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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Fluxo Cytometric deteção da recém-formada mama câncer células-tronco células após a reversão de apoptose

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar células de câncer de mama apoptotic classificando fluorescência-ativado da pilha e detectar ainda mais a transição de células-tronco de câncer de mama para células de células-tronco, como câncer de mama após a reversão de apoptose por citometria de fluxo.

Abstract

Recorrência de câncer há muito tempo tem sido estudada por oncologistas, enquanto os mecanismos subjacentes permanecem obscuros. Recentemente, nós e os outros encontraram que um fenômeno chamado apoptose inversão leva a aumentada tumorigenicidade em vários modelos de célula sob diferentes estímulos. Estudos anteriores concentraram-se em localizar este processo in vitro e in vivo; no entanto, o isolamento de células real invertidas ainda tem de ser alcançado, que limita a nossa compreensão sobre as consequências da inversão de apoptose. Aqui, aproveitamos uma tintura de deteção de Caspase-3/7 verde para células de rótulo com caspases ativadas após a indução da apoptose. Células com sinais positivos são mais separadas por fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação para a recuperação. Análise morfológica sob microscopia confocal ajuda a confirmar o status de apoptotic antes FACS. Um aumento de tumorigenicidade muitas vezes pode ser atribuído à elevação no percentual de câncer células-tronco (CSC)-como as células. Também, dada a heterogeneidade do cancro da mama, identificando a origem dessas células CSC-como seria fundamental para o tratamento do câncer. Assim, nos preparamos células-tronco de câncer de mama antes de desencadear a apoptose, isolando células caspase-ativado e executar o procedimento de reversão de apoptose. Análise de citometria de fluxo revela que células de mama CSC-como voltar a aparecer no grupo invertido, indicando células da mama-CSC são transitadas de células-tronco de câncer de mama durante a reversão de apoptose. Em resumo, este protocolo inclui o isolamento de células de câncer de mama apoptotic e detecção de mudanças na percentagem de CSC em células invertidas por citometria de fluxo.

Introduction

Câncer tem sido das principais causas de morte, causando um fardo pesado para países em todo o mundo1. Cancro da mama classifica altamente tanto em termos de incidência e mortalidade em pacientes do sexo feminino entre todos os tipos de câncer1. Devido a heterogeneidade do cancro, uma combinação de drogas é geralmente usada em quimioterapia para alcançar câncer célula morte2,3,4. No entanto, desde medicamentos quimioterápicos comuns muitas vezes alvo de5,de DNA6, dinâmica da proteína síntese7,8 e/ou microtubule9, crescendo rapidamente as células são afetadas mais enquanto células quiescentes, tais como câncer células-tronco (CSC) s são geralmente menos afetados10. CSCs são, portanto, mais chances de sobreviver após o tratamento, que leva mais tarde a resistência às drogas e câncer recaída10,11. Daí, eliminação de CSCs tornou-se um tema importante para o tratamento de câncer e estudo da origem do CSCs é necessário.

Foram realizados mais estudos sobre o fenômeno da reversão de apoptose na recente década12,13,14,15,16,17,18 , 19. antes do surgimento deste conceito, tem sido amplamente aceito que as células irreversivelmente passará por apoptose após a ativação de caspase. Caspases são uma família de enzimas de proteínas que desempenham um papel chave nos estágios de iniciação e execução da apoptose, incluindo a formação de complexos a apoptose e a clivagem de substratos a jusante20. Ativação de caspases carrasco como caspase 3 ou caspase 7 tem sido considerada como o "ponto sem retorno" para apoptose21. No entanto, os pesquisadores observaram recentemente que reversão de apoptose ocorre ambos in vitro e in vivo, , durante o qual células pode recuperar de apoptose, mesmo após a ativação de caspase12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Além disso, características agressivas tais como maior resistência ao indutor de apoptose original e maior capacidade de invasão são detectados no cancer inverteu as células15. Portanto, foi proposto que a percentagem de células CSC seria maior na população invertida quando comparado com as células não tratadas, eventualmente, contribuindo para as características mais malignas após reversão de apoptose18.

Anteriormente, muitos esforços foram feitos para controlar a reversão de apoptose in vitro e, mais importante, in vivo, que ajudar muito em confirmar a universalidade deste processo16,17,19. No entanto, um estudo sistemático sobre as consequências das células invertidas é insuficiente devido o isolamento insatisfatório de células que sofreram genuinamente reversão de apoptose. Há uma necessidade de adquirir pilhas apoptotic puro e recuperá-los para um estudo mais aprofundado. Assim, podemos usar o marcador tradicionalmente bem aceitado de ativação de caspase carrasco como o marcador do "ponto sem retorno"21 para apoptose e utilizar fluorescência-ativado da pilha (FACS) para discriminar caspase-ativado células manchadas de classificação com tintura de deteção de Caspase-3/7 verde. O corante é covalentemente ligado a uma sequência de aminoácidos curto, Cecilia, que pode ser reconhecida e clivada por ativas caspases 3/7. O decote ajuda a liberar a tintura, que vai translocar do citosol para o núcleo onde vincula-se ao DNA e emite forte fluorescência. Este procedimento evita o uso de uma população de células em massa em que algumas células não podem ter sofrido apoptose.

CSCs ou células de tumor-iniciando foram identificadas em muitos tumores sólidos usando um único ou uma combinação de vários marker(s) de superfície e muito poucos números destas células são suficientes para tumores de forma em camundongos imunodeficientes22,23, 24,25,26,27. Uma combinação de CD44 e CD24 tem sido comumente usada em estudos de mama CSC e CD44+/CD24– células foram definidas como o peito CSCs26,,27,28,29 , 30. recentemente, que temos realizado uma série de experimentos para confirmar a relação proposta entre apoptose reversão e CSCs e demonstrar que células de câncer de mama invertida ganharam maior capacidade de formação de tumor in vitro e in vivo com um elevada percentagem de células com CSC marcadores18. Embora nós não poderia excluir a possibilidade de que mama CSCs sobrevivem melhores e, assim, obter enriquecidas após a reversão de apoptose, importante, quando podemos isolar as células-tronco cancerosas e assunto para reversão de apoptose, CSC sairá no originalmente-tronco população de células de câncer, sugerindo que Stema câncer células podem contribuir para o aumento da percentagem de CSCs durante reversão de apoptose.

Este artigo tem como objetivo demonstrar a transição de células-tronco de câncer de mama para CSC células da mama após a reversão de apoptose e para detectar esta transição por citometria de fluxo. As células-tronco de câncer de mama são inicialmente preparadas isolando CD44–/CD24+ de mama células cancerosas por FACS. Em seguida, apoptose é induzida e confirmado por mudanças morfológicas sob o microscópio. Depois, pilhas apoptotic positivamente rotulados pelo corante verde deteção de Caspase 3/7 são isoladas por FACS e mais cultivadas na ausência de indutores de apoptose para reversão de apoptose. As células invertidas então estão manchadas com marcadores de CSC após 7 dias de recuperação para análise de fluxo cytometric. Células com CD44+/CD24 marcadores– re-aparecem na população invertida, sugerindo que transição de células-tronco cancerosas para CSC células ocorreu durante a reversão de apoptose.

Reversão de apoptose tem sido observada em câncer múltiplo linhas celulares, bem como as células primárias normais tratados com apoptotic diferentes estímulos em vitro12,13. Este processo também foi rastreado em Drosophila modelo in vivo de16,17,19. Muita informação sobre o mecanismo subjacente de recidiva de câncer em modelos de câncer de diferentes doenças e a origem do CSCs pode ser obtida através do uso da técnica, conforme descrito neste manuscrito.

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Protocol

1. preparação da mama -tronco as células cancerosas

  1. Cultura MCF-7 e células MDA-MB-231 em 10 mL de vermelho de fenol-livre Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) em um prato de 100 mm. Cultura T47D em 10 mL de vermelho de fenol-livre RPMI 1640 suplementado com 2 mM L-glutamina, 10% inactivadas pelo calor FBS e 1% v/v penicilina-estreptomicina (PS) em um prato de 100 mm. Células de cultura a 37 ° C numa incubadora de cultura de células de ar 5% CO295%.
    Nota: Vermelho de fenol afeta a detecção baseada em fluorescência, mas também tem uma potencial influência sobre o crescimento de células de câncer de mama devido a seus efeitos do estrogênio-tipo31. Por exemplo, vermelho de fenol poderia estimular receptores de progesterona e o crescimento de células MCF-731. Também poderia estimular o crescimento de células de T47D31.
  2. Células de lavagem com 2 mL de fosfato tampão salino (PBS) duas vezes. Adicione 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA a MCF-7 e MDA-MB-231 ou 2ml de 0,25% do trypsin-EDTA para células T47D.
    Nota: A concentração de tripsina-EDTA necessária para a separação de células entre tipos de células de câncer de mama diferentes variam enquanto uma concentração inadequada pode afetar o padrão de expressão de alguns marcadores de superfície celular como CD44 e CD2432.
  3. Cultura os pratos por 5 min a 37 ° C, sob uma atmosfera de ar de 95% 5% CO2. Verifique frequentemente o desprendimento das células sob o microscópio para impedir que as células da digestão excesso por tripsina-EDTA.
  4. Quando mais de 90% células desanexar, adicionar 5 mL de meio RPMI concluído ao prato e pipetá-lo sobre a superfície de camada celular várias vezes.
  5. Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugação a 300 x g e 4 ° C por 5 min.
    Nota: Geralmente, em torno de 6 x 106 células podem ser obtidas um prato 100 mm quando a confluência atinge 70%.
  6. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 106 células/100 μL de tampão de FACS (PBS contendo BSA de 0,5% e 0,1% de azida de sódio) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
  7. Divida as células em diversos tubos. Para as células MCF-7, dividir as células em 4 tubos: dois para o isotipo controles, um para CD24 única coloração como controle positivo CD24 e para dupla coloração.
  8. Para as células T47D, dividir as células em 3 tubos: dois para controles isotype e outro para dupla coloração.
  9. Para as células MDA-MB-231, dividir as células em 4 tubos: dois para o isotipo controles, um para CD44 única coloração como controle positivo CD44 e para dupla coloração.
  10. Centrifugar os tubos novamente a 300 x g e 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante e em seguida, adicione o bloco Fc diluído 01:50 no buffer de FACS.
  11. Incubar as amostras no gelo por 20 min no escuro antes de centrifugação a 300 x g e 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante.
  12. Adicionar conjugados a fluorocromo anticorpos monoclonais contra CD44 humana (PerCP-Cy5.5) e CD24 (PE) em 01:40 e 01:10 diluições (no buffer de FACS) na dupla coloração grupos. Para controles positivos, adicionar CD44 (PerCP-Cy5.5) para MDA-MB-231 e adicionar CD24 (PE) para as células MCF-7 na mesma concentração, respectivamente.
    Nota: A combinação de CD44 e C24 tem sido comumente usado no peito CSC estudo26,,27,28,29,30.
  13. Para os grupos de controle do isotipo, adicionar PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ em um 01:40 diluição como o isotipo controle para anticorpos CD44 e PE Mouse IgG2a, κ em um 01:10 diluição como o isotipo controle para CD24 anticorpos em 106 células/100 μL.
    Nota: ISOTYPE controles para os anticorpos de interesse são recomendados como controles negativos33.
  14. Incubar as amostras (a partir de etapas 1.12 e 1.13) a 4 ° C, no escuro por 30 min. centrifugar a 300 x g e 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante.
  15. Lave o pellet duas vezes com 500 µ l de PBS e centrifugar a 300 x g e 4 ° C por 5 min.
  16. Resuspenda o pellet em 0,5 mL de PBS e filtro através de uma malha de nylon de 40 µm antes de executar em um classificador fluorescência-ativado da pilha.
  17. Para fins de retenção e compensação, mancha de células MCF-7 com anticorpos anti-CD24 PE-conjugados e mancha MDA-MB-231 células com anticorpos anti-CD44 PerCP-Cy5.5-conjugados como controles positivos. Uso de células coradas com isotipo controles como controles negativos (Figura 1).
  18. Recolher pilhas com CD44–/CD24+ marcadores em tubos de fundo redondo poliestireno 12 x 75 mm, contendo 1 mL de meio de coleção (vermelho de fenol-livre RPMI 1640 suplementado com 20% inactivadas pelo calor FBS e 2% v/v PS). Centrifugar os tubos em 300 x g e RT por 5 min e descartar o sobrenadante.
    Nota: CSC, como células em células de câncer de mama são definidas como CD44+/CD24– células26,,27,28,29,30e -tronco células de câncer de mama são definidos como CD44–/CD24+ células18 (Figura 1).
  19. As células de câncer-tronco mama classificada a placa de cultura contendo meio de coleção fresca para mais cultura a 37 ° C 5% CO2 incubadora de cultura de células da placa.

2. Apoptotic indução e deteção

  1. Prepare-se 1 mM staurosporine12,34 em DMSO. Para o grupo tratado MCF-7, adicione 25 μL de 1 mM staurosporine para o médio concluído de células MCF-7 para fazer até 10 mL de volume final (2,5 μM staurosporine) em um tubo cônico de 15 mL. Pipeta para misturar o conteúdo uniformemente.
  2. Remover o meio de cultura de células, lave as células com 2 mL de PBS uma vez. Em seguida, adicione a 10 mL de meio com 2,5 μM staurosporine de células MCF-7 para 6 h de induzir apoptose quando a densidade celular atinge 70% de confluência.
  3. Prepare-se 1 mM paclitaxel35,36 em DMSO. Para o grupo tratado T47D, adicione 12,5 μL de paclitaxel de 1 mM para o médio concluído de células T47D de inventar para um volume final de 10 mL (5 μM paclitaxel) em um tubo cônico de 15 mL. Pipeta para misturar o conteúdo uniformemente.
  4. Remover o meio de cultura de células e lave as células com 2 mL de PBS uma vez. Em seguida, adicione a 10 mL de meio com 5 μM de paclitaxel às células T47D para 10 h de induzir apoptose quando a densidade celular atinge 70% de confluência.
    Nota: O tempo de indução e a concentração de indutores que induzem a apoptose devem ser otimizados sempre que uma nova linha de celular é usada pela primeira vez.
  5. Para o grupo MCF-7 tratados com solvente, adicione 25 μL de estéril dimetilsulfóxido (DMSO) para o médio concluído de células MCF-7 de inventar para um volume final de 10 mL (ou seja, 0,25% v/v DMSO) em um tubo cônico de 15 mL. Pipeta para misturar o conteúdo uniformemente.
  6. Remover o meio de cultura de células MCF-7 tratadas solventes, lave uma vez com 2 mL de PBS. Em seguida, adicione a 10 mL de meio com 0,25% v/v DMSO para 6 h como o controle de solvente para o STS.
  7. Para o grupo T47D tratados com solvente, adicione 5 μL de DMSO estéril para o médio concluído de células T47D para completar o volume final de 10 mL (ou seja, 0,05% v/v DMSO) em um tubo cônico de 15 mL. Pipeta para misturar o conteúdo uniformemente.
  8. Remover o meio de cultura de solvente T47D células tratadas, lave uma vez com 2 mL de PBS. Em seguida, adicione a 10 mL de meio com 0,05% v/v DMSO para 10 h como o controle de solvente para paclitaxel.
  9. Para observar as alterações morfológicas das células tratadas, mancha de células com 50 nM Mitotracker vermelho CMXRos e 250 ng/mL Hoechst 33342 e incube por outro 20 min a 37 ° C, sob uma atmosfera de ar de 95% 5% CO2. Observe a morfologia de célula típica apoptotic sob um 60 x laser confocal microscópio (Figura 2).
    Nota: Morfologia da apoptose típico inclui encolhimento celular, blebbing membrana, fragmentação de mitocôndrias e condensação nuclear mas com membrana celular intacta12,13,14,15 ,18,37.

3. isolamento de células apoptóticas e procedimento de inversão de apoptose

  1. Manche tanto a apoptotic indutor e solvente-tratada MCF-7 ou T47D células com tintura de deteção de Caspase-3/7 verde 3 μM na concentração celular de 106/mL no escuro por 30 min a 37 ° C, sob uma atmosfera de 5% CO295% ar.
  2. Filtre as células através de uma malha de nylon de 40 µm antes de executar no classificador para classificação.
  3. Para fins de retenção, primeiro portão grande população (R1) e excluir os detritos através de plotagem do gráfico em pontos com dispersão para a frente e dispersão lateral (Figura 3).
  4. Use as células não tratadas sem adicionar o corante de deteção de Caspase-3/7 verde como um controle negativo para portão região negativa (R2) (Figura 3A).
  5. Use as células tratadas com staurosporine12,18,34 para 24h e corados com o corante como um controle positivo para portão região positiva (R3) (Figura 3B).
  6. Colete células positivas (R3) dos grupos tratados com indutor em tubos de fundo redondo poliestireno 12 x 75 mm, contendo 1 mL de meio de coleção (mesmo como meio de coleta na etapa 1.18) (figuras 3,C-3D). Centrifugar os tubos em 300 x g e RT por 5 min e descartar o sobrenadante.
  7. Recolha pilhas negativas (R2) de grupos tratados com solvente em tubos de poliestireno de fundo redondo 12 × 75 mm com 1 mL de meio de coleção como na etapa 3.6 (figuras 3E-3F).
    Nota: Uma pequena porção de células (por exemplo, 10.000 células) pode ser recolhida e execute novamente o classificador para verificar o padrão de caspases ativo marcador. Se mais de 90% das células tratadas solvente classificadas são mostrados na região de caspase-negativo ou mais de 90% das células tratadas indutor classificadas são mostrados na região de caspase-positivo, estas células coletadas são acreditadas para ser relativamente puro (figuras 3C-3F). Caso contrário, a região de classificação e/ou o classificador deve ser reposto.
  8. Ressuspender as células classificadas no meio da coleção fresca e semente-los em placas de cultura de tecidos de 12 poços e cultura a 37 ° C, sob uma atmosfera de 5% CO295% ar durante 7 dias para a reversão de apoptose.

4. a confirmação da apoptose nas caspases ativadas células

  1. Mix 10 mM HEPES, 140 mM de NaCl e CaCl2 de 2,5 mM para preparar anexina-ligação tampão (pH 7,4). Armazenar o buffer a 4 ° C e evitar o buffer para expor à luz.
  2. Prepare uma solução de trabalho de 100 µ g/mL de iodeto de propidium (PI) por diluição 5 µ l da 1 mg/mL solução estoque de PI em 45 µ l de tampão de ligação anexina. Armazenar a solução a 4 ° C e evitar a solução para expor à luz.
    Nota: PI é um potencial mutagênico e deve ser manuseado com cuidado.
  3. Prepare as células tratadas indutor como em passos 2.1 a 2.5.
  4. Recolha a MCF-7 tratados com indutor ou T47D células pipetando o médio sobre a camada de células x 3-5 para desprender as células. Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL.
  5. Centrifugar a 300 x g e RT 5 min. descartar o sobrenadante.
  6. Ressuspender as células com médio concluído na concentração celular de 106/mL em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e manchar as células com 3 tintura de verde deteção de Caspase 3/7 μM no escuro por 30 min a 37 ° C.
  7. Centrifugar a 300 x g e RT por 5 min. descartar os sobrenadantes.
  8. Lavar as células com 1 mL de PBS gelada e de centrifugação a 300 x g e 4 ° C por 5 min. descartar os sobrenadantes.
  9. Ressuspender as células em 100 μL de tampão, anexina-ligação com o Adicionar 5 μL do conjugado annexin V e 1 µ l de 100 µ g/mL solução de trabalho para cada 100 μL da suspensão de células de PI e incubar as células durante 15 minutos à temperatura ambiente.
    Nota: Anexina V e PI são comumente usados para etiquetar pilhas apoptotic no fluxo cytometry38,39,40.
  10. Adicione 400 µ l de tampão anexina-vinculação, mistura delicadamente. Mantenha as amostras no gelo antes de executar em um citômetro de fluxo.

5. medida da mama CSC células por citometria de fluxo

  1. O MCF-7 invertida em ambos os grupos indutor ou solvente-tratada com tripsina-EDTA de 0,05% da colheita. Colheita de células T47D em ambos os grupos tratados indutor ou solvente ou com 0,25% do trypsin-EDTA como em passos de 1.2 a 1.5.
  2. Manchar as células com os anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromo contra CD44 humana (PerCP-Cy5.5) e CD24 (PE) como na etapa 1,12. Enquanto isso, prepare os isotipo controles como na etapa 1.13.
  3. Executar as células em um citômetro de fluxo e detectar a porcentagem de células com CD44+/CD24– marcadores.

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Representative Results

Fim de observar a transição do peito-tronco células de câncer de mama CSC células, uma primeira classificação do CD44–/CD24+ células de câncer de mama eram necessários. Para a linhagem de células MCF-7, que tem cerca de 0,15% células com marcadores de CSC na população original (Figura 1), esta etapa ajudou exclui a possibilidade de enriquecimento do CSC durante reversão de apoptose. Pelo contrário, se não houvesse nenhuma célula com marcadores de CSC na população original, tais como para células T47D (Figura 1), este procedimento de classificação pode ser omitido. Com efeito, gating afetou a definição do positivo e negativo de cada marcador, que eventualmente viria a influenciar a porcentagem de CSC determinado. Portanto, adequados controles, incluindo controles de isotipo para anticorpos de interesse, controles manchadas único para cada marcador devem ser cuidadosamente escolhidos e preparados para ajuste de portão (Figura 1).

Com células-tronco de câncer de mama, o modelo de reversão de apoptose posteriormente pôde ser estabelecido. Mudanças morfológicas típicas poderiam ser observadas após a adição de indutores de apoptose e células devem recuperar de apoptose com morfologia semelhante após retirada de drogas (Figura 2). Caspase-3/7 reconhece a sequência de aminoácidos Cecilia no corante de deteção de Caspase-3/7 verde e as formas ativas de caspase-3/7 são capazes de decompor esse local41. Originalmente, a fluorescência do corante deteção de Caspase-3/7 verde no citosol é fraca enquanto se o corante é clivado e translocado para o núcleo, o sinal de fluorescência seria amplificado após sua ligação ao DNA no núcleo. Esta diferença óbvia pode ser distinguida por citometria de fluxo. Portanto, essas células caspase-ativado podem ser rotuladas e resolvidas com base na sua intensidade de fluorescência maior comparando com aqueles sem ativação de caspase (figuras 3A-3D). Durante o processo de indução de apoptose, um controle solvente apropriado deve ser incluído: solvente-tratados células sem ativação de caspase foram coletadas (3F e figuras 3E) para excluir a possibilidade de que o procedimento de FACS ou o solvente em si foi a causa para a transição, se for o caso.

A fim de mostrar que essas células de caspase-ativado FACS-classificados com efeito apoptótico, nós co manchado estas células com anexina V e PI. Uma das alterações nas células apoptóticas fase inicial é a translocação de fosfatidilserina do lado interno da membrana plasmática na superfície externa do celular13,38,39,40; esta exteriorização de fosfatidilserina pode ser detectada por anexina V. Enquanto esta mudança não é exclusiva ao apoptosis, PI pode ser usado para distinguir apoptose de necrose baseado na integridade da membrana celular. Assim, células com ligação anexina V mas sem coloração PI são consideradas como células apoptóticas. Caspase-ativado células nos grupos de tratamento indutor de apoptose foram encontradas para ser anexina V positivo e PI negativas, sugerindo que eles eram células apoptóticas (Figura 4).

Após a segunda classificação com base na ativação de caspase nas células apoptóticas, estas células apoptóticas foram coletadas e posteriormente cultivadas para recuperação. As células invertidas que estavam vivas foram capazes de fixar a parte inferior do recipiente de cultura e continuam a proliferar. Após 7 dias, coloração de CD44 e CD24 foi realizada nas células invertidas enquanto controles foram preparados ao mesmo tempo como antes. Comparado com os grupos tratados com solvente (Figura 1), análise de fluxo cytometric mostrou que havia eventos (células) constantes do CD44+/CD24– quadrante na população de células-tronco de câncer mama invertida (Figura 1) . Desde que nós já tinha excluído células com CD44+/CD24– antes da indução de apoptose e apenas CD44–/CD24+ células-tronco de câncer de mama foram escolhidos, estes CD44+/CD24– CSC células só poderiam ser transitado de células-tronco de câncer de mama durante a reversão de apoptose.

Figure 1
Figura 1: Marcador de mama representante CSC coloração em células de câncer de mama em citometria de fluxo.
MCF-7, MDA-MB-231 e T47D foram corados com os anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromo contra CD44 humana (PerCP-Cy5.5) e CD24 (PE). Células foram primeiro condomínio fechadas de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) (P1) para excluir os restos. ISOTYPE controles de CD24 e CD44 foram utilizados como controles negativos para CD24 e CD44, respectivamente. Células MCF-7 manchadas com CD24 foi usado como controle positivo para CD24 e MDA-MB-231 células coradas com CD44 foi usado como controle positivo para CD44. Células de câncer de mama MCF-7 non-tronco (P2) foram classificadas. Estas células classificadas e T47D células foram submetidas a procedimento de inversão de apoptose. CSC-como (CD44+CD24–) células apareceram após reversão de apoptose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Alterações morfológicas das células de câncer de mama sob indução de estímulo apoptótico.
Células de câncer de mama mostraram apoptotic típica mudanças morfológicas incluindo encolhimento celular, blebbing membrana, fragmentação de mitocôndrias (setas amarelas nas figuras monocromáticas) e condensação nuclear. Núcleos (em azul): núcleos de células coradas com Hoechst 33342 foram mostrados na cor azul. As mitocôndrias (em rosa): mitocôndria das células coradas com Mitotracker vermelho CMXRos foram mostradas em cor-de-rosa. Mesclado: figuras mescladas em duas cores mostrando tanto mitocôndrias e núcleos. As mitocôndrias (em cinza): mitocôndria das células coradas com Mitotracker vermelho CMXRos foram mostradas em preto e branco. Contraste de interferência diferencial (DIC): células toda. Parte superior: Células MCF-7 foram tratadas com staurosporine (STS) para 6 h então invertidas para 24 h. inferior: T47D células foram tratadas com paclitaxel para 10 h com reversão para barras de escala de 24 h. = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: análise de ativação de Caspase pelo classificador. (A) Unstained MCF-7 células sem tratamento staurosporine (STS) foram utilizados como controle negativo (R2). (B) células MCF-7 trataram com staurosporine (STS) por 24 h. células na região R3 foram consideradas como as células de caspase-ativado. (C) células MCF-7 tratadocom com staurosporine (STS) para h. 6 células na região R3 foram FACS-classificados. (D), FACS-classificados caspase-ativado MCF-7 células após o tratamento de staurosporine (STS) para 6 h re-foram executadas. (E), tratados com DMSO MCF-7 células. (F) FACS-classificados células sem ativação de caspase após tratamento de DMSO para 6 h foram re-executar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: anexina V e PI coloração de células caspase-ativado em citometria de fluxo. Células MCF-7 e T47D em primeiro lugar foram bloqueadas por dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) (P1) para excluir os restos. Células que foram não tratadas com indutores de apoptose e sem qualquer coloração foram usadas como controles negativos. Para as células tratadas com indutores de apoptose, caspase-ativado células [i.e., Caspase-3/7 verde positivo] foram Selecionadodas (P3) para mostrar a intensidade de fluorescência de Annexin V e coloração de PI. Todas as células positivas Caspase-3/7 verde foram anexina V positivo e PI negativo, sugerindo que eles eram apoptotic. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve uma maneira direta e clara para detectar a transição de células-tronco de câncer de mama em células da mama CSC como resultado da reversão de apoptose. Confirmação das propriedades dessas células invertida CSC poderia assistida usando eun vitro mammosphere formação do ensaio e na vivo transplante de enxerto em camundongos imunodeficientes18,24,26 ,,27,42,,43,44,45. Aqui, usamos duas linhas de células de câncer de mama, mas este protocolo pode ser mais aplicado em outras linhas de células de câncer de mama. Uma vez que este fenômeno pode ser apreciado na linhagem de células de câncer da mama em que menos número de CD44+/CD24– células existem originalmente, é aconselhável não para escolher linhas celulares tais como MDA-MB-231, em que existem mais de 90% de CD44+ células.

Desde que o canal é importante na análise de fluxo, controles adequados e suficientes devem ser preparados com antecedência. Para a classificação, a pureza também deve ser determinada antes da coleção real de células. Por exemplo, para saber a pureza da primeira triagem, uma pequena porção de células (por exemplo, 10.000 células) pode ser coletada e execute novamente o classificador para verificar o padrão de marcadores do CSC. Se mais classificado 90% destas células são CD44–/CD24+ e não são mostrados no CD44+/CD24 região de– , as células coletadas são acreditadas para ser relativamente puro (Figura 1). Se as células aparecem no CD44+/CD24– região, região de classificação e/ou o classificador deve ser reposto. Classificação deve ser realizada tão estéril quanto possível por usando um classificador dentro dos bosques de cultura ou adição de antibióticos na coleção e meio de cultura para células classificadas.

Tipos de células de câncer à excepção do cancro da mama também podem ser escolhidos e induzidos com vários estímulos de apoptotic para estabelecer o modelo de reversão de apoptose. Enquanto a ativação de caspase poderia ser detectada logo em 2 h, o tempo de classificação deve ser cuidadosamente selecionado. Desde que as células na população não estão sincronizadas, em um momento específico ponto, cada célula pode ter atingido diferentes estágios de apoptose. Enquanto isso, células continuar a uma morte apoptótica após a ativação de caspase. Portanto, se os indutores são removidos somente quando todas as células atingem a ativação de caspase, algumas células podem já atingiram o estágio de fragmentação de DNA, tornando-os incapazes de recuperar mesmo após a remoção do indutor. Não é aconselhável para induzir apoptose por muito tempo alcançar uma maior porcentagem de células caspase-ativado, mas com o custo de deixar um grande número de células morrendo após a coleta. Além disso, o tempo de incubação e a concentração de corante que rotula células caspase-ativado devem ser otimizadas que sempre que uma nova linha de celular é usada pela primeira vez.

Outro motivo de preocupação a partir de indução com sucesso de reversão de apoptose nas células apoptóticas é a taxa de recuperação baixa das células (geralmente inferior a 10%). As células passaram por apoptose, além disso, o procedimento de classificação; Portanto, eles exigem muito suave manipulação durante a centrifugação e a transferência para as coleção e ressuspensão passos. Além disso, a escolha do prato ou prato usado para a cultura subsequente não deve ser dependente do número de células coletadas, mas sobre o número esperado de recuperações. Caso contrário, células poderiam ser alocadas também escassamente para reverter e voltar a crescer. Dado que o câncer-tronco células crescem a uma velocidade maior e podem dominar na célula reconstituída população46, o tempo de detecção não deve ser muito longe desde o primeiro dia de recuperação.

Este método primeiro isolados mama-tronco célula cancerosa e depois aplica-las para a indução de apoptose onde uma segunda classificação é feito baseada na ativação de caspase antes células estar recuperadas. O re-aparecimento de células da mama CSC na população invertida é detectado por citometria de fluxo. Uma vez que este procedimento de inversão de apoptose em vitro isola as células cancerosas apoptotic pura, uma série de experimentos agora pode ser realizada para entender as consequências destas células real invertida. Para além de células de câncer de mama, outros tipos de tumores sólidos, bem como malignidade hematológica que são com marcadores conhecidos de CSC pode ser estudada e vários estímulos apoptotic podem ser usado. Portanto, esse método é extensível e aplicável a um escopo de pensionista de investigação do cancro.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela inovadora tecnologia fundo de inovação tecnologia Comissão: financiamento de apoio do estado chave laboratório de Agrobiotecnologia (CUHK), o fundo de investigação biomédica Lo Kwee-Seong e a Fundação de Hysan Lee. Y.X. foi apoiada pelo curso de pós-bolsa de estudo do CUHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40 μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus -
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

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References

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