إيمونوبلوتينج كمية من خطوط الخلايا كمعيار للتحقق من صحة الفلورة للتحديد الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات الأنسجة الروتينية
Summary
يصف لنا استخدام الكمية إيمونوبلوتينج للتحقق من صحة الأنسجة الفلورة مقترنة بتحليل الصورة كوسيلة لتحديد كمية وتين فائدة في عينات الأنسجة (FFPE) الفورمالين–الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين. نتائجنا تثبت فائدة علم الأنسجة الفلورة للتحقق من الكمية النسبية للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات خزعة الروتينية.
Abstract
التحديد الكمي للبروتينات ذات الاهتمام في عينات الأنسجة (FFPE) الفورمالين–الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين مهم في السريرية وبحوث التطبيقات. طريقة مثلى للقياس الكمي دقيق، ولديها مجموعة واسعة نطاق ديناميكي خطي ويحافظ على وحدة الهيكلية العينة للسماح للتعرف على أنواع الخلايا الفردية. الأساليب الحالية مثل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) والطيف الكتلي immunoblotting كل تعجز عن الوفاء بهذه الشروط بسبب طبيعتها القاطع أو بحاجة إلى مجانسة العينة. كأسلوب بديل، نقترح استخدام الفلورة (إذا كان) وتحليل الصور لتحديد الوفرة النسبية لبروتين فائدة في الأنسجة FFPE. هنا نظهر أن هذا الأسلوب هو الأمثل بسهولة، وتؤدي دينامية واسعة نطاق، وهو خطيا قابلة للقياس بالمقارنة مع معيار الذهب immunoblotting الكمية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يسمح بالحفاظ على السلامة الهيكلية للعينة، ويسمح للتمييز من مختلف أنواع الخلايا، التي قد تكون حاسمة في التطبيقات التشخيصية. وعموما، هذا هو وسيلة قوية للتحديد الكمي النسبي للبروتينات في عينات فب ويمكن تكييفها بسهولة لتناسب السريرية أو احتياجات البحوث.
Introduction
الحاجة إلى تحديد كمية البروتينات في عينات خزعة الأنسجة (FFPE) الفورمالين–الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين موجود في العديد من المجالات الطبية. على سبيل المثال، يستخدم التقدير الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات خزعة الروتينية توضيح التوقعات وأبلغ العلاج ل مرضى السرطان1. ومع ذلك، الأساليب الحالية هي عادة ذاتية وتفتقر إلى التحقق من صحة.
تستخدم بشكل روتيني في مختبرات علم الأمراض إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) ويتوقف عموما على جسم الأولية الموجهة في البروتين المستهدف وجسم ثانوي مترافق مع تسمية الانزيمية مثل الفجل البيروكسيديز2. المدينة التقليدية حساسة، يمكن أن تجعل استخدام دقيقة عينات ويحافظ على سلامة المورفولوجية لعينات الأنسجة مما يسمح بتقييم التعبير البروتين ضمن سياقها نسيجية ذات الصلة. ومع ذلك، نظراً للإشارات اللونية التي تم إنشاؤها بواسطة المدينة الاختزالي، يعاني من مجموعة ديناميكية ضيقة نسبيا وإمكانات محدودة للإرسال المتعدد2،،من34. الليزر ساعد مصفوفة التصوير (استخدام-MSI) الطيف الكتلي الامتزاز/التأين يحافظ على سلامة المورفولوجية. بيد أن هذه التكنولوجيا النامية يرتبط بالقرار المورفولوجية متواضعة وتتطلب المعايرة كبيرة والتطبيع وجدواه في الاستخدام السريري الروتيني5،،من67إضعاف. وتشمل تقنيات بديلة تحديد كمية البروتين في عينات الأنسجة immunoblotting8والطيف الكتلي9،،من1011والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا)12، كل من الذي يبدأ المتجانس عينة الأنسجة. عينات الأنسجة الأساسية غير متجانسة في أنها تحتوي على العديد من أنواع الخلايا. ولذلك، لا تسمح التقنيات التي تنطوي على المجانسة العينات التحديد الكمي للبروتين في عدد سكان خلية معينة من الاهتمام مثل الخلايا السرطانية.
مثل المدينة، إذا كان قابلاً للتطبيق على الصغيرة فب عينات ويسمح بالاحتفاظ بسلامة غذائها13. ومع ذلك، بفضل طبيعة المواد المضافة إشارات الأسفار، إذا قابلة لتطبيق متعددة الأجسام الأولية وتسميات الفلورسنت. وهكذا، قد كمياً وتين فائدة نسبيا داخل خلايا معينة أو مقصورات الهاتف الخلوي (على سبيل المثال، نواة مقابل السيتوبلازم) المحددة باستخدام الأجسام المضادة الأخرى. إشارات الأسفار أيضا تتميز أكبر مجموعة ديناميكية13،14. التفوق، وإمكانية تكرار نتائج، والإمكانيات المتنوعة إذا طبقت على عينات فب قد أظهرت13،،من1415.
هذه الوثيقة يصف لنا استخدام الكمية إيمونوبلوتينج باستخدام خطوط الخلايا المحددة كمعيار الذهب للتأكد من طبيعة الكمية إذا اقترنت بتحليل الصور الحاسوب في تحديد الوفرة النسبية لبروتين فائدة في مقاطع نسيجية من عينات الأنسجة FFPE. وقد قمنا بتطبيق هذا الأسلوب بنجاح في اتباع نهج متعدد لقياس العلامات البيولوجية البروتينات في خزعة السريرية عينات16،،من1718.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قمنا بوصف أسلوب الذي يجعل من استخدام الكمية immunoblotting (IB) لإثبات جدوى الفلورة (إذا كان) للتحقق من الوفرة النسبية للبروتين المستهدف في عينات الأنسجة FFPE. أساليب القياس الكمي البروتين الحالية محدودة بطبيعتها القاطعة، مثل المدينة اللونية2،3، أو بالحاجة إلى مج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل جزئيا فردريك بانتنغ وتشارلز أفضل كندا الدراسات العليا المنح الدراسية (صباحا).
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- . The Human Protein Atlas BCL2 Available from: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018)
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
