSC. Si sobre clasificado el 90% de estas células son CD44–/CD24+ y no se muestran en el CD44+/CD24– región, las células recolectadas se creen para ser relativamente pura (figura 1). Si las células aparecen en la CD44+/CD24– región, la región de clasificación o el clasificador debe restablecerse. Clasificación debe llevarse a cabo tan estéril como sea posible usando un clasificador dentro de cultura campana o adición de antibióticos en la recolección y el medio de cultivo para células ordenadas.

Tipos de células de cáncer que no sea el cáncer de mama también pueden elegidos e inducidos con diferentes estímulos apoptóticos para establecer el modelo de reversión de la apoptosis. Mientras que la activación de caspasas se pudo detectar tan temprano como 2 h, debe seleccionarse cuidadosamente el tiempo de clasificación. Puesto que las células de la población no están sincronizadas, en un momento específico, cada célula puede haber alcanzado diferentes etapas de la apoptosis. Mientras tanto, las células siga sucediendo a una muerte por apoptosis después de la activación de caspasas. Por lo tanto, si se retiran los inductores sólo cuando todas las células llegan a la activación de caspasas, algunas células pueden haber ya alcanzado la etapa de fragmentación de ADN, haciéndolas incapaces de recuperarse incluso después del retiro de inductor. No se sugiere inducir apoptosis durante demasiado tiempo lograr un mayor porcentaje de células caspasas activadas pero con el costo de dejar a un gran número de células que mueren después de la recolección. Además, el tiempo de incubación y la concentración de colorante que etiquetas células caspasa activa deben optimizarse cada vez que una nueva línea celular se utiliza por primera vez.

Otra preocupación a partir de la inducción con éxito de revocación de apoptosis en las células apoptóticas es la tasa de recuperación bajo de las células (generalmente menos de 10%). Las células han pasado por apoptosis más el procedimiento de clasificación; por lo tanto, requieren un manejo muy suave durante la centrifugación y transferencia en los pasos de recolección y resuspensión. Además, la elección de la placa o plato utilizado para el cultivo posterior no debe ser dependiente en el número de células recogidas sino en el número esperado de recuperaciones. De lo contrario, podrían asignarse demasiado poco células para revertir y volver a crecer. Dado que no madre el cáncer las células crecen a mayor velocidad y pueden dominar en el re-constituida la célula población46, del tiempo de detección no debe demasiado lejos desde el primer día de recuperación.

Este método primero aislamientos de mama cáncer de células de tallo no entonces aplica para la inducción de apoptosis donde se realiza una segunda clasificación basada en la activación de caspasas antes de conseguirán recuperar las células. La re-aparición CSC-como de células de mama en la población invertida se detecta mediante citometría de flujo. Puesto que este procedimiento de revocación en vitro apoptosis aísla las células de cáncer apoptosis puro, un número de experimentos ahora puede realizarse para entender las consecuencias de estas células real invertidas. Aparte de las células de cáncer de mama, puede estudiarse otros tipos de tumores sólidos como malignidad hematológica que son con los conocidos marcadores de CSC y pueden utilizarse diversos estímulos apoptóticos. Por lo tanto, este método es extensible y aplicable al ámbito de frontera de la investigación de cáncer.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la innovadora tecnología fondo de innovación tecnología de la Comisión: financiamiento de apoyo desde el estado clave de laboratorio de Agrobiotecnología (CUHK), el fondo de investigación biomédica de Lo Kwee-Seong y Lee Hysan Fundación. YX fue apoyado por la beca de postgrado de la CUHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40 μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus -
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

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La investigación del cáncer número 143 células madre del cáncer el cáncer de mama apoptosis revocación de apoptosis citometría de flujo separación de células activado por fluorescencia
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