Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Flow Cytometric påvisning af nydannede brystkræft stamceller-lignende celler efter apoptose tilbageførsel

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at isolere apoptotiske brystkræftceller af fluorescens-aktiveret celle sortering og yderligere opdage overgang af ikke-stamceller brystkræftceller til brystkræft stamceller-lignende celler efter apoptose vending ved flowcytometri.

Abstract

Kræft tilbagefald er længe blevet undersøgt af onkologer, mens de underliggende mekanismer er uklare. For nylig har fandt vi og andre, at et fænomen kaldet apoptose tilbageførsel fører til øget tumorigenisitetsforsøg i forskellige cell modeller under forskellige stimuli. Tidligere undersøgelser har været fokuseret på sporing denne proces in vitro- og in vivo; dog har isolering af virkelige tilbageførte celler endnu skal opnås, hvilket begrænser forståelsen af konsekvenserne af apoptose tilbageførsel. Her, drage vi fordel af en Caspase-3/7 grøn påvisning farvestof til etiketten celler med aktiveret caspases efter apoptotiske induktion. Celler med positive signaler er yderligere sorteret af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til nyttiggørelse. Morfologiske undersøgelse under konfokalmikroskopi hjælper bekræfte apoptotiske status før FACS. En stigning i tumorigenisitetsforsøg kan ofte henføres til elevation i procentdelen af kræft stamceller (CSC)-gerne celler. Også, da heterogenitet af brystkræft, at identificere oprindelsen af disse CSC-lignende celler ville være afgørende for kræftbehandling. Dermed, vi forbereder brystkræftceller for ikke-stamceller før udløser apoptose, isolere caspase-aktiverede celler og udfører apoptose tilbageførsel procedure. Flow flowcytometri analyse viser, at brystkræft CSC-lignende celler vises igen i omvendt gruppen, med angivelse af brystkræft CSC-lignende celler er passeres fra ikke-stamceller brystkræftceller under apoptose tilbageførsel. I Resumé omfatter denne protokol isolering af apoptotiske brystkræftceller og påvisning af ændringer i CSC procentdel i tilbageførte celler ved flowcytometri.

Introduction

Kræft har været en førende årsag til død, forårsager tung byrde at lande over hele verden1. Brystkræft rangerer højt, både hvad angår forekomst og dødelighed hos kvindelige patienter blandt alle typer af kræft1. På grund af kræft heterogenitet bruges en kombination af narkotika som regel i kemoterapi for kræft celle død2,3,4. Men da fælles kemoterapeutiske stoffer ofte målrette DNA5,6, protein syntese7,8 og/eller mikrotubulus dynamics9, hurtigt voksende celler er påvirket mest mens inaktiv celler såsom kræft stamceller (CSC) s er som regel mindre påvirket10. CSCs er derfor mere tilbøjelige til at overleve efter den behandling, som senere fører til lægemiddelresistens og kræft tilbagefald10,11. Derfor, afskaffelse af CSCs er blevet et vigtigt emne for kræftbehandling og undersøgelse af CSCs oprindelse er nødvendig.

Flere undersøgelser om fænomenet af apoptose tilbageførsel er blevet udført i det seneste årti12,13,14,15,16,17,18 , 19. før fremkomsten af dette begreb, det er blevet almindeligt accepteret at celler uigenkaldeligt vil gennemgå apoptose efter caspase aktivering. Caspases er en familie af protein enzymer, der spiller vigtige roller i indledningen og udførelse stadier af apoptose, herunder dannelsen af de apoptotiske komplekse og kløvningen af downstream substrater20. Aktivering af bøddel caspases såsom caspase 3 eller caspase 7 har været betragtet som "point of no return" for apoptose21. Men forskere for nylig observeret at apoptose tilbageførsel opstår både in vitro- og in vivo, under hvilke celler kan gendanne fra apoptose selv efter caspase aktivering12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Desuden aggressive funktioner såsom højere modstand mod den oprindelige apoptotiske inducer og højere invasionsevne registreres i den tilbageførte kræft celler15. Derfor blev det foreslået, at procentdelen af CSC-lignende celler ville være højere i den tilbageførte befolkning i forhold til de ubehandlede celler, i sidste ende bidrager til de mere ondartet funktioner efter apoptose tilbageførsel18.

Tidligere, mange har gjort en indsats til at spore den apoptose vending i vitro og endnu vigtigere, in vivo, som i høj grad hjælper bekræfte universelle i denne proces16,17,19. Der mangler dog en systemisk undersøgelse af konsekvenser af omvendt celler på grund af den utilfredsstillende isolation af celler, der har virkelig været underkastet apoptose tilbageførsel. Der er behov for at erhverve rene apoptotiske celler og gendanne dem til yderligere undersøgelse. Dermed, vi bruger den traditionelt godt accepteret markør af bøddel caspase aktivering som markør af "point of no return"21 for apoptose og udnytte fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) for at diskriminere caspase-aktiverede celler farves med Caspase-3/7 grøn påvisning farvestof. Farvestoffet er kovalent kædet sammen med en kort aminosyresekvens DEVD, som kan genkendes og kløvet af aktive caspases 3/7. Kløvningen hjælper med at frigive farvestof, som vil translocate fra cytosol til kernen hvor det binder sig til DNA og udsender stærke fluorescens. Denne procedure undgås ved hjælp af en bulk celle population, ikke kan nogle celler har undergået apoptose.

CSCs eller tumor-indlede celler er blevet identificeret i mange solide tumorer ved hjælp af et enkelt eller en kombination af flere overflade marker(s) og meget få antallet af disse celler er tilstrækkelige til at form tumorer hos immundefekte mus22,23, 24,25,26,27. En kombination af CD44 og CD24 har været almindeligt anvendt i bryst CSC undersøgelser, og CD44+/CD24- celler har været defineret som bryst CSCs26,27,28,29 , 30. for nylig, vi har udført en række eksperimenter for at bekræfte den foreslåede forhold mellem apoptose tilbageførsel og CSCs og demonstrere at tilbageførte brystkræftceller fået øget tumor-dannende evne in vitro- og in vivo med en forhøjede procentdel af celler med CSC markører18. Selv om vi ikke kunne udelukke muligheden for, at bryst CSCs overleve bedre og dermed få beriget efter apoptose tilbageførsel, især når vi isolere ikke-stamceller kræftceller og emne dem til apoptose tilbageførsel, CSC vil dukke op i den oprindeligt ikke-stamceller kræft celle population, tyder på, at ikke-stamceller kræft celler kan bidrage til stigningen i procentdelen af CSCs under apoptose tilbageførsel.

Denne artikel har til formål at demonstrere overgangen fra ikke-stamceller brystkræftceller til brystkræft CSC-lignende celler efter apoptose vending og til at opdage denne overgang ved flowcytometri. De ikke-stamceller brystkræftceller er oprindeligt udarbejdet ved at isolere CD44-/CD24+ bryst kræftceller af FACS. Derefter er apoptose induceret og bekræftet af morfologiske ændringer under mikroskop. Bagefter, apoptotiske celler positivt mærket af Caspase 3/7 grøn påvisning farvestof er isoleret af FACS og yderligere kulturperler i mangel af apoptotiske induktorer til apoptose tilbageførsel. De tilbageførte celler er derefter farves med CSC markører efter 7 dage af recovery for flow cytometric analyse. Celler med CD44+/CD24- markører vises igen i den tilbageførte befolkning, tyder på, at overgangen fra ikke-stamceller kræftceller til CSC-lignende celler er opstået under apoptose tilbageførsel.

Apoptose tilbageførsel er blevet observeret i flere kræft cellelinjer samt normale primærelementer behandlet med forskellige apoptotiske stimuli i vitro12,13. Denne proces er også blevet spores i Drosophila model in vivo16,17,19. Mange oplysninger om den underliggende mekanisme for kræft tilbagefald i forskellige kræft sygdomsmodeller og oprindelsen af CSCs kan opnås ved hjælp af teknikken, som beskrevet i dette håndskrift.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af brystet ikke-stamceller kræftceller

  1. Kultur MCF-7 og MDA-MB-231 celler i 10 mL af phenol rød-fri Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS) i en 100 mm parabol. Kultur T47D i 10 mL af phenol rød-fri RPMI 1640 medium suppleret med 2 mM L-glutamin, 10% varme-inaktiverede FBS, og 1% v/v Penicillin-Streptomycin (PS) i en 100 mm parabol. Kultur celler ved 37 ° C i en 5% CO2/95% luft celle kultur inkubator.
    Bemærk: Phenol-rød påvirker fluorescens-baseret detektion, men har også en potentiel indflydelse på væksten af brystkræftceller på grund af sin østrogenlignende effekter31. For eksempel, kunne phenol rød stimulere progesteron receptor og vækst af MCF-7 celler31. Det kan også stimulere væksten af T47D celler31.
  2. Vask celler med 2 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS) to gange. Tilsættes 2 mL 0,05% trypsin-EDTA til MCF-7 og MDA-MB-231 eller 2 mL 0,25% trypsin-EDTA til T47D celler.
    Bemærk: Koncentrationen af trypsin-EDTA behov for separation af celler blandt forskellige breast cancer celletyper variere, mens en upassende koncentration kan påvirke udtryk mønster af nogle celle overflade markører som CD44 og CD2432.
  3. Kultur retter i 5 min ved 37 ° C under en atmosfære med 5% CO2/95% luft. Ofte kontrollere udstationering af celler under mikroskop for at forhindre celler fra overdreven fordøjelse med trypsin-EDTA.
  4. Når over 90% celler frigøre, tilsættes 5 mL af udfyldte RPMI medium til fadet og tilsæt det over lag celleoverfladen flere gange.
  5. Overfør celler til en 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 300 x g og 4 ° C i 5 min.
    Bemærk: Normalt, kan ca 6 x 106 celler være fremstillet af en 100 mm parabol når confluency når 70%.
  6. Supernatanten og resuspend pellets på 106 celler/100 μL FACS buffer (PBS indeholdende 0,5% BSA og 0,1% natriumazid) i 1,5 mL microcentrifuge rør.
  7. Opdele celler i flere rør. For MCF-7 celler, opdele celler i 4 rør: to for isotype styrer, én for CD24 enkelt farvning som CD24 positiv kontrol og for dobbelt farvning.
  8. Til T47D celler, opdele celler i 3 rør: to isotype kontrol-og en for dobbelt farvning.
  9. For MDA-MB-231 celler, opdele celler i 4 rør: to for isotype styrer, én for CD44 enkelt farvning som CD44 positiv kontrol og for dobbelt farvning.
  10. Centrifuge rør igen på 300 x g og 4 ° C i 5 min. supernatanten fjernes, og derefter tilføje Fc blok fortyndes 1:50 i FACS buffer.
  11. Inkuber prøver på is i 20 min. i mørke inden centrifugering ved 300 x g og 4 ° C i 5 min. supernatanten.
  12. Tilføj fluorokrom-konjugeret monoklonalt antistof mod human CD44 (PerCP-Cy5.5) og CD24 (PE) på 1:40 og 1:10 fortyndinger (i FACS buffer) i dobbelt farvning grupper. For positive kontroller, tilføje CD44 (PerCP-Cy5.5) til MDA-MB-231 og tilføje CD24 (PE) til MCF-7 celler i den samme koncentration, henholdsvis.
    Bemærk: Kombinationen af CD44 og C24 har været almindeligt anvendt i bryst CSC undersøgelse26,27,28,29,30.
  13. For kontrolgruppen isotype tilføje PerCP-Cy5.5 musen IgG2b, κ på en 1:40 fortynding som kontrolelementet isotype for CD44 antistoffer og PE mus IgG2a, κ på en 1:10 fortynding som kontrolelementet isotype for CD24 antistoffer på 106 celler/100 μL.
    Bemærk: Isotype kontrolelementer for antistoffer af interesse er anbefalet som negative kontroller33.
  14. Inkuber prøver (fra trin 1.12 og 1.13) ved 4 ° C i mørke i 30 min. Centrifuge på 300 x g og 4 ° C i 5 min. supernatanten.
  15. Vask pellet to gange med 500 μL af PBS og centrifugeres ved 300 x g og 4 ° C i 5 min.
  16. Knyt resuspenderes i 0,5 mL PBS og filtreres gennem et 40 µm nylon mesh før du kører på et fluorescens-aktiveret celle sorteringsanlæg.
  17. Henblik gating og kompensation pletten MCF-7 celler med PE-konjugerede anti-CD24 antistoffer og plette MDA-MB-231 celler med PerCP-Cy5.5-konjugerede anti-CD44 antistoffer som positive kontroller. Brug celler farves med isotype kontrolelementer som negative kontroller (figur 1).
  18. Indsamle celler med CD44-/CD24+ markører i runde-bunden polystyren 12 x 75 mm rør indeholdende 1 mL af samling medium (phenol rød-fri RPMI 1640 medium suppleret med 20% varme-inaktiverede FBS og 2% v/v PS). Der centrifugeres rør på 300 x g og RT i 5 min, og supernatanten.
    Bemærk: CSC-lignende celler i brystkræftceller er defineret som CD44+/CD24- celler26,27,28,29,30, og brystet ikke-stamceller kræftceller er defineret som CD44-/CD24+ celler18 (figur 1).
  19. Plade sorteret bryst ikke-stamceller kræftceller i kultur parabol indeholdende frisk samling medium for yderligere kultur ved 37 ° C i 5% CO2 celle kultur inkubator.

2. apoptotiske induktion og påvisning

  1. Forberede 1 mM staurosporine12,34 i DMSO. Tilføj 25 μL af 1 mM staurosporine til den færdige medium af MCF-7 celler til at gøre op til 10 mL af endelige rumfang (2,5 μM staurosporine) i en 15 mL konisk slange for gruppen behandlede MCF-7. Pipette at blande indholdet jævnt.
  2. Fjern næringssubstratet fra cellerne, vaske cellerne med 2 mL PBS én gang. Derefter tilsættes 10 mL af medium med 2,5 μM staurosporine til MCF-7 celler til 6 h at inducere apoptose, når celle tæthed når 70% confluency.
  3. Forberede 1 mM paclitaxel35,36 i DMSO. Tilføje 12,5 μl 1 mM paclitaxel til afsluttet mellemlang af T47D celler til at gøre til en afsluttende bind 10 ml (5 μM paclitaxel) i en 15 mL konisk slange for gruppen behandlede T47D. Pipette at blande indholdet jævnt.
  4. Fjerne næringssubstratet fra cellerne, og cellerne vaskes med 2 mL PBS én gang. Derefter tilsættes 10 mL af medium med 5 μM paclitaxel til T47D cellerne i 10 timer at inducere apoptose, når celle tæthed når 70% confluency.
    Bemærk: Induktion time og koncentrationen af de induktorer, der inducerer apoptose bør optimeres, når en ny cellelinje bruges for første gang.
  5. For gruppen opløsningsmiddel-behandlede MCF-7 tilføje 25 μl sterilt dimethylsulfoxid (DMSO) til den færdige medium af MCF-7 celler til at gøre til en afsluttende bind af 10 mL (dvs. 0,25% v/v DMSO) i en 15 mL konisk slange. Pipette at blande indholdet jævnt.
  6. Fjern næringssubstratet fra opløsningsmidlet behandlet MCF-7 celler, vask med 2 mL PBS én gang. Derefter tilsættes 10 mL af medium med 0,25% v/v DMSO for 6 h som kontrolelementet opløsningsmiddel for STS.
  7. Tilsættes 5 μl i sterile DMSO afsluttet mellemlang af T47D celler til at gøre til 10 mL endelige mængden (dvs. 0,05% v/v DMSO) i en 15 mL konisk slange for gruppen opløsningsmiddel-behandlede T47D. Pipette at blande indholdet jævnt.
  8. Fjerne næringssubstratet fra de opløsningsmiddel behandlede T47D celler, vask med 2 mL PBS én gang. Derefter tilsættes 10 mL medium med 0,05% v/v DMSO for 10 h som kontrolelementet opløsningsmiddel for paclitaxel.
  9. At observere de morfologiske ændringer af behandlede celler, pletten celler med 50 nM Mitotracker røde CMXRos og 250 ng/mL Hoechst 33342, og der inkuberes i en anden 20 min ved 37 ° C under en atmosfære med 5% CO2/95% luft. Observere den typisk apoptotiske celle morfologi under et 60 x Konfokal laser scanning mikroskop (figur 2).
    Bemærk: Typiske apoptose morfologi omfatter celle svind, membran blebbing, mitokondrier fragmentering og nukleare kondens men med intakt cellulære membran12,13,14,15 ,18,37.

3. isolering af apoptotiske celler og apoptose tilbageførsel Procedure

  1. Pletten både apoptotiske inducer - og solvens-behandlede MCF-7 eller T47D celler med 3 μM Caspase-3/7 grøn påvisning farvestof i celle koncentration på 106/mL i mørke i 30 min. ved 37 ° C under en atmosfære med 5% CO2/95% luft.
  2. Filtrer celler gennem en 40 µm nylon mesh før du kører på sorteringsanlæg til sortering.
  3. For gating formål, først gate den største befolkning (R1) og udelukke resterne af plotte graf i prikker med forward scatter og side scatter (figur 3).
  4. Bruge de ubehandlede celler uden at tilføje Caspase-3/7 grøn påvisning farvestof som en negativ kontrol til gate negative regionen (R2) (figur 3A).
  5. Bruge celler behandles med staurosporine12,18,34 i 24 timer og farves med farvestoffet som positiv kontrol for at gate positive regionen (R3) (figur 3B).
  6. Indsamle positive celler (R3) fra de inducer-behandlede grupper i runde-bunden polystyren 12 x 75 mm rør indeholdende 1 mL af samling medium, (samme som samling medium taktfast 1.18) (figur 3C-3D). Der centrifugeres rør på 300 x g og RT i 5 min, og supernatanten.
  7. Indsamle negative celler (R2) fra opløsningsmiddel-behandlede grupper i runde-bunden polystyren 12 × 75 mm rør med 1 mL af samling medium som i trin 3.6 (figur 3E-3F).
    Bemærk: En lille del af celler (f.eks. 10.000 celler) kan indsamles og re-Run på sorteringsanlæg at kontrollere mønster af aktive caspases markør. Hvis mere end 90% af sorterede opløsningsmiddel-behandlede celler er vist i regionen caspase-negative eller over 90% af sorterede inducer-behandlede celler er vist i regionen caspase-positive, er disse indsamlede celler menes at være forholdsvis ren (tal 3 C-3F). Ellers, regionen sortering og/eller sorteringsanlæg skal nulstilles.
  8. Resuspend sorteret cellerne i frisk samling medium og frø dem i 12-godt vævskultur plader og kultur ved 37 ° C under en atmosfære med 5% CO2/95% luft i 7 dage for apoptose tilbageførsel.

4. bekræftelse af apoptose i Caspase-aktiverede celler

  1. Bland 10 mM HEPES, 140 mM NaCl og 2,5 mM CaCl2 at forberede annexin binding buffer (pH 7,4). Gemme buffer ved 4 ° C og undgå bufferen til at udsætte for lys.
  2. Forberede en 100 µg/mL brugsopløsning af propidium Iodid (PI) ved at fortynde 5 µL af 1 mg/mL PI stamopløsning i 45 µL af annexin binding buffer. Gemme løsning ved 4 ° C og undgå løsning at udsætte for lys.
    Bemærk: PI er en potentiel mutagen og skal håndteres med omhu.
  3. Forberede de inducer-behandlede celler som trin 2.1 til 2.5.
  4. Indsamle inducer-behandlede MCF-7 eller T47D celler af pipettering medium over cellelag 3-5 x for at frigøre cellerne. Overfør celler til en 15 mL konisk slange.
  5. Der centrifugeres ved 300 x g og RT i 5 min. Fjern supernatanten.
  6. Resuspend celler med udfyldte medium i celle koncentration på 106/mL i 1,5 mL microcentrifuge rør og plette celler med 3 μM Caspase 3/7 grøn påvisning farvestof i mørke i 30 minutter ved 37 ° C.
  7. Der centrifugeres ved 300 x g og RT for 5 min. kassere analysere.
  8. Cellerne vaskes med 1 mL iskold PBS og centrifugeres ved 300 x g og 4 ° C i 5 min. kassér analysere.
  9. Resuspend celler i 100 μL af annexin binding buffer med Tilføj 5 μl af annexin V konjugationen og 1 µL af 100 µg/mL PI brugsopløsning til hver 100 μL af cellesuspension og inkuberes celler i 15 min. ved stuetemperatur.
    Bemærk: Annexin V og PI er almindeligt anvendt sammen til at mærke apoptotiske celler i flow flowcytometri38,39,40.
  10. Tilføj 400 µL af annexin binding buffer, blandes forsigtigt. Holde prøver på is før du kører på en flow Flowcytometret.

5. måling af bryst CSC-lignende celler ved flowcytometri

  1. Høste de tilbageførte MCF-7 i begge inducer - eller opløsningsmiddel-behandlede grupper med 0,05% trypsin-EDTA. Høste T47D celler i begge inducer - eller opløsningsmiddel-behandlede grupper eller med 0,25% trypsin-EDTA som i trin 1,2 til 1,5.
  2. Pletten celler med fluorokrom-konjugeret monoklonalt antistof mod human CD44 (PerCP-Cy5.5) og CD24 (PE) som i trin 1.12. I mellemtiden Forbered isotype kontrolelementer som i trin 1.13.
  3. Køre cellerne på et flow forskellige og opdage procentdelen af celler med CD44+/CD24- markører.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at observere overgang fra bryst ikke-stamceller kræftceller til brystkræft CSC-lignende celler, en første sortering af CD44-/CD24+ brystkræftceller var nødvendigt. For cellelinie MCF-7 som er omkring 0,15% celler med CSC markører i den oprindelige befolkning (figur 1), dette trin hjalp udelukke muligheden for CSC berigelse under apoptose tilbageførsel. Tværtimod, hvis der var ingen celler med CSC markører i den oprindelige befolkning, kunne som for T47D celler (figur 1), denne sortering fremgangsmåde udelades. Faktisk, gating påvirket definitionen af positive og negative for hver markør, der ville i sidste ende påvirke procentdelen af CSC bestemmes. Derfor, passende kontrol herunder isotype kontrol for antistoffer af interesse, enkelt farvede objekter for hver markør bør omhyggeligt valgt og forberedt til gate justering (figur 1).

Med brystkræftceller for ikke-stamceller, kunne apoptose tilbageførsel model derefter fastslås. Typiske morfologiske ændringer kunne konstateres efter tilføjer apoptotiske induktorer og celler bør komme fra apoptose med lignende morfologi efter narkotika tilbagetrækning (figur 2). Caspase-3/7 genkender aminosyresekvens DEVD i Caspase-3/7 grøn påvisning farvestof og de aktive former af caspase-3/7 er i stand til at kløve dette websted41. Oprindeligt, fluorescens af Caspase-3/7 grøn påvisning farvestof i cytosol er svag, mens hvis farvestoffet er kløvet og omplantes til kernen, fluorescens signal ville blive forstærket efter sin binding til DNA i kernen. Denne åbenlyse forskel kunne være kendetegnet ved flowcytometri. Derfor, disse caspase-aktiveret celler kunne mærkes og sorteres på grundlag af deres højere fluorescens intensitet sammenligne med dem uden caspase aktivering (tal 3A-3D). Under den apoptotiske induktion proces, en passende opløsningsmiddel kontrol skal medtages: opløsningsmiddel-behandlede celler uden caspase aktivering blev indsamlet (tal 3E og 3F) at udelukke muligheden for, at proceduren FACS eller opløsningsmiddel selv var årsagen til overgangen, hvis nogen.

For at vise, at disse FACS-sorteret caspase-aktiverede celler var faktisk apoptotiske, farves vi Co disse celler med Annexin V og PI. En af de tidlige forandringer i apoptotiske celler er omplantning af phosphatidylserin fra den indvendige side af plasma membran ydre overflade af cellen13,38,39,40; denne udlægning af phosphatidylserin kunne være opdaget af Annexin V. Mens denne ændring ikke er enestående for apoptose, kan PI anvendes for at skelne apoptose fra nekrose baseret på integritet af cellemembranen. Celler med Annexin V bindende men uden PI farvning betragtes således som apoptotiske celler. Caspase-aktiverede celler i apoptotiske inducer behandlingsgrupper fandtes at være Annexin V positiv og PI negative, hvilket tyder på, at de var apoptotiske celler (figur 4).

Efter den anden sortering baseret på caspase aktivering i apoptotiske celler, blev disse apoptotiske celler indsamlet og efterfølgende kulturperler til nyttiggørelse. De tilbageførte celler, der var i live kunne vedhæfte kultur beholder bund og fortsætte til at formere. Efter 7 dage, blev farvning af CD44 og CD24 udført i de tilbageførte celler mens kontrol var forberedt på samme tid som før. Sammenlignet med de opløsningsmiddel-behandlede grupper (figur 1), flow cytometric analyse viste, at der var begivenheder (celler) optræder i CD44+/CD24- kvadrant i tilbageførte bryst ikke-stamceller kræft celle population (figur 1) . Da vi havde allerede udelukket celler med CD44+/CD24- forud for apoptose induktion og kun CD44-/CD24+ ikke-stamceller brystkræftceller blev valgt, disse CD44+/CD24- CSC-lignende celler kun kunne passeres fra ikke-stamceller brystkræftceller under apoptose tilbageførsel.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative bryst CSC markør farvning på brystkræftceller i flowcytometri.
MCF-7, MDA-MB-231 og T47D var farves med fluorokrom-konjugeret monoklonalt antistof mod human CD44 (PerCP-Cy5.5) og CD24 (PE). Celler var først låge af forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) (P1) at udelukke debris. Isotype kontrol af CD24 og CD44 blev brugt som negative kontroller for CD24 og CD44 henholdsvis. MCF-7 celler farves med CD24 blev anvendt som positiv kontrol for CD24 og MDA-MB-231 celler farves med CD44 blev anvendt som positiv kontrol for CD44. Ikke-stamceller MCF-7 brystkræftceller (P2) blev sorteret. Disse sorteret celler og T47D celler blev udsat for apoptose tilbageførsel procedure. CSC-lignende (CD44+CD24-) celler viste sig efter apoptose tilbageførsel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Morfologiske ændringer af brystkræftceller under apoptotiske stimulus induktion.
Brystkræftceller viste typisk apoptotiske morfologiske ændringer herunder celle svind, membran blebbing, mitokondrier fragmentering (gule pile i de monokrome tal) og nukleare kondens. Kerner (i blåt): kerner fra celler farves med Hoechst 33342 blev vist i blå farve. Mitokondrier (i pink): mitokondrier af celler farves med Mitotracker Red CMXRos blev vist i lyserød farve. Flettede: tal flettet i to farver viser både mitokondrier og kerner. Mitokondrier (i gråt): mitokondrier af celler farves med Mitotracker Red CMXRos blev vist i sort/hvid. Differential interferens kontrast (DIC): hele celler. Øvre: MCF-7 celler blev behandlet med staurosporine (STS) til 6 h derefter tilbageføres til 24 h. lavere: T47D celler blev behandlet med paclitaxel til 10 h med tilbageførsel til 24 h. skala barer = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Caspase aktivering analyse af sorteringsanlæg. (A) Unstained MCF-7 celler uden staurosporine (STS) behandling blev brugt som negativ kontrol (R2). (B) MCF-7 celler behandles med staurosporine (STS) for 24 h. celler i R3 region blev betragtet som de caspase-aktiverede celler. (C) MCF-7 celler behandles med staurosporine (STS) for 6 h. celler i R3 region var FACS-sorteret. (D) FACS-sorteret caspase-aktiveret MCF-7 celler efter staurosporine (STS) behandling for 6 h var omvalg. (E) DMSO-behandlede MCF-7 celler. (F) FACS-sorteret celler uden caspase aktivering efter DMSO behandling for 6 h var igen køre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Annexin V og PI farvning af caspase-aktiverede celler i flowcytometri. MCF-7 og T47D celler var for det første låge af forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) (P1) at udelukke debris. Celler, der var ubehandlede med apoptotiske induktorer og uden nogen farvning blev brugt som negative kontroller. For celler behandles med apoptotiske induktorer, caspase-aktiverede celler [dvs. Caspase-3/7 grøn positive celler] blev udvalgt (P3) viser fluorescens-intensiteten af Annexin V og PI farvning. Alle Caspase-3/7 grøn positive celler blev Annexin V positive og PI negative, hvilket tyder på, at de var apoptotiske. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en direkte og klar måde til påvisning af ikke-stamceller brystkræftceller overgang ind breast CSC-lignende celler som følge af apoptose tilbageførsel. Bekræftelse af CSC egenskaber af disse tilbageførte celler kunne bistås ved hjælp af jegn vitro mammosphere dannelse assay og i vivo xenograft transplantation i immundefekte mus18,24,26 ,27,42,43,44,45. Her bruger vi to breast cancer cellelinjer, men denne protokol kan anvendes yderligere i andet bryst kræft cellelinjer. Da dette fænomen er tilsyneladende i breast cancer cellelinie i hvilke færre antal CD44+/CD24- celler findes oprindeligt, det foreslås ikke for at vælge cellelinjer som MDA-MB-231, hvor der er mere end 90% af CD44+ celler.

Da gating er vigtigt i analysen af handelsstrømmen, bør ordentlig og tilstrækkelig kontrol være forberedt på forhånd. For sortering, bestemmes renheden også før den faktiske indsamling af celler. For eksempel, for at kende renheden af den første sortering, kan en lille del af celler (f.eks. 10.000 celler) indsamles og re-Run på sorteringsanlæg at kontrollere mønster af CSC markører. Hvis mere end 90% af disse sorteres celler er CD44-/CD24+ og er ikke vist i CD44+/CD24- region, de indsamlede celler menes at være forholdsvis ren (figur 1). Hvis celler vises i CD44+/CD24- region, regionen sortering og/eller sorteringsanlæg skal nulstilles. Sortering skal foregå så sterilt som muligt, enten ved hjælp af et sorteringsanlæg inde kultur hood eller tilføje antibiotika i indsamling og næringssubstratet for sorteret celler.

Kræft celletyper end brystkræft kan også valgt og induceret med forskellige apoptotiske stimuli at etablere apoptose tilbageførsel model. Mens caspase aktivering kunne opdages så tidligt som 2 h, bør den sortering tid udvælges omhyggeligt. Da celler i befolkningen ikke er synkroniseret, på et bestemt tidspunkt punkt, hver celle kan have nået forskellige stadier af apoptose. I mellemtiden holde celler går videre til en apoptotisk død efter caspase aktivering. Derfor, hvis induktorer fjernes kun når alle celler når caspase aktivering, nogle celler kan allerede nået fase af DNA fragmentering, hvilket gør dem i stand til at inddrive selv efter inducer fjernelse. Det foreslås ikke for at inducere apoptose i alt for lang tid at opnå en højere procentdel af caspase-aktiverede celler, men med omkostningerne ved forlader et stort antal celler dør efter samling. Udover, at inkubationstiden og farvestof koncentrationen, at etiketter caspase-aktiverede celler skal optimeres hver gang en ny cellelinie anvendes for første gang.

En anden bekymring fra held inducere apoptose vending i de apoptotiske celler er den lave inddrivelsessats celler (normalt mindre end 10%). Cellerne har været igennem apoptose plus den sortering procedure; Derfor, de kræver meget skånsom håndtering under centrifugering og overførsel på samling og resuspension skridt. Også, bør valget af tallerken eller fad bruges til efterfølgende kultur ikke være afhængig af antallet af celler, der opsamlet, men det forventede antal inddrivelser. Ellers kunne celler allokeres for tyndt til at vende og re-vokse. I betragtning af at ikke-stamceller kræft celler vokse til en højere hastighed og kan dominere i re udgjorde cellen befolkningen46, bør afsløring tid ikke være for langt væk fra den første dag, opsving.

Denne metode første isolater bryst ikke-stamceller kræftcelle derefter gælder dem for apoptotiske induktion hvor en anden sortering udføres baseret på caspase aktivering før celler få tilbagebetalt. Re-udseendet af brystkræft CSC-lignende celler i den tilbageførte befolkning er påvist ved flowcytometri. Da denne in vitro- apoptose tilbageførsel fremgangsmåde isolerer ren apoptotiske kræftceller, kan en række eksperimenter nu gennemføres for at forstå konsekvenserne af disse reelle tilbageførte celler. Foruden brystkræftceller, andre solid tumortyper samt hæmatologiske malignitet, der er med kendte CSC markører kan studeres og forskellige apoptotiske stimulus kan bruges. Denne metode er derfor forlænges og gælder for en pensionær anvendelsesområde kræft undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den Innovative teknologi fond af Innovation teknologi Kommissionen: finansiering støtte fra den statslige nøglen laboratorium af Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong biomedicinsk forskningsfond og Lee Hysan Foundation. Y.X. blev støttet af den postgraduate studentship fra CUHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40 μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus -
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

Tags

Kræftforskning spørgsmålet 143 kræftstamceller brystkræft apoptose apoptose tilbageførsel flowcytometri fluorescens-aktiveret celle sortering
Flow Cytometric påvisning af nydannede brystkræft stamceller-lignende celler efter apoptose tilbageførsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. … More

Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal. J. Vis. Exp. (143), e58642, doi:10.3791/58642 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter