Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Подготовка прокариот и эукариот организмов, с использованием химических сушки для морфологического анализа в растровая электронная микроскопия (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM анализ является эффективным методом для помощи в идентификации видов или фенотипические дискриминации. Этот протокол описывает методы для изучения морфологические особенности трех представительных видов организмов и будет широко применяться для изучения особенностей многие научные и типы тканей.

Abstract

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) является метод широко доступны, который был применен для изучения биологических образцов, начиная от индивидуальных белков клеток, тканей, органеллы, и даже целые организмы. Этот протокол фокусируется на двух химических методов сушки, Гексаметилдисилазан (ГМДО) и t бутиловый спирт (TBA) и их применение к визуализации прокариот и эукариот организмов, используя SEM. В этой статье мы опишем, как исправить, мыть, обезвоживанию, сухой, монтировать, распыления Пальто и изображения трех видов организмов: цианобактерий (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. и неизвестных sp.), два euglenoids из рода Monomorphina (М. aenigmatica и м. pseudopyrum) и плодовой мушки (Drosophila melanogaster). Цель настоящего Протокола заключается в быстрый, недорогой и простой способ для получения подробной информации о структуре, размер и характеристики поверхности образцов, которые могут широко применяться для широкого спектра видов организмов для описания морфологической оценки. Успешное завершение этого протокола позволит другим пользователям использовать SEM для визуализации образцы, применяя эти методы для их системы.

Introduction

Сканирующий электронный микроскоп (SEM) использует фокусированный луч электронов для создания изображения из вторичных электронов, которые показывает, морфология и топографии образца1. SEM может использоваться непосредственно определить физический размер выборки, структура поверхности и трехмерную форму, и предлагает большее разрешение и более высокой глубине резкости по сравнению с световой микроскопии. Еще одной формой электронной микроскопии (EM), просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) использует целенаправленный электронов, которые проходят через образец, генерации изображения с мелких деталей внутренней структуры. ТЕА имеет высокое разрешение, чем свет или SEM и может быть использован для разрешения структуры как единого атомов, у него есть три основных недостатка: обширные пробоподготовки, небольшое поле зрения и глубине поля2,3. Хотя другие визуализирована протоколы существуют с помощью SEM для изучения конкретных ячеек, органеллы или ткани4,5,6,7,8,9, 10 , этот протокол является уникальным в том, что мы описываем методы, которые могут широко применяться для широкого спектра видов организмов для морфологической оценки.

SEM нашла широкое применение для изучения неорганических материалов, включая наночастиц11,12, полимеры13и многочисленные приложения в геологических, промышленных и материальной науки14, 15,16. В биологии SEM уже давно используется как метод для изучения биологических образцов от индивидуальных белков до всего организмов17,18. SEM имеет особое значение, потому что морфологические поверхности детали могут использоваться для информирования научных открытий. SEM анализ-это быстрый, недорогой и простой способ для получения подробной информации о структуре, размер и характеристики поверхности широкого спектра биологических образцов.

Потому что SEM обычно работает под высоким вакуумом (10-6 Торр минимум) для поддержки согласованного луча высокоскоростной электронов, без жидкостей (воды, масла, спирты), допускаются в палате образец, как жидкости предотвратить вакуум от формирования. Таким образом все образцы, рассмотрели, с использованием SEM должны обезвоженной, обычно с помощью градуированных этанола серии последовал процесс сушки для удаления этанола. Существует несколько способов сушки биологических тканей для использования в SEM, включая воздушной сушки, лиофилизация, использования критической точки сушки (CPD) устройства, или химического вещества, сушки, используя t бутиловый спирт (TBA) или Гексаметилдисилазан (ГМДО)19, 20 , 21 , 22. наиболее часто, выбор метода сушки эмпирические, поскольку каждый биологический образец может по-разному реагируют на каждый метод сушки. Для любого заданного образца все эти методы могут быть уместно, поэтому сравнивать преимущества и недостатки каждого из них является полезным при выборе соответствующего метода.

В то время как воздушной сушки образца при комнатной температуре или в сушильной печи (60 ° C) является самым простым методом, большинство биологических образцов показывают сушки индуцированных повреждений, таких как съежившегося и крах, что приводит к деформации образца. Процесс лиофилизации также удаляет воду (или льда) от образца, но требует образцы для флэш замороженные и помещен под вакуумом для удаления льда через процесс сублимации, потенциально опасных образца. Кроме того пользователь должен иметь доступ к лиофилизатор. Наиболее часто используемый метод для обезвоживания проб для SEM является критической точкой сушки (CPD)). В ДСП этанола в образец заменяется с жидкой двуокиси углерода (CO2) и при определенной температуре и условий давления, известный как критической точки (31,1 ° C и 1,073 psi), CO2 испаряется, тем самым создавая поверхностное натяжение, эффективное поддержание морфологических и структурных особенностей образца. В то время как ДСП, как правило, является стандартным методом, он имеет несколько недостатков. Во-первых этот процесс требует доступа к критической точки осушитель, который не только дорогой, но также требует использования жидкой двуокиси углерода. Во-вторых размер образца, который можно сушить ограничен размер камеры сушки критической точки. В-третьих обмен жидкости во время CPD может вызвать турбулентность, которая может повредить образец.

Химические сушки предлагает много преимуществ по сравнению с ДСП и служит подходящей альтернативой, которая становится широко используется в SEM пробоподготовки. Использование химических dehydrants ТБА и HMDS предлагает быстрый, недорогой и простой альтернативой другим методам, сохраняя при этом структурной целостности образца. Недавно мы показали, что нет никакой разницы в целостности тканей или качество конечного изображения, захваченные при использовании ДСП или TBA как метод сушки в взрослых дрозофилы ткани сетчатки23. В отличие от ДСП TBA и HMDS не требуют сушки инструмента или жидкие CO2 , и нет никаких ограничений на размер образца, чтобы высушить. Помимо получения химических веществ, для завершения процесса сушки требуются только стандартный Химический вытяжной шкаф и соответствующие средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат и защитные очки). Хотя та и HMDS легковоспламеняющиеся, TBA менее токсичные и менее дорогим (примерно 1/3 стоимости ГМДО) чем HMDS.

В этой статье мы опишем, как исправить, мыть, обезвоживанию, сухой, монтировать, распыления Пальто и изображения трех видов организмов: цианобактерий (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. и неизвестных sp.), два euglenoids из рода Monomorphina (М. aenigmatica и м. pseudopyrum) и плодовой мушки (Drosophila melanogaster). Эти организмы представляют широкий диапазон в размер (0,5 мкм до 4 мм) и клеточных разнообразия (одиночные celled для многоклеточных), но все легко поддаются анализу SEM с только небольшие изменения, необходимые для подготовки образцов. Этот протокол описывает методы для использования химических обезвоживания и SEM анализ для изучения морфологических детали трех видов организмов и будет широко применяться для изучения многие научные и типы тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка и закрепление

  1. Подготовьте цианобактерий.
    1. Растут unialgal культур в СМИ F/224,25 при температуре 28 ° C на 14:10 h светло темная цикла. Передачи достаточно культуры пробки microcentrifuge 1,5 мл, что после позволяя 15 min урегулировать, бактериальный гранулы примерно 0,05 мл в размер. Удалите средства массовой информации и заменить 1,5 мл фиксатором (1,25% глютаральдегид, 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0), осторожно перевернуть несколько раз и инкубировать на ночь при 4 ° C.
    2. Передача фиксированные ячейки с стеклянной пипетки в буровой установки фильтрации 10 мл (рис. 1), содержащие фильтр 25 мм поликарбоната с порами 0,8 или 0,2 мкм, в зависимости от размера ячейки. Воронка с резиновыми пробками содержать культуру в воронку и уплотнением стороне руки. Снимите фиксатор мягкий вакуум на колбу фильтрации, после удаления обоих пробок.
      Примечание: Если плотность клеток на поликарбонат фильтр не является оптимальным, отрегулируйте количество начиная культуры используется.
  2. Подготовьте одноклеточных водорослей (euglenoids).
    1. Расти unialgal культур в АФ-6 СМИ26 с 150 мл L-1 коммерчески доступных почва вода среднего добавлен к средствам массовой информации, при температуре 22 ° C на 14:10 h светло темная цикла. Перевод 2 мл низкой плотности (OD600 < 0.5) культуры с стеклянной пипетки в буровой установки фильтрации 10 мл (рис. 1), содержащий фильтр 25 мм поликарбоната с 8 мкм поры. Воронка с резиновыми пробками содержать культуру в воронку и уплотнением стороне руки.
      Примечание: Если плотность клеток на поликарбонат фильтр не является оптимальным, отрегулируйте количество начиная культуры используется.
    2. Добавьте три капли 4% осмия тетраоксид (4OsO) непосредственно к культуре и позволяют инкубировать на 30 мин снять фиксатор мягкий вакуум на колбу фильтрации, после удаления обоих пробок.
      Примечание: OsO4 является острый токсин (кожный, Оральный и ингаляции маршруты), коррозионное воздействие на кожу, повредив глаз и дыхательных сенсибилизатор. OsO4 должно быть обработано в Химический вытяжной шкаф, используя надлежащие средства личной защиты, включая перчатки, лабораторный халат и защиты глаз.
  3. Подготовьте Drosophila melanogaster (плодовая муха)23.
    1. Анестезировать взрослых мух, с использованием 100% углекислого газа. Место под наркозом взрослых (около 10-30 мухи) в небольшой пластиковый колпачок флакона или 1,5 мл пластиковых пробирок.
    2. Погружать наркотизированных мух в 1 мл фиксатором (1,25% глютаральдегид, 0,1 М фосфатного буфера рН 7,2) для 2 h (или ночь) на 4 ° C. Если мухи плавают на поверхности фиксатором, добавьте несколько капель 2,5% полиэтиленгликоль трет octylphenyl эфира для ослабления поверхностного натяжения фиксатором, позволяя для полного погружения в ткани. Удалите с помощью пипетки стеклянные фиксатором.

2. мытье и обезвоживания

  1. Вымойте и обезвоживанию цианобактерий.
    1. Вымойте фиксированной образца три раза с 5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7.0 при комнатной температуре в течение 10 мин. Храните настой и воронка, закупоренной провести промывку. Удаление каждого мытья нежные вакуум на колбу фильтрации, после удаления обоих пробок.
    2. Обезвоживает образца при сохранении постоянного погружения с помощью серии градуированных этанола, для 10 минут в объеме 5 мл в воронку. Градуированные этанола концентрации: 25%, 50%, 75%, 95% и 2 изменения 100% этанола. Держать колбу и воронка, закупоренной содержит этанол в воронку, предотвращая потери обоих через испарение и пассивного потока через фильтр.
    3. Удаление этанола, нежный вакуумный на колбу фильтрации, после удаления обоих пробок. Передать образец фильтра одноразовые алюминиевые весом блюдо, содержащие достаточно просто 100% этанола для покрытия образца до сушки.
  2. Вымойте и обезвоживанию одноклеточных водорослей (euglenoids).
    1. Вымойте фиксированной образца три раза с 5 мл деионизованной воды при комнатной температуре в течение 10 мин. Держите колбу и воронка, закупоренной содержать мыть в воронку. Удаление каждого мытья нежные вакуум на колбу фильтрации, после удаления обоих пробок.
    2. Обезвоживает образца при сохранении постоянного погружения с использованием градуированных этанола серии по 10 мин в объеме 5 мл в воронку. Градуированные этанола концентрации: 25%, 50%, 75%, 95% и 2 изменения 100% этанола. Держать колбу и воронка, закупоренной содержит этанол в воронку, предотвращая потери обоих через испарение и пассивного потока через фильтр.
    3. Удаление этанола, нежный вакуумный на колбу фильтрации, после удаления обоих пробок. Передать образец фильтра одноразовые алюминиевые весом блюдо, содержащие достаточно просто 100% этанола для покрытия образца до сушки.
  3. Вымойте и обезвоживанию Drosophila melanogaster (плодовая муха).
    1. Вымойте фиксированной образца три раза с 1 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,2 при комнатной температуре в течение 10 минут в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Удаление каждого мытья с стеклянной пипетки, соблюдая осторожность, чтобы не удалить мух.
    2. Обезвоживает образца с помощью серии градуированных этанола, для 10 минут в объеме 1 мл в трубу отцентрифугировать. Концентрации этанола: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Удаление этанола с стеклянной пипетки, соблюдая осторожность, чтобы не удалить мух.
    3. Сохранение образца в пробки microcentrifuge 1,5 мл с достаточно просто 100% этанола для покрытия образца до сушки.

3. Сушка

  1. Выполните, химические сушки с использованием t бутиловый спирт (TBA)27.
    1. Замените этанола раствор 100% раствором 1:1 TBA и 100% этанола на 20 мин заменить раствор 1:1 с 100% ТП 20 мин повторить дважды. Держите решение при 37 ° C, таким образом, чтобы та не замерзают.
      Примечание: TBA 100% имеет точку замерзания 25.5 ° c; решение 1:1 не будет заморозить при комнатной температуре. TBA легковоспламеняющиеся, вызывает серьезное раздражение глаз, вредно при вдыхании и может вызвать раздражение дыхательных путей, сонливость или головокружение. Химический вытяжной шкаф, используя надлежащие средства личной защиты, включая перчатки, лабораторный халат и защиты глаз следует обрабатывать TBA.
    2. Перевести образца в TBA, если в трубу microcentrifuge 1,5 мл в одноразовые алюминиевые весом блюдо. Однажды в алюминиевых весом блюдо, удалите ТБА и замените достаточно свежие TBA 100% для покрытия образца. Заморозить TBA на 4 ° C на 10 мин.
    3. Переезд в вакуумного эксикатора (колпак) с замороженного геля пакеты держать TBA заморожены. Эвакуировать и поддерживать вакуум с ротационный насос, чтобы позволить образца сухие вакуумные сублимации замороженных TBA по крайней мере 3 часа или на ночь.
  2. Выполните, химические сушки с использованием Гексаметилдисилазан (ГМДО)20.
    1. Заменить 100% этанола раствор с раствором 1:2 HMDS и 100% этанола для 20 мин заменить решение 1:2 2:1 раствором HMDS и 100% этанола для 20 мин заменить 2:1 решение с 100% HMDS 20 мин повторить один раз.
      Примечание: HMDS является легковоспламеняющихся и острый токсин (дермальный маршрут). HMDS должны обрабатываться в Химический вытяжной шкаф, используя надлежащие средства личной защиты, включая перчатки, лабораторный халат и защиты глаз.
    2. Перевести образца в HMDS, если в трубу microcentrifuge 1,5 мл в одноразовые алюминиевые весом блюдо. После того как в алюминиевой весом блюдо, замените 100% HMDS с достаточно свежие 100% HMDS для покрытия образца.
    3. Передать образец пластика или стекла-вакуумные Эксикатор с свежими осушителем (5-6 см в глубину) и поместите в в химической зонта. Кроме того место образца непосредственно в химической зонт для сушки сыпучих крышкой, например, для предотвращения падения на образце мусора. Разрешить образец для просушки на 12 до 24 ч.

4. Монтаж

  1. Гора цианобактерий и euglenoids.
    1. Метка нижней части либо алюминия 12 - или 25-мм монтажные заглушки, чтобы указать, что делается на вершине. Нарезать четверти с чистым лезвием или скальпель поликарбоната фильтр с сухие клетки, если заготовка 12 мм, или место весь фильтр, если с помощью заготовка 25 мм.
    2. Поместите каждый фильтр на клей или клей вкладку углерода, прикрепленной к верхней части заготовка.
  2. Смонтировать Drosophila melanogaster (плодовая муха).
    1. Метка нижней части заглушку крепления алюминия указывают на то, что находится на вершине.
      Поместите сухие мухи в нужное положение на клей или углерода клей вкладку, прикрепленной к верхней части заготовка под микроскопом рассечения пинцетом точности.
    2. Примените Серебряный Электропроводящий клей, т.е., Серебряная краска, вокруг внешних краев заглушки. Подключите Серебряная краска для мух с помощью зубочистки для обеспечения проводимости. Не позволяйте краски коснуться области желаемого изображения.
    3. Установите заглушки держателя заглушку и поместите держатель поле Открыть заглушки в эксикатор. Разрешить Серебряная краска сухая по крайней мере 3 h или на ночь для достижения наилучших результатов.

5. распыления покрытия

  1. Подготовьте аппарат распыления покрытия, выполнив четыре-пять сбрасывает газа аргона. При высокой влажности (т.е., воздух комнаты чувствует влажные, обычно около 50% относительная влажность), выполняют шесть-семь флеши. Распыления слой заглушки следуя инструкциям производителя.
  2. Образцы пальто на основе образца используется:
    1. Для фильтров с цианобактериями установите таймер для распыления пальто для 180 s прямо на.
    2. Для фильтров с эукариотических водорослей, т.е., euglenoids, установите таймер для распыления пальто для 120 прямо на, а затем 20 сек с трех сторон под углом 45 °.
    3. Для больших выборок т.е., Муха головы, установите таймер разбрызгивание пальто для 60 s прямо на, а затем 30 с каждой стороны под углом 45 °.
      Примечание: После завершения покрытие заглушки должны быть светло-серого цвета.

6. обработка изображений

  1. Примеры изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа, который включает детектор средних электронов (SE).
    1. Для цианобактерий, применяются следующие параметры: 3-5 кв ускоритель напряжение (AC), 20-30 датчик тока (PC) и 5 мм Рабочее расстояние (WD). Для euglenoids, используйте 3 кВ переменного тока, 30 PC и 5 мм WD. Для мух, используйте 5 кВ переменного тока, 30 PC и 5-10 мм WD.
  2. Измените масштаб в зависимости от размера деталь или объекта для отображения. Отрегулируйте stigmators, отверстий и акцент производится четкое изображение. Захват изображения с высоким разрешением настройки согласно инструкциям производителя SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Цианобактерии являются прокариот группы организмов, которые имеют решающее значение для глобальной углерода, кислорода и азота циклов28,29. Примерно 6000 видов синезеленых водорослей30большинство из них слизистые оболочки, покрытия и подключить клетки вместе и другим структурам31, который вместе с фигурой, может быть решена микроскопически32. Размер ячейки, форма и пигменты настоящего различают отдельных видов и в водной среде обитания, могут быть визуализированы как цианобактерий «расцветает»28. Современная классификация цианобактерий сочетает в себе все морфологические особенности, возможно с использованием световой микроскопии, ТЕА и SEM, а также33молекулярных данных. Подобно оболочке слизь цианобактерий, пленка полосы euglenoid видов помощи в определении филогении. Euglenoids являются водные жгутиконосцев, которые имеют большое разнообразие морфологических и поведенческих, а SEM анализ оказался полезным в классификации различных видов. В частности euglenoids обладают роман структуры под их плазматической мембраны, которые состоят из параллельных полос белковых и микротрубочек, называемый пленкой34,35,36. Количество, расположение и размер полос пленки являются критическим морфологических компараторов и вместе с молекулярных филогенетических данных, используются для построения филогении для Эвгленозои37.

Первым шагом в подготовке цианобактерий и euglenoids требует фильтрации организмов от их среднего роста и достигается путем монтажа буровой установки фильтрации (рис. 1A). Стремление используется вывести средства через фильтр из поликарбоната, оставляя организмов на поверхности фильтра. Размер пор фильтра поликарбоната должны выбираться таким образом, что нетронутыми организмов не будет проходить через (Сравните Рисунок 1B и 1 C). Рисунок 2 показывает представитель результаты трех разных родов цианобактерий. Два пресноводных и один морской. Подробная информация о камере, включая форму и текстуру поверхности видны, а также оболочка слизь или прогнозы от клеток. Рисунок 3 показывает, как SEM используется для визуализации полос пленка двух видов различных euglenoid. Винтовой механизм пленка полосы что слияния в конце заднего сформировать хвост помощи в филогенезе решимость при сравнении Monomorphina aenigmatica (рис. 3A и 3B) с Monomorphina pseudopyrum ( Рисунок 3 c и 3D).

Помимо морфологические характеристики, которые определяют виды внешняя морфология модельных организмов, таких как Drosophila melanogaster может использоваться для выявления генетических модификаторы, используя фоторецепторов нейронов, которые составляют комплекс Дрозофила глаз38. Поскольку глаза несущественных ткани в мух, это можно выразить токсичных белков в клетках сетчатки и использовать SEM для изучения морфологических изменений, которые генетической модификации на глаз. Нормальный глаз летать характеризуются упорядоченный массив щетина и линзы (Рисунок 4A), однако экспрессию белков, связанные с болезнью Альцгеймера создать то, что называется «грубой глаз» фенотип (рис. 4B). Гены, которые подавляют (рис. 4 c) или расширения (рис. 4 d) грубой глаз фенотипом могут играть Физиологическая роль в прогрессирования заболевания и имеют потенциал для наркотиков, ориентация39. Также показано на рисунке 4 являются примерами потенциальные ловушки, чтобы избежать, включая пример структуры рухнул глаза от неправильной сушки техника (Рисунок 4E) и электронов, зарядка от недостаточной распыления покрытия, который появляется при выполнении получение изображения (Рисунок 4F и 4 G).

Figure 1
Рисунок 1 : Схематическое изображение фильтрации буровых установок и SEM поликарбоната фильтра. (A) Этот аппарат используется для разделения малых или одного одноклеточных организмов, таких как цианобактерий и euglenoids от их среднего роста. Применение вакуума в сторону руку настой будет тянуть содержимое воронку через фильтр из поликарбоната и в базу фильтрации колбу, оставляя организмов на поверхности фильтра. (B) SEM 0,8 мкм поры фильтра с не образца как образец был потерян из-за неправильного обращения. Шкалы бар = 20 мкм. (C) SEM 0,8 мкм поры фильтра с цианобактериями настоящего. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : SEM Микрофотография цианобактерий. (A, B) Toxifilum mysidocida, нитчатые пресноводных видов от Колорадо с видимой оболочкой слизь (M). Масштаб баров = 5 (мкмC, D). A пресноводных Golenkina sp. из Огайо. Отдельные ячейки иногда формы колоний, удерживаемых вместе тонким слоем слизи (M). Накаливания как выступы (белые стрелки) продлить для отдельных ячеек. Масштаб баров = 10 (мкмE, F). Неизвестный нитчатые видов от высокой солености лимана в прибрежных водах Техас. Видны отдельные ячейки (черные стрелки) и деления клеток (белые стрелки). Линейки шкалы панели E = 2 мкм. шкалы бар в группе F = 1 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : SEM Микрофотография пленка полосы из двух видов euglenoids. (A, B) Monomorphina aenigmatica. (A) малое увеличение изображения всей ячейки. Шкалы бар = 5 мкм. (B) высокое увеличение заднего конца. Шкалы бар = (3 мкмC, D). Monomorphina pseudopyrum. (C) малое увеличение изображения всей ячейки. Шкалы бар = 10 мкм. (D) высокое увеличение заднего конца. Шкалы бар = 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : SEM анализ фенотипических модификации глаза дрозофилы . По сравнению с нормальной внешний вид упорядоченный массив щетина и линзы летать глаза (A), выражение токсичными белка Тау приводит к гибели нейронов фоторецептора, генерации фенотип «грубой глаз» (B). Выражение генетических модификаторов, которые подавляют (C) или расширяют (D) грубой глаз Тау предоставляет доказательства генов, которые могут играть определенную роль в Тау нейротоксичности. Неправильная техника во время сушки шагов может привести к падению структуры глаза (E), в то время как недостаточное покрытие образца вызовет зарядки, которая выглядит как белый (F) или черный (G) группа во время захвата изображений, как показано стрелкой. Шкалы бар = 400 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описали протокол, с помощью SEM для получения подробной информации о внешних морфологических характеристик трех видов организмов, которые другие могут применять для изучения особенностей многих видов организмов или тканей. В каждом шаге протокола существует потенциальных точек ошибок, которые могут возникнуть и подробно описываются ниже.

В то время как объемы фиксатором и моет здесь являются специфическими, в целом фиксатором и моет должно быть 5-10 x размер образца. Все время фиксации, стирки и обезвоживания основаны на нашем опыте, если возникают проблемы, например, съежившегося образца, вам может потребоваться увеличить раза на каждом шаге, обезвоживания и сушки. В зависимости от вашего одной ячейки выборки возможно, нужно сделать глютаральдегид фиксации и после фиксации в осмия тетраоксид. Если фиксация дуэли необходимо после шага 1.1.2 цианобактерий процедуры покрытия с равным количеством 2%4 OsO в тот же буфер и исходить из шаг 1.2.2 процедуры одну ячейку. От работы здесь не показан мы нашли что дрозофилы может либо непосредственно помещены в фиксирующие следующие анестезии или может быть бесконечно заморожены при-20 ° C в трубку, отцентрифугировать и помещены в фиксатор на более позднее время без разницы в готовой качество изображения.

Во время стирки и обезвоживания шаги крайне важно для перемещения через градуированные этанола серии медленно и без пропуска отметил концентрацию. Если образцы являются обезвоженной слишком быстро, он негативно влияет на основные структурные компоненты в ткани и образец будет высыхать, увядать или свернуть. В рисунке 4Eприведен пример распада тканей. Кроме того чтобы предотвратить введение таких артефактов, как глыба и уплощение морфологических особенностей, это важно оставить просто достаточно этанола для покрытия образца между шаги во время обезвоживания и сушки.

При использовании фильтрации буровых установок, капля воды на базе проведет фильтр на месте при монтаже. Кроме того фильтр должен быть помещен с блестящей стороной вверх и все жидкости следует добавить нежно, стараясь обработать фильтр с осторожностью во избежание вымывания образца. Хотя мы нашли результаты сушки с помощью HMDS или TBA быть одинакового качества, мы рекомендуем использовать TBA: Хотя HMDS и ТБА легковоспламеняющиеся, TBA-около одной трети стоимости и менее токсичен, чем HMDS.

Во время монтажа при помощью Серебряный Электропроводящий клей (также называется Серебряная краска), будьте осторожны при применении как ваш пример легко могут быть покрыты (похоронен) в краску, тем самым скрывая мелкие детали в морфологии. Распыления покрытия раз может меняться в зависимости от вашего образца, и приведенные здесь значения основаны на нашем опыте. Одним из потенциальных негативных результатов недостаточно распыления покрытия это явление называется зарядки, которая часто появляется как белая или черная линия (иногда flash) в конечном изображении (см. Рисунок 4F и G примеры). Если количество зарядки наблюдаемых является минимальным, он может быть возможность смягчить последствия путем настройки различных параметров микроскопа, как снижение ускоряющего напряжения или пучка ток, увеличивая прочность объектив конденсатора, или с использованием меньшего Цель диафрагмы. Большинство SEMs, используемых для биологических образцов имеют детекторы средней электрона, однако некоторые SEMs также могут быть оснащены обратного рассеяния детекторы и экологической средней электрона, все из которых могут корректироваться уменьшить или устранить последствия минимальный зарядки. Если зарядный эффекты являются более выраженными, это вероятно, что плохое заземление образца или слишком мало распыления покрытия для получения вторичных электронов, вызывая заряженные электроны наращивать в образца и спонтанно выйдет, производство искажение изображения во время приобретения. Выраженным зарядки решается наиболее часто с толще покрытие или лучше заземления с серебряной краской. Потому что слишком много и слишком мало распыления покрытия может отрицательно повлиять на качество изображения, то лучше оптимизировать количество покрытия, применяемые настройки переменных времени (10 до 180 s) и давления (70-150 mTorr) распыления нанесения покрытий для достижения Оптим Аль покрытие. Как покрытие, не могут быть удалены после применения к образцу, с одного образца перед покрытием всех образцов рекомендуется тестового запуска.

SEM параметры например, ускоряющее напряжение (в кв), датчик тока (ПК), и рабочее расстояние (WD) должны быть скорректированы, чтобы получить лучшее изображение, возможно, как параметры здесь предлагается начиная параметры, основанные на нашем опыте. В то время как качество образца зависит от тщательностью подготовки, качество итогового изображения опирается на опыт и мастерство SEM оператора. Таким образом мы рекомендуем работать с специалистом SEM или тратить время на разработку собственных SEM навыков. Все данные (включая пробоподготовки и томографии) показано в настоящем документе были порожденных студентов в программе биологии микроскопии в CMU, с руководством факультета и наш техник микроскопии.

Протоколы, описанные здесь включают в себя использование потенциально вредных химических веществ, и надлежащие меры безопасности должны соблюдаться всегда для защиты пользователей, особенно студентов, которые могут быть обработка этих химических веществ. В то время как протоколы укажите проблемы безопасности, связанные с каждого химического вещества, после первого использования, пользователям следует всегда: (1) использование химических Зонта, (2) имеют доступ к чрезвычайной глаза мыть и безопасности душ, (3) использовать надлежащие средства личной защиты, включая Перчатки нитриловые, лаборатории пальто и глаз, защиты и (4) знаете где найти письменные безопасности процедуры, включая процедуры, Места для использования районов, разливают процедуры, процедуры обеззараживания и процедуры удаления отходов.

В заключение эти организмы иллюстрируют, как информация о трехмерный рельеф внешних поверхностей каждого полезна для филогенетических группировки или модификатор анализа. Для цианобактерий функции определяется из SEM может использоваться в сочетании с дополнительные данные от световой микроскопии, ТЕА, и молекулярные исследования для выявления, характеристики и имя цианобактерий. Для euglenoids, число, ширина, композиция (винтовой или прямой) и орнаментом, если он присутствует, пленки полос может использоваться с другими морфологические данные, и если необходимо молекулярных данных, чтобы определить, характеризуют и имя euglenoids. Кроме того другие типы одноклеточные водоросли и простейшие или микро беспозвоночные могут быть подготовлены и рассмотрены аналогичным образом для определения внешних морфологические особенности таких жгутиков, кормление структуры, внешних украшений или детали придатков в случае микро беспозвоночных. Наконец SEM имеет широкое применение для изучения морфологических детали, такие как глаз модели системы дрозофилы, характеризовать генетических модификаторы патологии заболеваний. Протоколы, описанные здесь использовать организмов, которые сильно различаются по сложности, но все они поддаются SEM анализ для сбора полезной морфологической информации, которая имеет решающее значение для научных открытий, охватывающих множество различных других из Биология.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Грант MLS и награды академии летний Мак от управления исследований и аспирантуру в Центральный Мичиганский университет. Цианобактерии были поставлены Zimba и планктона лаборатории, частью центра для прибрежных исследований, Texas A & M University в Корпус-Кристи. Euglenoids были поставлены в лаборатории Triemer, Университет штата Мичиган.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

Биология выпуск 143 сканирование электронная микроскопия (SEM) цианобактерий euglenoid фрукты fly дрозофилы критическая точка сушка (ДСП) Гексаметилдисилазан (ГМДО) t бутиловый спирт (TBA)
Подготовка прокариот и эукариот организмов, с использованием химических сушки для морфологического анализа в растровая электронная микроскопия (SEM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter