Nicel immunoblotting ayirt Histoloji formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi bir protein miktarının aracı olarak görüntü analizi ile birleştiğinde doğrulamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bizim sonuçlar biyomarker proteinler rutin biyopsi örneklerinde göreli miktarı ascertaining için ayirt Histoloji yarar gösterilmektedir.
Miktar formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi proteinlerin klinik olarak önemli olduğunu ve araştırma uygulamaları. Miktar bir en iyi yöntem doğrudur, geniş bir doğrusal dinamik alanı vardır ve tek tek hücre tiplerinin tanımlanması için izin vermek için örnek yapısal bütünlüğünü korur. Geçerli yöntemleri immünhistokimya (IHC), kütle spektrometresi ve immunoblotting gibi her kategorik kendi doğası nedeniyle bu hükümleri yerine veya örnek homojenize gerekiyor. Alternatif bir yöntem ayirt (Eğer) ve faiz FFPE dokulara protein göreli bereket belirlemek için görüntü analizi öneriyorum. Burada biz bu yöntemi kolayca optimize edilmiştir, geniş dinamik alan verimleri ve nicel immunoblotting altın standart göre doğrusal olarak ölçülebilir göstermektedir. Ayrıca, bu yöntem örnek yapısal bütünlüğünü bakım izni ve tanılama uygulamalarda çok önemli olabilir çeşitli hücre tiplerinin düzeye çıkarılmasını sağlar. Genel olarak, bu FFPE örneklerinde proteinlerin göreli miktar için sağlam bir yöntemdir ve klinik uygun veya ihtiyaçları araştırma için kolayca adapte edilebilir.
Proteinler formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku biyopsisi örneklerinde ölçmek için gereken birçok klinik alanda bulunmaktadır. Örneğin, miktar rutin biyopsi örnekleri biyomarker proteinlerin prognoz aydınlatmak ve tedavi kanser hastaları1için bilgilendirmek için kullanılır. Ancak, geçerli yöntemleri genellikle öznel ve doğrulama eksikliği.
İmmünhistokimya (IHC) patoloji laboratuvarlarında rutin olarak kullanılan ve genellikle birincil bir antikor hedef protein yönetmen ve horseradish peroksidaz2gibi enzimatik bir etiketi ile Birleşik bir ikincil antikor bağlıdır. Geleneksel IHC duyarlıdır, yapabilirsiniz dakika kullanımı örnekleri ve dolayısıyla protein ifade ile ilgili histolojik bağlamı içinde değerlendirilmesi erişimine izin verme doku örnekleri morfolojik bütünlüğünü korur. Ancak, IHC tarafından oluşturulan chromogenic sinyal Eksiltici olduğundan, nispeten dar Dinamik Aralık uğrar ve2,3,4çoğullama için sınırlı potansiyel sunmaktadır. Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi (MALDI-MSI) görüntüleme morfolojik bütünlüğünü korur. Ancak, gelişmekte olan bu teknoloji mütevazı morfolojik çözünürlük ile ilişkilidir ve önemli kalibrasyon ve normalleştirme, onun fizibilite rutin klinik kullanım5,6,7için kararlar almanı gerektirir. İmmunoblotting8, kütle spektrometresi9,10,11ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA)12, doku örnekleri protein ölçmek için alternatif teknikleri dahil her homojenize ile başladığı, örnek doku lysate. Birincil doku örnekleri türdeş olmayan çok sayıda hücre türleri içerdikleri vardır. Bu nedenle, homojenizasyon örnekleri gerektirecektir teknikleri bir protein miktar kanser hücreleri gibi ilgi belirli hücre nüfus izin vermez.
IHC, olsa gibi küçük ve ilgili FFPE örnekleri ve histolojik bütünlük13tutma izin verir. Ancak, floresan sinyallerini, katkı doğaya teşekkür Eğer birden çok birincil antikorlar ve floresan etiket uygulamaya müsait değil. Böylece, bir protein ilgi nispeten belirli hücreleri veya hücresel kompartmanlarda (örneğin, çekirdek karşı sitoplazma) diğer antikorları kullanılarak tanımlanmış içinde sayısal. Floresan sinyallerini de büyük bir Dinamik Aralık13,14avantajı var. Üstünlük, tekrarlanabilirlik ve çoğullama potansiyelini gösterdiği13,14,15FFPE örnekler için uygulanan olmuştur.
Burada nicel immunoblotting ilgi bir protein göreli bolluk belirlemede bilgisayar destekli görüntü analizi ile birleştiğinde nicel doğası tespit için altın standart olarak kurulan hücre hatları kullanarak nasıl kullanılacağını açıklar FFPE doku örnekleri histolojik bölümlerden. Bu yöntemde biyomarker proteinler klinik biyopsi örnekleri16,17,18ölçmek için çok katmanlı bir yaklaşım başarıyla uygulamış.
Bir yöntem tarif var nicel immunoblotting (IB) ayirt (Eğer) yardımcı programı göstermek için bir hedef protein FFPE doku örneklerinde göreli bolluk ascertaining için yararlandığına. Geçerli protein miktar yöntemleri chromogenic IHC2,3gibi kategorik doğaları gereği veya örnekleri gibi örnek nüfus yapısı ve hücre içine soruşturma önlenmesi, homojenize gerektiğinden sınırlıdır IB ve kütle spektrometresi8,…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser kısmen Fredrick Banting ve Charles en iyi Kanada Yüksek Lisans Bursu (A.M.) tarafından finanse edildi.
697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |