Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forberedelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af kemiske tørring til morfologisk analyse i Scanning elektronmikroskopi (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM analyse er en effektiv metode til at støtte i identifikation af arter eller fænotypiske forskelsbehandling. Denne protokol beskriver metoder til at undersøge specifikke morfologiske oplysninger for tre repræsentative typer af organismer og ville gælde generelt at undersøge egenskaber i mange kropsligt og vævstyper.

Abstract

Scanning elektronmikroskopi (SEM) er et almindeligt tilgængelige teknik, der er blevet anvendt til at undersøge biologiske enheder spænder fra individuelle proteiner til celler, væv, organeller og endda hele organismer. Denne protokol fokuserer på to kemiske tørring metoder, hexamethyldisilazane (HMDS) og Thomsen-butyl alkohol (TBA) og deres anvendelse til billeddannelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af SEM. I denne artikel vil vi beskrive hvordan man fix, vaske, dehydrere, tørre, montere, sputter frakke og image tre typer af organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. og en ukendt sp.), to euglenoids fra slægten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og bananfluen (Drosophila melanogaster). Formålet med denne protokol er at beskrive en hurtig, billig og enkel metode til at få detaljerede oplysninger om struktur, størrelse og overfladekarakteristika for enheder, der kan anvendes bredt på en lang række organismer til morfologiske vurdering. Vellykket gennemførelse af denne protokol vil tillade andre at bruge SEM for at visualisere prøver ved at anvende disse teknikker på deres system.

Introduction

En scanning elektron mikroskop (SEM) bruger en fokuseret stråle af højenergi elektroner til at generere et billede fra sekundære elektroner, der viser morfologi og topografi af en prøve1. SEM kan bruges til direkte bestemme den fysiske størrelse af en prøve, overfladestruktur, og tre-dimensionelle form, og tilbyder højere opløsning og større dybdeskarphed i forhold til lysmikroskopi. En anden form for elektronmikroskopi (EM), transmissions elektronmikroskopi (TEM) bruger fokuseret elektroner, der passerer gennem prøven, generere billeder med fine detaljer af interne struktur. Mens TEM har højere opløsning end lys eller SEM og kan bruges til at løse strukturer så lille som enkelt atomer, det har tre store ulemper: omfattende prøveforberedelse, et mindre synsfelt og lavvandede dybde af feltet2,3. Selv om andre visualiseret protokoller findes ved hjælp af SEM for at undersøge specifikke celler, organeller eller væv4,5,6,7,8,9, 10 , denne protokol er unik, idet vi beskriver metoder, der kan anvendes bredt på en lang række organismer til morfologiske vurdering.

SEM har fundet bred programmer for behandlingen af uorganiske materialer herunder nanopartikler11,12, polymerer13og talrige anvendelser i geologiske, industrielle og materielle sciences14, 15,16. I biologi, har SEM længe været brugt som en metode til at undersøge biologiske prøver spænder fra individuelle proteiner til hele organismer17,18. SEM er af ganske særlig værdi fordi morfologiske overflade detaljer kan bruges til at informere videnskabelig opdagelse. SEM analyse er en hurtig, billig og enkel metode til at få detaljerede oplysninger om struktur, størrelse og overfladekarakteristika for en bred vifte af biologiske prøver.

Fordi en SEM normalt opererer under højt vakuum (10-6 Torr minimum) til at støtte en sammenhængende stråle af højhastighedstog elektroner, er ingen væsker (vand, alkoholer, olier) tilladt i prøve salen, da væsker forhindrer, at et vakuum formning. Således skal alle prøver undersøgt ved hjælp af SEM være dehydreret, typisk ved hjælp af en gradueret ethanol serie efterfulgt af en tørringsproces fjerne ethanol. Der er flere metoder til tørring biologiske væv til brug i SEM, herunder lufttørring, ingot, brug af et kritisk punkt tørring (CPD) enhed, eller kemiske tørring ved hjælp af Thomsen-butyl alkohol (TBA) eller hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. oftest, udvælgelse af en tørring metode er empiriske da hver biologisk prøve kan reagere forskelligt på hver tørring metode. For enhver given prøve, kan alle disse metoder være passende, så sammenligne fordele og ulemper ved hver er nyttige i at vælge den relevante metode.

Mens lufttørring en prøve ved stuetemperatur eller i et varmeskab (60 ° C) er den enkleste metode, de fleste biologiske prøver viser tørring-induceret skade som shriveling og sammenbrud, medfører forvridning af modellen. Processen med ingot også fjerner vand (eller is) fra en prøve, men kræver prøver at være flash-frosset og placeret under vakuum til at fjerne is via processen af sublimering, potentielt skadelige prøven. Derudover skal brugeren have adgang til en lyophilizer. Den hyppigst anvendte metode til tørring prøver for SEM er kritiske punkt tørring (CPD). I CPD, er ethanol i en stikprøve erstattet med flydende kuldioxid (CO2) og under specifikke temperatur og trykforholdene kendt som det kritiske punkt-(31,1 ° C og 1.073 psi), CO-2 fordamper uden at skabe overfladespænding, hvorved effektivt fastholde de morfologiske og strukturelle elementer i prøven. Mens CPD er generelt den standardmetode, har det flere ulemper. Først, processen kræver adgang til et kritisk punkt tørretumbler, der er ikke kun dyre, men også kræver anvendelsen af flydende kuldioxid. Andet, størrelsen af den prøve, der kan tørres er begrænset til størrelsen afdeling af det kritiske punkt tørretumbler. Tredje, udvekslingen af væsker under CPD kan forårsage uro, der kan skade prøven.

Kemiske tørring tilbyder mange fordele i forhold til CPD og fungerer som et egnet alternativ, der er ved at blive udbredt i SEM prøveforberedelse. Brugen af kemiske dehydrants såsom TBA og HMDS tilbyder en hurtig, billig og enkel alternativ til andre metoder, mens den stadig vedholdt den strukturelle integritet af prøven. Vi viste for nylig, at der var ingen forskel i integriteten af væv eller kvaliteten af det endelige billede fanget ved brug af CPD eller TBA som tørring metode i voksen Drosophila retinale væv23. I modsætning til CPD, TBA og HMDS kræver ikke en tørring instrument eller flydende CO2 og der er ingen begrænsning på størrelsen af prøven tørres. Ud over at opnå kemikalierne, er kun en standard kemisk stinkskab og passende personlige værnemidler (handsker, laboratoriekittel og beskyttelsesbriller) kræves for at fuldføre tørringsprocessen. Mens både TBA og HMDS er brandfarlige, TBA er mindre giftige og billigere (ca. 1/3 udgifterne til HMDS) end HMDS.

I denne artikel vil vi beskrive hvordan man fix, vaske, dehydrere, tørre, montere, sputter frakke og image tre typer af organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. og en ukendt sp.), to euglenoids fra slægten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og bananfluen (Drosophila melanogaster). Disse organismer repræsenterer en bred vifte i størrelse (0,5 µm til 4 mm) og cellulære mangfoldighed (encellede til flercellede), men alle er let indstillet til SEM analyse med kun små variationer til prøvepræparation. Denne protokol beskriver metoder til at bruge kemiske dehydrering og SEM analyse for at undersøge morfologiske oplysninger om tre typer af organismer og ville gælde generelt at undersøge mange kropsligt og vævstyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse og fiksering

  1. Forberede cyanobakterier.
    1. Vokse unialgal kulturer i F/2 medier24,25 ved en temperatur på 28 ° C på en 14:10 h lys mørke cyklus. Overføre tilstrækkelig kultur til en 1,5 mL microcentrifuge tube, sådan, at efter at tillade 15 min at bosætte sig, den bakterielle pellet er ca. 0,05 mL i størrelse. Fjerne medier og erstatte med 1,5 mL af fiksativ (1,25% glutaraldehyd, 0,1 M fosfat buffer pH 7,0), forsigtigt vendes flere gange, og der inkuberes natten over ved 4 ° C.
    2. Overføre de faste celler med et glas afpipetteres i en 10 mL filtrering rig (figur 1) indeholder en polycarbonat 25 mm filter med 0,8 eller 0,2 µm porer, afhængigt af størrelsen på cellerne. Forsegle side arm og tragt med gummipropper indeholder kultur i tragten. Fjerne fiksativ af blid støvsuger på kolben filtrering efter fjernelse af begge propper.
      Bemærk: Hvis den celle tæthed på polycarbonat-filter ikke er optimal, justere mængden af begyndende kultur anvendes.
  2. Forberede enkelt celle alger (euglenoids).
    1. Vokse unialgal kulturer i AF-6 media26 med 150 mL L-1 kommercielt tilgængelige jordvand medium føjet til media, ved en temperatur på 22 ° C på en 14:10 h lys mørke cyklus. 2 ml af lav densitet (OD600 < 0.5) kultur med et glas afpipetteres i en 10 mL filtrering rig (figur 1) indeholder en polycarbonat 25 mm filter med 8 µm porer. Forsegle side arm og tragt med gummipropper indeholder kultur i tragten.
      Bemærk: Hvis den celle tæthed på polycarbonat-filter ikke er optimal, justere mængden af begyndende kultur anvendes.
    2. Tilføj tre dråber 4% osmium dinitrogentetraoxid (OsO4) direkte til kulturen og tillade for at udruge for 30 min. Fjern fiksativ af blid støvsuger på kolben filtrering efter fjernelse af begge propper.
      Bemærk: OsO4 er en akut toksin (dermal, oral og indånding ruter), ætsende på huden, skadelige for øjnene, og en respiratorisk sensibiliserende. OsO4 skal håndteres i en kemisk stinkskab ved hjælp af passende personlige værnemidler, herunder handsker, laboratoriekittel og øjenbeskyttelse.
  3. Forberede Drosophila melanogaster (bananfluen)23.
    1. Bedøver voksne fluer ved hjælp af 100% kuldioxid. Sted bedøvede voksne (omkring 10 til 30 fluer) i et lille plastik skruelåg hætteglas eller 1,5 mL centrifugeglas.
    2. Fordyb bedøvede fluer i 1 mL af fiksativ (1,25% glutaraldehyd, 0,1 M fosfat buffer pH 7,2) i 2 timer (eller natten over) ved 4 ° C. Hvis fluerne flyder på overfladen af fiksativ, tilføje et par dråber af 2,5% polyethylen glycol tert-octylphenyl ether at svække overfladespænding af fiksativ giver mulighed for total neddykning af væv. Fjerne fiksativ ved hjælp af et glas pipette.

2. vask og dehydrering

  1. Vask og dehydrere cyanobakterier.
    1. Vaske den faste prøve tre gange med 5 mL af 0,1 M fosfat buffer pH 7,0 ved stuetemperatur i 10 min. Holde kolbe og tragt med proplåg for at holde vask. Fjern hver vask af blid støvsuger på kolben filtrering efter fjernelse af begge propper.
    2. Dehydrere prøven samtidig opretholde løbende fordybelse ved hjælp af en gradueret ethanol serie, for 10 min i et volumen på 5 mL i tragten. De sorterede ethanol koncentrationer er: 25%, 50%, 75%, 95% og 2 ændringer af 100% ethanol. Holde kolbe og tragt med proplåg indeholder ethanol i tragten, forebygge tab både via fordampning og passive flow gennem filteret.
    3. Fjerne ethanol af blid støvsuger på kolben filtrering efter fjernelse af begge propper. Overføre filter/prøve til en engangs aluminium vejer parabol indeholdende lige nok 100% ethanol for at dække prøven før tørring.
  2. Vask og dehydrere enkelt celle alger (euglenoids).
    1. Vaske den faste prøve tre gange med 5 mL deioniseret vand ved stuetemperatur i 10 min. Holde kolbe og tragt med proplåg indeholder vask i tragten. Fjern hver vask af blid støvsuger på kolben filtrering efter fjernelse af begge propper.
    2. Dehydrere prøven samtidig opretholde løbende fordybelse ved hjælp af en gradueret ethanol serie i 10 min i et volumen på 5 mL i tragten. De sorterede ethanol koncentrationer er: 25%, 50%, 75%, 95% og 2 ændringer af 100% ethanol. Holde kolbe og tragt med proplåg indeholder ethanol i tragten, forebygge tab både via fordampning og passive flow gennem filteret.
    3. Fjerne ethanol af blid støvsuger på kolben filtrering efter fjernelse af begge propper. Overføre filter/prøve til en engangs aluminium vejer parabol indeholdende lige nok 100% ethanol for at dække prøven før tørring.
  3. Vask og dehydrere Drosophila melanogaster (bananfluen).
    1. Vaske den faste prøve tre gange med 1 mL af 0,1 M fosfat buffer pH 7,2 ved stuetemperatur i 10 min i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Fjern hver vask med et glas pipette, være omhyggelig med ikke at fjerne fluer.
    2. Dehydrere prøven ved hjælp af en gradueret ethanol serie, for 10 min i et volumen på 1 mL i et mikrofuge rør. Ethanol koncentrationer er: 25%, 50%, 75%, 80%, 95% og 100%. Fjerne ethanol med glas pipette, være omhyggelig med ikke at fjerne fluer.
    3. Bevare prøven i 1,5 mL microcentrifuge rør med lige nok 100% ethanol til at dække prøven før tørring.

3. tørring

  1. Udføre kemiske tørring ved hjælp af Thomsen-butyl alkohol (TBA)27.
    1. Erstat 100% ethanol opløsning med en 1:1 løsning TBA og 100% ethanol i 20 min. Erstat 1:1 løsning med 100% TBA for 20 min. Gentag to gange. Holde løsningen ved 37 ° C, så TBA ikke fryse.
      Bemærk: 100% TBA har en frysepunkt på 25,5 ° C; 1:1 opløsning vil ikke fryse ved stuetemperatur. TBA er brandfarligt, forårsager alvorlige øjenirritation, er skadelige, indånding og kan forårsage respiratorisk irritation, sløvhed eller svimmelhed. TBA skal håndteres i en kemisk stinkskab ved hjælp af passende personlige værnemidler, herunder handsker, laboratoriekittel og øjenbeskyttelse.
    2. Overføre prøven i TBA, hvis i en 1,5 mL microcentrifuge rør, til en engangs aluminium vejer parabol. En gang i aluminium vejer parabol, fjerne TBA og erstatte med lige nok friske 100% TBA til dækning af prøven. Fryse TBA ved 4 ° C i 10 min.
    3. Overfør til et vakuum Ekssikator (bell jar) med frosne gelpakninger at holde TBA frosset. Evakuere og opretholde vakuum med en roterende pumpe til at tillade prøve at tørre af vakuum sublimering af den frosne TBA i mindst 3 timer eller natten over.
  2. Udføre kemiske tørring ved hjælp af hexamethyldisilazane (HMDS)20.
    1. Erstat 100% ethanol opløsning med en 1:2 løsning af HMDS og 100% ethanol i 20 min. erstatte 1:2 løsning med et 2:1 løsning af HMDS og 100% ethanol i 20 min. Erstat 2:1 løsning med 100% HMDS i 20 min. Gentag én gang.
      Bemærk: HMDS er brandfarlige og en akut toksin (dermal rute). HMDS skal håndteres i en kemisk stinkskab ved hjælp af passende personlige værnemidler, herunder handsker, laboratoriekittel og øjenbeskyttelse.
    2. Overføre prøven i HMDS, hvis i en 1,5 mL microcentrifuge rør, til en engangs aluminium vejer parabol. Når i aluminium vejer parabol, erstatte 100% HMDS med lige nok friske 100% HMDS til dækning af prøven.
    3. Overføre prøven til et plast eller glas ikke-vakuum ekssikkator med friske tørremiddel (5-6 cm dyb) og sted ind i en kemisk stinkskab. Alternativt, prøven anbringes direkte i en kemisk stinkskab tørre med løst låg, som en kasse, og at undgå snavs falder på prøve. Tillad prøven tørre i 12 til 24 h.

4. montering

  1. Mount cyanobakterier og euglenoids.
    1. Label i bunden af enten en 12 eller 25 mm aluminium montering stub for at angive, hvad der lægges på toppen. Skær polycarbonat-filter med tørrede celler i kvarte med en ren barberblad eller skalpel, hvis bruger en 12 mm stub, eller placere hele filteret hvis bruger påbegyndt 25 mm.
    2. Placer hvert filter på lim eller en carbon klæbende fane fastgjort til toppen af en stub.
  2. Montere Drosophila melanogaster (bananfluen).
    1. Mærke nederst i aluminium montering stub til at angive, hvad der lægges på toppen.
      Læg de tørrede fluer i den ønskede position på lim eller carbon klæbende fanen fastgjort til toppen af påbegyndt under et dissekere mikroskop med præcision pincet.
    2. Anvende sølv ledende lim, dvs., sølv maling, omkring de ydre kanter af stubbe. Tilslut den sølv maling til fluerne bruge en tandstikker til at sikre ledningsevne. Tillad ikke maling til at røre den ønskede billeddiagnostiske område.
    3. Placerer stubbe i en stub indehaveren og Placer boksen åben stub indehaveren i en ekssikkator. Tillad sølv malingen til at tørre i mindst 3 timer eller natten over for de bedste resultater.

5. sputter belægning

  1. Forberede sputter belægning apparater ved at udføre fire til fem tømninger af argon gas. Hvis luftfugtigheden er høj (dvs. rumluften føles fugtig, normalt omkring 50% relativ luftfugtighed), udføre seks til syv flushes. Sputter pels stubs efter fabrikantens anvisninger.
  2. Frakke prøver baseret på modellen anvendes:
    1. Til filtre med cyanobakterier, indstille timeren at sputter frakke til 180 s lige på.
    2. Til filtre med eukaryote alger indstille dvs., euglenoids, timeren at sputter frakke til 120 s lige på, så 20 s på tre sider i en 45 ° vinkel.
    3. For store stikprøver indstille dvs, flyve hoveder, timeren at sputter frakke til 60 s lige på, så 30 s på hver side i en 45 ° vinkel.
      Bemærk: Når belægningen er fuldført, stubbe skal være lys grå i farven.

6. billedbehandling

  1. Billede prøver ved hjælp af en scanning elektron mikroskop, der indeholder en sekundær elektron (SE) detektor.
    1. For cyanobakterier, gælder følgende indstillinger: 3-5 kV accelerator spænding (AC), 20-30 sonde nuværende (PC), og 5 mm arbejde afstand (WD). For euglenoids, brug 3 kV AC, 30 PC og 5 mm WD. For fluer, bruge 5 kV AC, 30 PC, og 5-10 mm WD.
  2. Justere forstørrelse afhængigt af størrelsen af detaljer eller objekt, der skal visualiseres. Justere stigmators, åbninger og fokus, indtil et klart billede er produceret. Fange billedet med høj opløsning indstillinger i overensstemmelse med producentens anvisninger af SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cyanobakterier er en prokaryot gruppe af organismer, der er afgørende for de globale kulstof, ilt og kvælstof cyklusser28,29. Af anslået 6000 arter af cyanobakterier30har mest en slimet kappe, der dækker og forbinde cellerne sammen og til andre strukturer31, som sammen med figuren, kan blive løst mikroskopisk32. Cellestørrelse, form og pigmenter nuværende skelne enkelte arter og i akvatiske naturtyper, kan visualiseres som cyanobakteriel "blomstrer"28. Den moderne cyanobakteriel klassificering kombinerer alle morfologiske træk mulig brug af lysmikroskopi, TEM, SEM, samt og molekylære data33. Lig planteslim kappe af cyanobakterier, halvgennemsigtigt strimler af euglenoid arter støtte i fylogeni bestemmelse. Euglenoids er akvatiske flagellater, som besidder en stor del af morfologiske og adfærdsmæssige mangfoldighed, og SEM analyse har vist sig nyttig i klassificering af forskellige arter. Specifikt, besidder euglenoids roman strukturer under deres plasma membran, der består af parallelle proteinholdige strimler og mikrotubuli, kaldet halvgennemsigtigt34,35,36. Nummer, indretning og størrelse af halvgennemsigtigt strimler er kritiske morfologiske komparatorer, og sammen med molekylær fylogenetiske data, der bruges til at konstruere fylogeni for Euglenozoa37.

Det første skridt i udarbejdelsen af både cyanobakterier og euglenoids kræver filtrering organismer fra deres vækstmediet og opnås ved at samle en filtrering rig (figur 1A). Aspiration er brugt til at trække mediet gennem et polycarbonat-filter, forlader organismerne på overfladen af filteret. Porestørrelse af polycarbonat-filter skal vælges således, at de intakte organismer ikke vil passere gennem (Sammenlign figur 1B og 1 C). Figur 2 viser repræsentative resultater af tre forskellige slægter af cyanobakterier. To er ferskvand og en er marine. Nærmere oplysninger om den celle, herunder form og tekstur af overfladen er synlig, samt en kappe af planteslim eller fremskrivninger fra cellerne. Figur 3 illustrerer, hvordan SEM bruges til at visualisere halvgennemsigtigt strimler af to forskellige euglenoid arter. Den heliske arrangement af halvgennemsigtigt strimler at fusionere på den bageste ende til at danne en hale støtte i fylogeni bestemmelse, når man sammenligner Monomorphina aenigmatica (figur 3A og 3B) med Monomorphina pseudopyrum ( Figur 3 c og 3D).

Ud over morfologiske karakteristika, at identificerer arter, kan ydre morfologi af modelorganismer såsom Drosophila melanogaster bruges til at identificere genetiske modifikatorer bruger fotoreceptorer neuroner, der omfatter sammensat Drosophila eye38. Da øjet er en ikke-væsentlige væv i fluer, er det muligt at udtrykke toksiske proteiner i retinale celler og bruge SEM til at undersøge de morfologiske ændringer, som genetisk modifikation har på øjet. Normale flue øjne er karakteriseret af en bestilt vifte af børster og linser (figur 4A), men udtryk for proteiner er forbundet med Alzheimers sygdom skabe hvad der kaldes "ru eye" fænotype (figur 4B). Gener, der undertrykker (figur 4 c) eller forbedre (figur 4D) ru øje fænotype kan spille en fysiologisk rolle i sygdomsprogression og har potentiale for drug målretning39. Også vist i figur 4 er eksempler på potentielle faldgruber for at undgå, herunder et eksempel på den skjulte struktur i øjet fra forkert tørring teknik (figur 4E) og elektron opladning fra utilstrækkelig sputter belægning, der vises under billede erhvervelse (figur 4F og 4 G).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk fremstilling af filtrering rig og SEM af et polycarbonat-filter. (A) dette apparat bruges til at adskille små eller enkelt encellede organismer som cyanobakterier og euglenoids fra deres vækstmedium. Anvendelsen af et vakuum på side arm kolben vil trække indholdet af tragten gennem polycarbonat-filter og ind i bunden af filtrering kolben, forlader organismerne på overfladen af filteret. (B) SEM af en 0,8 µm pore filter med ingen prøve som prøven var tabt på grund af forkert håndtering. Skalalinjen = 20 µm. (C) SEM af en 0,8 µm pore filter med cyanobakterier stede. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : SEM Mikrograf af cyanobakterier. (A, B) Toxifilum mysidocida, et trådet ferskvand arter fra Colorado med en synlig kappe af planteslim (M). Skalere barer = 5 µm. (C, D) A ferskvands Golenkina sp. fra Ohio. Enkelte celler undertiden form kolonier holdt sammen af et tyndt lag af planteslim (M). Glødetrådens-lignende fremspring (hvide pile) udvide til de individuelle celler. Skalere barer = 10 µm. (E, F) ukendt trådformede arter fra en høj saltholdighed udmunding i Texas kystfarvande. Enkelte celle (sort pil) og dividere celler (hvide pilespidser) er synlige. Skalalinjen i panelet E = 2 µm. skalalinjen i panelet F = 1 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : SEM Mikrograf af halvgennemsigtigt strimler fra to arter af euglenoids. (A, B) Monomorphina aenigmatica. (A) lav forstørrelse billeder af hele cellen. Skalalinjen = 5 µm. (B) høj forstørrelse af den bagerste ende. Skalalinjen = 3 µm. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. (C) lav forstørrelse billeder af hele cellen. Skalalinjen = 10 µm. (D) høj forstørrelse af den bagerste ende. Skalalinjen = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : SEM analyse af fænotypiske ændring af Drosophila øje. I forhold til den normale ydre fremtræden af den bestilte vifte af børster og linser af flyve øjet (A), forårsager udtryk for giftigt protein tau død af fotoreceptor neuroner, generere "ru eye" fænotype (B). Udtryk for genetisk modificering, der enten undertrykker (C) eller forbedre (D) tau ru øjet giver bevis for, at gener, der kan spille en rolle i tau neurotoksicitet. Forkert teknik under tørringen trin kan føre til et sammenbrud af strukturen i øjet (E), mens utilstrækkelig belægning af prøven vil medføre opkrævning, der vises som enten en hvid (F) eller sort (G) band under image erhvervelse, som det fremgår af pilen. Skalalinjen = 400 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrev vi en protokol bruger SEM for at indhente detaljerede oplysninger om eksterne morfologiske karakteristika af tre typer af organismer, som andre kan anvende til at undersøge funktioner af mange typer af organismer eller væv. Inden for hvert enkelt trin i protokollen er der potentielle point af fejl, der måtte opstå og diskuteres i detaljer nedenfor.

Mens diskenheder for fiksativ og vasker givet her er specifikke, bør generelt fiksativ og vasker være 5-10 x volumen af prøven. Alle fiksering, vask og dehydrering gange er baseret på vores erfaringer, hvis der opstår problemer, fx shriveling i eksemplet, skal du øge gange på hvert trin af tørring eller tørring. Afhængigt af din enkelt celle prøve skal du gøre både en glutaraldehyd fiksering og en efter fiksering i osmium dinitrogentetraoxid. Hvis en duel fiksering er nødvendig efter trin 1.1.2 forretningsorden cyanobakterier dække med en lige mængde 2% OsO4 i den samme buffer og fortsætte fra trin 1.2.2 af proceduren med én celle. Fra arbejde ikke vist her, har vi fundet at Drosophila kan enten placeres direkte i Fikseringsvæske følgende anesthetization eller kan indefryses på ubestemt tid på-20 ° C i et mikrofuge rør og placeres i fiksativ på et senere tidspunkt med ingen forskel i færdig billedkvalitet.

Under vask og dehydrering trin er det bydende nødvendigt at bevæge sig gennem sorterede ethanol-serien langsomt og uden at springe et kendt koncentration. Hvis prøverne er dehydreret for hurtigt, det negativt påvirker de underliggende strukturelle komponenter i vævet, og modellen vil visne, visne, eller skjule. Et eksempel på væv sammenbrud er vist i figur 4E. Desuden, for at forhindre indførelsen af artefakter som sammenklumpning og udfladning af morfologiske træk, er det kritisk at forlade bare nok ethanol for at dække prøven mellem trin under dehydrering og tørring.

Når du bruger filtrering riggen, vil en dråbe vand på basen holde filteret på plads ved montering. Også filteret skal placeres med den blanke side op og alle væsker skal være tilføjet forsigtigt, være omhyggelig med at håndtere filter med omhu for at forhindre, at vaske væk prøven. Selv om vi har fundet resultaterne af tørring ved hjælp af enten HMDS eller TBA for at være af samme kvalitet, vi anbefaler at bruge TBA: mens både HMDS og TBA er brandfarlige, TBA er omkring en tredjedel af omkostninger og mindre giftige end HMDS.

Under montering når ved hjælp af sølv ledende lim (også kaldet sølv maling), være forsigtig, når du anvender som din prøve kan nemt dækkes (begravet) i malingen, tilsløre dermed fine detaljer i morfologi. Sputter belægning gange kan variere baseret på din prøve, og her-værdier er baseret på vores erfaringer. Én potentielle negative resultat af utilstrækkelige sputter belægning er et fænomen kaldet opladning, der ofte vises som en hvid eller sort linje (undertiden en flash) i det endelige billede (Se figur 4F og G eksempler). Hvis mængden af opladning observerede er minimal, kan det være muligt at afbøde virkningerne ved at justere forskellige mikroskop parametre, såsom sænkning den accelererende spænding eller fjernlys aktuelle, øge kondensator linse styrke, og/eller ved hjælp af en mindre objektive blænde. De fleste SEMs anvendt til biologiske prøver har sekundære elektron detektorer, men nogle SEMs kan også udstyres med tilbagekastning detektorer eller miljømæssige sekundære elektron detektorer, som alle kan justeres for at mindske eller eliminere virkningerne af minimal opladning. Hvis opladningen virkningerne er mere udtalte, er det sandsynligt, at der er fattige jordforbindelse af prøven eller for lidt sputter belægning for at producere sekundære elektroner, forårsager de ladede elektroner til at bygge i overensstemmelse med modellen og frigives spontant, der producerer forvrængning i billedet under erhvervelse. Udtalt opladning er oftest løst med en tykkere belægning eller bedre jordforbindelse med sølv maling. Fordi både for meget og for lidt sputter belægning kan negativ indflydelse på kvaliteten af billedet, er det bedst at optimere mængden af anvendte ved at justere variabler tid belægning (10 til 180 s) og tryk (70-150 mTorr) af sputter coater at opnå en optim Al belægning. Da belægningen ikke kan fjernes en gang anvendt til prøven, anbefales en prøvekørsel med en enkelt prøve inden belægning alle prøverne.

SEM parametre såsom fremskynde spænding (i kV), sonde nuværende (PC), og arbejde afstand (WD) skal justeres for at få det bedste billede muligt, som indstillingerne for givet her er foreslået start parametre baseret på vores erfaringer. Mens kvaliteten af prøven er afhængige af pleje taget i forberedelse, kvaliteten af det endelige billede er afhængig af den erfaring og dygtighed af operatoren SEM. Derfor anbefaler vi arbejder med en SEM tekniker eller tilbringe tid på at udvikle din egen SEM færdigheder. Alle data (herunder forberedelse af prøver og imaging) vist i dette papir blev genereret af bachelorstuderende i biologi mikroskopi program på CMU, med vejledning fra fakultetet og vores mikroskopi tekniker.

De protokoller er beskrevet her omfatter brugen af potentielt skadelige kemikalier, og de relevante sikkerhedsforanstaltninger bør altid overholdes for at beskytte brugerne, især studerende, der kan håndtering af disse kemikalier. Mens protokollerne angiver sikkerhed bekymringer forbundet med hvert kemikalie ved første brug, brugere bør altid: (1) bruge en kemisk stinkskab, (2) har adgang til en nødsituation øje vask og sikkerhed brusebad, (3) bruge relevante personlige værnemidler herunder nitrilhandsker, laboratoriekittel og øjet beskyttelse, og (4) ved hvor man kan finde skriftlige sikkerhedsprocedurer inklusive håndtering, udpeget bruge områder, spill procedurer, rensningsprocesser, og affald bortskaffelse procedurer.

Afslutningsvis, illustrere disse organismer, hvordan oplysninger om tre-dimensionelle topografi af udvendige flader af hver er nyttige om fylogenetiske gruppering eller modifier analyse. Cyanobakterier funktioner bestemmes fra SEM kan bruges i kombination med supplerende data fra lysmikroskopi, TEM, og molekylære undersøgelser for at identificere, karakterisere, og navngiv cyanobakterier. For euglenoids, antal, bredde, arrangement (spiralformet eller lige), og ornamentik, hvis tilstede, af halvgennemsigtigt strimler kan bruges med andre morfologiske data, og hvis nødvendigt molekylære data, til at identificere, karakterisere, og navnet euglenoids. Desuden, andre typer af encellede alger og protozoer eller mikro-hvirvelløse dyr kan forberedes og undersøgt på en lignende måde at bestemme eksterne morfologiske funktioner såsom flageller, fodring struktur, ekstern udsmykning eller detaljer af vedhæng i tilfælde af mikro-hvirvelløse dyr. Endelig, SEM har bredt programmer for behandlingen morfologiske detaljer, som øjet af modelsystem Drosophila, at karakterisere genetisk modificering af sygdom patologi. De protokoller er beskrevet her udnytte organismer, der varierer meget med hensyn til kompleksitet, men alle er indstillet til SEM analyse til at indsamle nyttige morfologiske oplysninger, der er afgørende for videnskabelig opdagelse, der spænder over mange forskellige subdisciplines af biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af et tilskud til MLS og en sommer Scholar Award til MAK fra Office for forskning og studier ved Central Michigan University. Cyanobakterier blev leveret af Zimba og plankton lab, en del af Center for kystnære undersøgelser, Texas A & M University i Corpus Christi. Euglenoids blev leveret af Triemer lab, Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

Biologi spørgsmålet 143 Scanning elektronmikroskopi (SEM) cyanobakterier euglenoid frugtflue Drosophila kritiske punkt tørring (CPD) hexamethyldisilazane (HMDS) Thomsen-butyl alkohol (TBA)
Forberedelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af kemiske tørring til morfologisk analyse i Scanning elektronmikroskopi (SEM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter