We beschrijven het gebruik van kwantitatieve immunoblotting te valideren immunofluorescentie histologie beeldanalyse wordt gekoppeld als een middel voor het kwantificeren van een proteïne van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE). Onze resultaten tonen aan dat het nut van immunofluorescentie histologie voor het vaststellen van de relatieve hoeveelheid biomerker eiwitten in routine biopsie monsters.
Kwantificering van proteïnen van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE) is belangrijk in de klinische en onderzoek toepassingen. Een optimale methode voor de kwantificering klopt, heeft een ruime lineaire dynamisch bereik en onderhoudt de structurele integriteit van het monster dat voor de identificatie van individuele celtypes. Huidige methoden zoals immunohistochemistry (IHC) en massaspectrometrie immunoblotting elk niet voldoen aan deze bepalingen als gevolg van hun categoriale aard of moeten het homogeniseren van het monster. Als een alternatieve methode, stellen wij voor het gebruik van Immunofluorescentie (IF) en beeldanalyse te bepalen van de relatieve overvloed aan een proteïne van belang in FFPE weefsels. Hierin aantonen we dat deze methode is eenvoudig geoptimaliseerd, een breed dynamisch bereik levert, en lineair kwantificeerbare ten opzichte van de gouden standaard van kwantitatieve immunoblotting. Bovendien, deze methode maakt het onderhoud van de structurele integriteit van het monster en zorgt voor het onderscheid van verschillende celtypes, die cruciaal zijn in diagnostische toepassingen kunnen zijn. Globaal, dit is een robuuste methodiek voor de relatieve kwantificering van eiwitten in FFPE monsters en kan gemakkelijk aangepast worden aan pak klinische of onderzoekbehoeften.
De noodzaak om te kwantificeren van eiwitten in formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) biopsie weefselsteekproeven bestaat in veel klinische gebieden. Kwantificering van biomerker eiwitten in routine biopsie exemplaren wordt bijvoorbeeld gebruikt te verhelderen van prognose en behandeling van kanker patiënten1te informeren. Echter, huidige methoden zijn typisch subjectief en gebrek aan validatie.
Immunohistochemistry (IHC) wordt regelmatig gebruikt in laboratoria van de pathologie en over het algemeen hangt een primair antilichaam gericht op het doel-eiwit en een secundair antilichaam geconjugeerd met een enzymatische label zoals horseradish peroxidase2. Conventionele IHC is gevoelig, kan maken gebruik van minuut monsters en behoudt de morfologische integriteit van weefselmonsters zodoende beoordeling van eiwit expressie binnen zijn relevante histologische context mogelijk te maken. Echter, omdat het chromogenic signaal gegenereerd door IHC subtractieve, het lijdt aan een relatief smalle dynamisch bereik en biedt beperkte mogelijkheden voor multiplexing van2,3,4. Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI-MSI) behoudt morfologische integriteit. Echter deze ontwikkelende technologie wordt geassocieerd met bescheiden morfologische resolutie en vereist significante kalibratie en normalisatie, afbreuk te doen aan de haalbaarheid ervan voor klinische routinegebruik5,6,7. Alternatieve technieken te kwantificeren van eiwit in weefselsteekproeven omvatten immunoblotting8, massaspectrometrie9,10,11, en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, elke van die met een gehomogeniseerde begint lysate steekproef weefsel. Primaire weefselsteekproeven zijn heterogene in dat zij een veelheid van soorten cellen bevatten. Daarom, technieken die met zich meebrengen homogenisatie van de monsters niet toegestaan kwantificering van een proteïne in een bepaalde cel bevolking van belang zoals kankercellen.
Zoals IHC, indien van toepassing is op kleine FFPE monsters en het behoud van de integriteit van de histologische13vergunningen. Echter dankzij de additieve aard van fluorescentie signalen, als is vatbaar voor de toepassing van meerdere primaire antilichamen en fluorescerende etiketten. Dus, een proteïne van belang relatief kan worden gekwantificeerd in bepaalde cellen of cellulaire compartimenten (bijvoorbeeld kern versus cytoplasma) gedefinieerd met behulp van andere antistoffen. Fluorescentie signalen hebben ook het voordeel van een groter dynamisch bereik13,14. De superioriteit, de reproduceerbaarheid en de multiplexing potentieel van geweest als toegepast op de FFPE monsters aangetoonde13,14,15.
Hierin beschrijven we het gebruik van kwantitatieve immunoblotting met behulp van bestaande cellijnen als een gouden standaard om na te gaan van de kwantitatieve aard van als in combinatie met de computer-assisted beeldanalyse bij het bepalen van de relatieve overvloed aan een proteïne van belang in histologische secties van FFPE weefselmonsters. Wij hebben deze methode met succes in een multiplex aanpak te kwantificeren biomerker eiwitten in klinische biopsie monsters16,17,18toegepast.
Wij hebben een methode beschreven dat maakt gebruik van kwantitatieve immunoblotting (IB) om aan te tonen het nut van Immunofluorescentie (IF) voor het vaststellen van de relatieve overvloed van een doel-eiwitten in FFPE weefselmonsters. Huidige eiwit kwantificering methoden worden beperkt door hun categorische aard, zoals chromogenic IHC2,3, of door de noodzaak om het homogeniseren van monsters, voorkomen van onderzoek naar de monster-structuur en cel populaties…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Fredrick Banting en Charles Best Canada Graduate beurs (A.M.).
697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |