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Biology

Préparation des organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de séchage chimique pour l’analyse morphologique en microscopie électronique (MEB)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

Analyse de la SEM est une méthode efficace pour aider à l’identification des espèces ou discrimination phénotypique. Ce protocole décrit les méthodes pour l’examen des détails morphologiques spécifiques des trois types représentatifs des organismes et serait applicable à l’examen des caractéristiques d’un grand nombre d’organismique et types de tissus.

Abstract

Microscopie électronique (MEB) est une technique largement disponible qui a été appliquée à l’étude des spécimens biologiques allant des protéines individuelles aux cellules, tissus, organelles et même tout l’organisme. Ce protocole se concentre sur deux méthodes de séchage chimiques, hexaméthyldisilazane (HMDS) et t-butanol (TBA) et leur application à l’imagerie d’organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de sem Dans cet article, nous décrivons comment fixer, laver, déshydrater, sécher, monter, bredouiller manteau et image de trois types d’organismes : les cyanobactéries (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. et un SP inconnue), deux euglènes appartenant au genre Monomorphina (M. aenigmatica et M. pseudopyrum) et la drosophile (Drosophila melanogaster). Le but du présent protocole est de décrire une méthode rapide, peu coûteuse et simple pour obtenir des informations détaillées sur la structure, la taille et des caractéristiques de surface d’échantillons qui peuvent être largement appliquées à un large éventail d’organismes pour morphologiques évaluation. La réussite de ce protocole permettra à d’autres d’utiliser SEM pour visualiser des échantillons en appliquant ces techniques à leur système.

Introduction

Un microscope électronique à balayage (SEM) utilise un faisceau focalisé d’électrons de haute énergie pour générer une image à partir d’électrons secondaires qui montre la morphologie et la topographie d’un échantillon de1. SEM peut servir à déterminer directement la taille physique d’un échantillon, la structure de la surface et la forme en trois dimensions et offre une plus grande résolution et de la plus grande profondeur de champ par rapport à la microscopie photonique. Une autre forme de microscopie électronique (me), microscopie électronique à transmission (TEM) utilise des électrons focalisés qui traversent l’échantillon, générant des images avec des détails de structure interne. Tandis que TEM a une résolution supérieure à la lumière ou SEM et peut être utilisée pour résoudre des structures aussi petites que les atomes, il a trois inconvénients majeurs : préparation de l’échantillon vaste, un petit champ de vision et une faible profondeur de champ2,3. Bien qu’autre visualisé il existe des protocoles à l’aide de SEM d’examiner des cellules, tissus ou organites4,5,6,7,8,9, 10 , ce protocole est unique car nous décrivons des méthodes qui peuvent être largement appliquées à un large éventail d’organismes d’évaluation morphologique.

SEM a trouvé des applications larges pour l’examen des matériaux inorganiques, y compris les nanoparticules11,12, polymères,13et nombreuses applications en sciences géologiques, industriels et matériels14, 15,,16. En biologie, SEM a longtemps été utilisé comme une méthode d’examen des échantillons biologiques allant de protéines individuelles à tout les organismes17,18. SEM est une valeur particulière parce que les détails morphologiques de la surface peuvent être utilisés pour informer de la découverte scientifique. Analyse de la SEM est une méthode rapide, peu coûteuse et simple pour obtenir des informations détaillées sur la structure, la taille et des caractéristiques de surface d’une large gamme d’échantillons biologiques.

Car une SEM fonctionne normalement sous vide poussé (10-6 Torr minimum) pour soutenir un faisceau cohérent d’électrons à haute vitesse, aucun des liquides (eau, huiles, alcools) ne sont autorisés dans le compartiment de mesure, liquides à prévenir un vide de se former. Ainsi, tous les échantillons examinés à l’aide de SEM doivent être déshydratés, généralement à l’aide d’une série graduée de l’éthanol suivie d’un procédé de séchage pour éliminer l’éthanol. Il existe plusieurs méthodes de séchage des tissus biologiques devant servir à la SEM, y compris le séchage à l’air, lyophilisation, utilisation d’un dispositif de séchage du point critique (CPD), ou produit chimique séchage en utilisant l’alcool t-butylique (TBA) ou hexaméthyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. le plus souvent, le choix d’une méthode de séchage est empirique puisque chaque échantillon biologique peut-être réagir différemment à chaque méthode de séchage. Pour un échantillon donné, toutes ces méthodes peuvent être appropriées, afin de comparer les avantages et les inconvénients de chacun est utile dans le choix de la méthode appropriée.

Alors qu’un échantillon à la température ambiante ou dans une étuve (60 ° C) de séchage à l’air est la méthode la plus simple, la plupart des échantillons biologiques montrent des dommages causés par le séchage comme ratatinement et s’effondrer, aboutissant à la distorsion de l’échantillon. Le processus de lyophilisation aussi supprime l’eau (ou glace) auprès d’un échantillon, mais nécessite des échantillons congelés flash et mis sous vide pour éliminer la glace via le processus de sublimation, potentiellement endommager l’échantillon. En outre, l’utilisateur doit avoir accès à un lyophilisateur. La méthode la plus couramment utilisée pour la déshydratation des échantillons pour SEM est point critique séchage (CPD). CPD, l’éthanol dans un échantillon est remplacé par liquid dioxyde de carbone (CO2) et, sous une température spécifique et des conditions de pression appelées le point critique (31,1 ° C et 1 073 lb/po2), CO2 se vaporise sans créer de tension superficielle, ce qui maintien efficace les caractéristiques morphologiques et structurales de l’échantillon. Alors que le CPD est généralement la méthode standard, il a plusieurs inconvénients. Tout d’abord, le processus nécessite un accès à un point critique, sèche qui n’est pas seulement coûteux, mais qui nécessite également l’utilisation de dioxyde de carbone liquide. Deuxièmement, la taille de l’échantillon qui peut être séché se limite à la taille de la chambre du point critique sèche. En troisième lieu, l’échange de liquides au cours de la CPD peut provoquer des turbulences qui peuvent endommager l’échantillon.

Le séchage chimique offre de nombreux avantages par rapport aux CPD et sert comme une alternative appropriée devient largement utilisé dans la préparation de l’échantillon SEM. L’utilisation des dehydrants chimiques tels que l’ATB et HMDS offre une alternative rapide, peu coûteuse et simple à d’autres méthodes, tout en conservant l’intégrité structurale de l’échantillon. Récemment, nous avons montré qu’il n’y avait aucun différence dans l’intégrité du tissu ou de la qualité de l’image finale, capturé lors de l’utilisation de la DPC ou TBA comme la méthode de séchage en adulte Drosophila tissu rétinien23. Contrairement à la CPD, TBA et HMDS n’exigent pas un instrument de séchage ou de liquide de CO2 et il n’y a aucune limitation sur la taille de l’échantillon à sécher. En plus d’obtenir les produits chimiques, qu’une hotte chimique standard et l’équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse et des lunettes de sécurité) sont nécessaires pour compléter le processus de séchage. Alors que les deux TBA et HMDS sont inflammable, TBA est moins toxique et moins cher (environ 1/3 du coût de la HMDS) que HMDS.

Dans cet article, nous décrivons comment fixer, laver, déshydrater, sécher, monter, bredouiller manteau et image de trois types d’organismes : les cyanobactéries (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. et un SP inconnue), deux euglènes appartenant au genre Monomorphina (M. aenigmatica et M. pseudopyrum) et la drosophile (Drosophila melanogaster). Ces organismes représentent un large éventail en taille (0,5 µm à 4 mm) et de la diversité cellulaire (unicellulaires à multicellulaires), pourtant tous se prêtent facilement à l’analyse de la SEM avec seulement de légères variations, nécessaires à la préparation des échantillons. Ce protocole décrit les méthodes pour l’utilisation de déshydratation chimique et l’analyse de la SEM pour examiner les détails morphologiques des trois types d’organismes et serait applicable à l’examen des nombreux organismique et types de tissus.

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Protocol

1. préparation et Fixation

  1. Préparer des cyanobactéries.
    1. Cultiver des cultures pures en F/2 médias24,25 à une température de 28 ° C sur une 14:10 h cycle sombre de la lumière. Transférer la culture suffisante dans un tube de microtubes de 1,5 mL qu’après avoir laissé 15 min régler, le culot bactérien est environ 0,05 mL taille. Retirez le support et de la remplacer par 1,5 mL de fixateur (glutaraldéhyde à 1,25 %, du tampon phosphate 0,1 M pH 7,0), doucement, inverser plusieurs fois et incuber une nuit à 4 ° C.
    2. Les cellules fixes avec une pipette de verre dans une installation de filtration de 10 mL (Figure 1) contenant un filtre de 25 mm en polycarbonate avec 0,8 ou 0,2 µm pores, selon la taille des cellules de transfert. Sceller le bras latéral et entonnoir avec bouchons en caoutchouc pour contenir la culture dans l’entonnoir. Retirez le fixateur doux sous vide sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons.
      Remarque : Si la densité des cellules sur le filtre en polycarbonate n’est pas optimale, réglez le montant de départ de culture utilisée.
  2. Préparer les algues unicellulaires (euglènes).
    1. Cultiver des cultures pures en AF-6 médias26 avec 150 mL L-1 de milieu sol-eau disponible dans le commerce, ajouté aux médias, à une température de 22 ° C sur une 14:10 h cycle sombre de la lumière. Transférer 2 mL de faible densité (OD600 < 0,5) culture avec une pipette de verre dans une installation de filtration de 10 mL (Figure 1) contenant un filtre de 25 mm en polycarbonate avec 8 µm pores. Sceller le bras latéral et entonnoir avec bouchons en caoutchouc pour contenir la culture dans l’entonnoir.
      Remarque : Si la densité des cellules sur le filtre en polycarbonate n’est pas optimale, réglez le montant de départ de culture utilisée.
    2. Ajouter trois gouttes de 4 % le tétroxyde d’osmium (OsO4) directement à la culture et laisser pour incuber pendant 30 min. retirer le fixateur doux sous vide sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons.
      Remarque : OsO4 est une toxine aiguë (voie cutanée, orale et par inhalation, routes), corrosive pour la peau, dommageable pour les yeux et un sensibilisant respiratoire. OsO4 doivent être manipulés sous une hotte chimique utilisant des équipements de protection individuelle appropriés, y compris les gants, blouse et lunettes de protection.
  3. Préparer la Drosophila melanogaster (mouche)23.
    1. Anesthésier les mouches adultes en utilisant 100 % de dioxyde de carbone. Place anesthésiés adultes (environ 10 à 30 mouches) dans un tube à centrifuger flacon ou 1,5 mL petit bouchon à vis en plastique.
    2. Immerger les mouches anesthésiés dans 1 mL de fixateur (glutaraldéhyde à 1,25 %, du tampon phosphate 0,1 M pH 7,2) pour 2 h (ou toute une nuit) à 4 ° C. Si les mouches flottent à la surface du fixateur, ajouter quelques gouttes d’éther de tert-octylphényle de polyéthylèneglycol de 2,5 % à affaiblir la tension superficielle de le fixatif permettant une immersion totale du tissu. Retirez le fixateur à l’aide d’une pipette de verre.

2. laver et déshydratation

  1. Laver et mettre en attente les cyanobactéries.
    1. Laver l’échantillon fixe trois fois avec 5 mL de tampon phosphate 0,1 M pH 7.0 à température ambiante pendant 10 minutes chacun. Garder le ballon et l’entonnoir avec bouchon pour contenir le lavage. Retirez chaque lavage doux sous vide sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons.
    2. Déshydrater l’échantillon tout en conservant l’immersion continue en utilisant une série graduée de l’éthanol, pendant 10 min dans un volume de 5 mL dans l’entonnoir. Les concentrations d’éthanol graduées sont : 25 %, 50 %, 75 %, 95 % et 2 changements d’éthanol à 100 %. Garder le ballon et l’entonnoir avec bouchon pour contenir de l’éthanol dans l’entonnoir, prévenir la perte tant par évaporation et passive flux à travers le filtre.
    3. Supprimer l’éthanol par aspiration douce sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons. Transférer le filtre/échantillon dans un aluminium jetable pesant plat contenant juste assez d’éthanol 100 % pour couvrir l’échantillon avant le séchage.
  2. Laver et mettre en attente les algues unicellulaires (euglènes).
    1. Laver l’échantillon fixe trois fois avec 5 mL d’eau déminéralisée à température ambiante pendant 10 minutes chacun. Garder le ballon et l’entonnoir avec bouchon pour contenir le lavage dans l’entonnoir. Retirez chaque lavage doux sous vide sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons.
    2. Déshydrater l’échantillon tout en conservant l’immersion continue en utilisant une série graduée de l’éthanol pendant 10 min dans un volume de 5 mL dans l’entonnoir. Les concentrations d’éthanol graduées sont : 25 %, 50 %, 75 %, 95 % et 2 changements d’éthanol à 100 %. Garder le ballon et l’entonnoir avec bouchon pour contenir de l’éthanol dans l’entonnoir, prévenir la perte tant par évaporation et passive flux à travers le filtre.
    3. Supprimer l’éthanol par aspiration douce sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons. Transférer le filtre/échantillon dans un aluminium jetable pesant plat contenant juste assez d’éthanol 100 % pour couvrir l’échantillon avant le séchage.
  3. Laver et déshydrater Drosophila melanogaster (mouche).
    1. Laver l’échantillon fixe trois fois avec 1 mL de tampon phosphate 0,1 M pH 7,2 à température ambiante pendant 10 min dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Retirez chaque lavage avec une pipette en verre, en veillant à ne pas enlever les mouches.
    2. Déshydrater l’échantillon en utilisant une série graduée de l’éthanol, pendant 10 min dans un volume de 1 mL dans un tube à centrifuger. Les concentrations d’éthanol sont : 25 %, 50 %, 75 %, 80 %, 95 %, 100 %. Supprimer l’éthanol avec une pipette en verre, en veillant à ne pas enlever les mouches.
    3. Conserver l’échantillon dans le tube de microtubes de 1,5 mL avec juste assez d’éthanol 100 % pour couvrir l’échantillon avant le séchage.

3. séchage

  1. Effectuer le séchage chimique en utilisant t-butyl alcohol (TBA)27.
    1. Remplacer la solution d’éthanol à 100 % avec une solution 1:1 de TBA et 100 % éthanol pendant 20 min. remplacer la solution 1:1 avec 100 % de TBA pendant 20 min. répéter deux fois. Conserver la solution à 37 ° C alors que TBA ne gèle pas.
      Remarque : TBA 100 % a un point de congélation de 25,5 ° C ; la solution 1:1 ne gèlera pas à température ambiante. ATB est inflammable, provoque une irritation oculaire grave, est nocif par inhalation et peut causer une irritation respiratoire, somnolence ou vertiges. TBA doit être manipulé sous une hotte chimique utilisant des équipements de protection individuelle appropriés, y compris les gants, blouse et lunettes de protection.
    2. Transférer l’échantillon en TBA, si dans un tube de microtubes de 1,5 mL, dans un pesant plat d’aluminium jetable. Une fois dans la capsule en aluminium, supprimez TBA et remplacez-les par juste assez frais TBA de 100 % pour couvrir l’échantillon. Congeler le TBA à 4 ° C pendant 10 min.
    3. Transférer dans un dessiccateur à vide (cloche) avec des cryosacs congelé pour garder TBA congelé. Évacuer et maintenir le vide avec une pompe rotative permettant l’échantillon sec par sublimation sous vide de la TBA congelé pendant au moins 3 heures ou jusqu’au lendemain.
  2. Effectuer le séchage chimique en utilisant hexaméthyldisilazane (HMDS)20.
    1. Remplacez la solution d’éthanol 100 % avec une solution de 1:2 de HMDS et éthanol à 100 % pendant 20 min. remplacer la solution 1:2 avec une solution de 2:1 de HMDS et éthanol à 100 % pendant 20 min. 2:1 solution 100 % HMDS pendant 20 min. répéter une fois.
      Remarque : Le HMDS est inflammable et une toxine aiguë (voie cutanée). HMDS doivent être manipulé sous une hotte chimique utilisant des équipements de protection individuelle appropriés, y compris les gants, blouse et lunettes de protection.
    2. Transférer l’échantillon dans le HMDS, si dans un tube de microtubes de 1,5 mL, dans un pesant plat d’aluminium jetable. Une fois dans l’aluminium pesant plat, remplacer le 100 % HMDS avec juste assez frais 100 % HMDS pour couvrir l’échantillon.
    3. Transférer l’échantillon dans un dessicateur non vide en plastique ou en verre avec dessicant frais (5-6 cm de profondeur) et les placer sous une hotte chimique. Vous pouvez également placer l’échantillon directement sous une hotte chimique à sec avec un couvercle lâche, tel qu’une zone, pour empêcher les débris de tomber sur l’échantillon. Laisser sécher pendant 12 à 24 h l’échantillon.

4. montage

  1. Monter les cyanobactéries et les euglènes.
    1. Bas de soit un aluminium de 12 ou 25 mm-montage stub pour indiquer ce qui est mis sur le dessus de l’étiquette. Couper le filtre en polycarbonate avec les cellules séchées en quartiers avec une lame de rasoir propre ou un scalpel, si vous utilisez une longrine de 12 mm, ou placer le filtre entier si vous utilisez une ébauche de 25 mm.
    2. Placer chaque filtre sur adhésif ou un onglet adhésif carbone fixée sur le haut d’une ébauche.
  2. Monter Drosophila melanogaster (mouche).
    1. La partie inférieure du talon aluminium montage pour indiquer ce qui est mis sur le dessus de l’étiquette.
      Placer les mouches sèches dans la position souhaitée sur onglet adhésif adhésif ou carbone, fixée sur le haut d’un village sous un microscope à dissection avec pince de précision.
    2. Appliquer l’adhésif conducteur argent, c.-à-d. argent peinture, sur les bords externes des talons. Branchez la peinture argentée sur les mouches à l’aide d’un cure-dent pour assurer la conductivité. Ne laissez pas la peinture de toucher la zone d’imagerie désirée.
    3. Placer les talons dans une zone de stub titulaire et la boîte de porte talon ouvert dans un dessicateur. Laisser le vernis sécher au moins 3 heures ou jusqu’au lendemain pour de meilleurs résultats.

5. revêtement par pulvérisation cathodique

  1. Préparez l’appareil de revêtement par pulvérisation cathodique en effectuant quatre ou cinq bouffées de gaz argon. Si l’humidité est élevée (c'est-à-dire l’air ambiant se sent moite, habituellement d’environ 50 % d’humidité relative), effectuer des purges de six ou sept. Par pulvérisation cathodique enduire les stubs suivant les instructions du fabricant.
  2. Échantillons de manteau basés sur échantillon utilisé :
    1. Pour les filtres avec des cyanobactéries, régler la minuterie à bredouiller manteau pour 180 s directement sur.
    2. Pour les filtres avec les algues eucaryotes, c.-à-d. les euglènes, régler la minuterie à bredouiller manteau pour 120 s tout droit, puis 20 s sur trois côtés à un angle de 45 °.
    3. Pour les grands échantillons, c'est-à-dire, mouches chefs, régler la minuterie à bredouiller manteau pour 60 s tout droit, puis 30 s de chaque côté à un angle de 45 °.
      Remarque : Une fois terminée, revêtement talons doivent être gris clair.

6. l’imagerie

  1. Échantillons d’image à l’aide d’un microscope électronique à balayage, qui comprend un détecteur d’électrons secondaires (SE).
    1. Pour les cyanobactéries, appliquer les paramètres suivants : 3-5 kV accélérateur tension (AC), sonde de courant (PC) 20-30 et 5 mm distance de travail (WD). Pour les euglènes, utilisez 3 kV AC, 30 PC et WD de 5 mm. Pour les mouches, utilisez 5 kV AC, 30 PC et 5 à 10 mm WD.
  2. Ajustez le grossissement selon la taille de l’objet à visualiser ou de détail. Régler le stigmators, ouvertures et mise au point jusqu'à ce qu’une image claire est produite. Capturer l’image à l’aide de paramètres de haute résolution selon les instructions du fabricant du SEM.

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Representative Results

Les cyanobactéries sont des procaryote groupe d’organismes qui sont essentiels pour le mondial du carbone, oxygène et azote cycles28,29. Des estimés 6000 espèces de cyanobactéries30, plus entourés d’une gaine mucilagineuse qui couvrent et relient les cellules et à d’autres structures31, qui, ainsi que de la forme, peut être résolu au microscope32. La taille des cellules, la forme et pigments présents distinguent différentes espèces et dans les habitats aquatiques, peuvent être visualisées comme « proliférations de cyanobactéries »28. La classification de cyanobactéries moderne combine toutes les fonctionnalités morphologiques possibles à l’aide de la microscopie photonique, TEM et SEM, ainsi que les données moléculaires33. Semblable à la gaine de mucilage de cyanobactéries, pellicule bandes d’euglenoid espèces aide dans la détermination de la phylogénie. Euglènes sont flagellés aquatiques qui possèdent une grande diversité morphologique et comportementale et analyse SEM s’est avéré utile pour la classification des espèces distinctes. Plus précisément, euglènes possèdent des structures nouvelles sous leur membrane plasmique qui sont composés de bandes parallèles de nature protéiques et les microtubules, appelés la pellicule34,35,36. Le nombre, arrangement et la taille des bandes de pellicule sont critiques comparateurs morphologiques et ainsi que les données phylogénétiques moléculaires, sont utilisés pour construire la phylogénie des Euglenozoa37.

La première étape dans la préparation les cyanobactéries et les euglènes nécessite les filtreurs de leur milieu de croissance et est réalisée par l’assemblage d’un appareil de filtration (Figure 1 a). Aspiration sert à tirer sur le support à travers un filtre en polycarbonate, laissant les organismes sur la surface du filtre. La taille des pores du filtre en polycarbonate doit être choisie, tels que les organismes intacts ne passera pas par (comparer la Figure 1 b et 1C). La figure 2 montre les résultats représentatifs de trois différents genres de cyanobactéries. Deux d’eau douce et un marin. Détails de la cellule, y compris la forme et la texture de la surface sont visibles, ainsi que d’une gaine de mucilage ou des projections des cellules. La figure 3 illustre comment SEM sert à visualiser les bandes de pellicule de deux euglenoid différentes espèces. L’arrangement hélicoïdal de la pellicule des bandes cette fusion à l’extrémité postérieure pour former une queue aide dans la détermination de la phylogénie, lors de la comparaison Monomorphina aenigmatica (figures 3 a et 3 b) avec Monomorphina pseudopyrum ( Figure 3 et 3D).

En plus des caractéristiques morphologiques permettant d’identifier les espèces, la morphologie externe des organismes modèles comme la drosophile peut être utilisée pour identifier des modificateurs génétiques utilisant les neurones photorécepteurs qui composent le composé Drosophile 38des yeux. Puisque le œil est un tissu non essentiels chez les mouches, il est possible d’exprimer les protéines toxiques dans les cellules de la rétine et utiliser SEM pour examiner les modifications morphologiques que la modification génétique a sur le œil. Les yeux de mouche normaux sont caractérisent par un tableau ordonné de soies et de lentilles (Figure 4 a), mais l’expression des protéines associées à la maladie d’Alzheimer de créer ce qu’on appelle le phénotype « rude eye » (Figure 4 b). Gènes qui suppriment (Figure 4) ou augmenter (Figure 4), le phénotype yeux rugueux peuvent jouer un rôle physiologique dans la progression de la maladie et ont un potentiel pour médicament ciblant les39. Également montré à la Figure 4 sont des exemples des pièges potentiels afin d’éviter notamment un exemple de la structure s’est effondré de le œil d’une mauvaise technique de séchage (Figure 4E) et de l’électron de charge du revêtement par pulvérisation cathodique insuffisante qui apparaît au cours de acquisition d’images (Figure 4F et 4 G).

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la filtration et dispositions constructives SEM d’un filtre en polycarbonate. (A), cet appareil est utilisé pour séparer les petits ou simples organismes unicellulaires tels que les cyanobactéries et les euglènes loin de leur milieu de croissance. Application d’un vide sur le bras du côté du ballon va tirer le contenu de l’entonnoir à travers le filtre en polycarbonate et dans la base de la fiole de filtration, laissant les organismes sur la surface du filtre. (B) SEM d’un pore de 0,8 µm filtre avec aucun échantillon que l’échantillon a été perdu à cause d’une mauvaise manipulation. Echelle = 20 µm. (C) SEM d’un filtre de pore de 0,8 µm avec des cyanobactéries présentes. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Micrographie SEM des cyanobactéries. (A, B) Toxifilum mysidocida, une espèce d’eau douce filamenteuse du Colorado avec une gaine visible du mucilage (M). Barreaux de l’échelle = 5 µm. (C, D) A eau douce Golenkina SP de l’Ohio. Particulier des cellules parfois former des colonies maintenues ensemble par une fine couche de mucilage (M). Filament comme protubérances (flèches blanches) s’applique pour les cellules individuelles. Barreaux de l’échelle = 10 µm. (E, F) filamenteux espèces inconnues d’un estuaire à une salinité élevée dans les eaux côtières au Texas. Cellules individuelles (flèches noires) et la division des cellules (flèches blanches) sont visibles. Barre d’échelle dans le groupe E = 2 µm. Echelle dans panneau F = 1 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Micrographie SEM de la pellicule des bandes de deux espèces d’euglènes. (A, B) Monomorphina aenigmatica. (A) les images de faible grossissement de la cellule entière. Echelle = 5 µm. (B) fort grossissement de l’extrémité postérieure. Echelle = 3 µm. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. (C) les images de faible grossissement de la cellule entière. Echelle = 10 µm. (D) fort grossissement de l’extrémité postérieure. Echelle = 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse de SEM de modification phénotypique de le œil de Drosophila . Par rapport à l’aspect extérieur normal le tableau ordonné de soies et de lentilles de le œil de mouche (A), l’expression de la protéine toxique tau provoque la mort des neurones photorécepteurs, générant le phénotype « rude eye » (B). Expression des modificateurs génétiques qui suppriment (C) ou améliorent (D) le œil rugueux tau prouve des gènes qui peuvent jouer un rôle dans la neurotoxicité du tau. Une mauvaise technique pendant le séchage des étapes peut conduire à un effondrement de la structure de l’oeil (E), tandis que le revêtement insuffisant de l’échantillon provoquera la charge, qui apparaît comme un blanc (F) ou noir (G) bande lors de l’acquisition de l’image, comme indiqué par la flèche. Echelle = 400 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole utilisant SEM afin d’obtenir des informations détaillées sur les caractéristiques morphologiques externes de trois types d’organismes que d’autres peuvent s’appliquer afin d’examiner les caractéristiques de nombreux types d’organismes ou de tissus. À chaque étape du protocole, il y a des points potentiels d’erreur qui peuvent survenir et sont décrits en détail ci-dessous.

Tandis que les volumes pour le fixateur et lavages donnés ici sont spécifiques, en général le fixateur et lavages doivent être 5-10 x le volume de l’échantillon. Tous les temps de fixation, lavage et la déshydratation sont basés sur notre expérience, si des problèmes surviennent, par exemple, ratatinement de l’échantillon, vous devrez peut-être augmenter les temps à chaque étape de déshydratation ou de séchage. Selon votre échantillon de cellule unique, vous devrez peut-être effectuer une fixation glutaraldéhyde tant une après fixation au tétroxyde d’osmium. Si une fixation de duel est nécessaire après l’étape 1.1.2 de la procédure de cyanobactéries couvrir avec une quantité égale de 2 % OsO4 dans le même tampon et passer de l’étape 1.2.2 de la procédure de cellule unique. Du travail non illustrée ici, nous avons identifié que drosophile peut soit directement placés dans le fixateur suivante anesthetization ou peut être congelée indéfiniment à-20 ° C dans un tube à centrifuger et placé dans le fixateur à une date ultérieure sans différence en fini qualité de l’image.

Au cours des étapes de lavage et de déshydratation, il est impératif de se déplacer dans la série d’éthanol graduée lentement et sans sauter une concentration remarquable. Si les échantillons sont déshydratées trop vite, il incidence négative sur les composantes structurelles sous-jacentes dans les tissus et spécimen se ratatiner, se fanent ou s’effondrer. Un exemple de l’effondrement des tissus est indiqué dans la Figure 4E. En outre, pour empêcher l’introduction des artefacts tels qu’agglomérante et aplatissement des caractéristiques morphologiques, il est essentiel de laisser juste assez d’éthanol pour couvrir l’échantillon entre les étapes au cours de la déshydratation et le séchage.

Lorsque vous utilisez l’installation de filtration, une goutte d’eau sur la base tiendra le filtre en place lors de l’assemblage. En outre, le filtre doit être placé avec le côté brillant vers le haut et tous les liquides devraient être ajoutés doucement, en prenant soin de gérer le filtre avec soin afin d’éviter de laver l’échantillon. Bien que nous avons trouvé les résultats de séchage en utilisant soit le HMDS ou TBA de qualité égale, nous vous recommandons d’utiliser TBA : tandis que les deux HMDS et TBA sont inflammables, TBA est environ un tiers du coût et moins toxique que le HMDS.

Lors du montage quand à l’aide d’adhésif conducteur argent (aussi appelé peinture argentée), soyez prudent lorsque vous appliquez votre échantillon peut facilement être couverts (enfoui) dans la peinture, ainsi Masquer détails morphologiques. Fois de revêtement par pulvérisation cathodique peuvent varier selon votre échantillon, et les valeurs indiquées ici sont basés sur notre expérience. Un résultat négatif potentiel de revêtement par pulvérisation cathodique insuffisante est un phénomène appelé chargement, qui apparaît souvent comme une ligne blanche ou noire (parfois un éclair) dans l’image finale (voir Figure 4F et G par exemple). Si la quantité de charge observés est minime, il peut être possible d’atténuer les effets en ajustant les différents paramètres de microscope, telles que l’abaissement de la tension d’accélération ou poutre actuelle, augmentant la force de lentille condenseur, et/ou en utilisant un plus petit ouverture objectif. SEMs plus utilisés pour les échantillons biologiques ont des détecteurs d’électrons secondaires, mais quelques SEMs peuvent également être équipés des détecteurs de rétrodiffusion ou détecteurs environnementaux des électrons secondaires, qui peuvent être ajustés pour diminuer ou éliminer les effets d’un minimum de charge. Si les effets de charge sont plus prononcée, il est probable qu’il y a mauvaise mise à la masse de l’échantillon ou trop peu bredouiller revêtement pour produire les électrons secondaires, causant les électrons chargés de construire dans l’échantillon et libérée spontanément, en produisant distorsion de l’image lors de l’acquisition. Prononcé de la charge est le plus souvent résolu avec une couche plus épaisse ou mieux mise à la terre avec de la peinture argentée. Parce que le revêtement par pulvérisation cathodique fois trop et trop peu nuire à la qualité de l’image, il est préférable d’optimiser la quantité de revêtement appliqué en ajustant les variables de temps (10 à 180 s) et pression (70 à 150 mTorr) de la coucheuse par pulvérisation cathodique pour atteindre un optim revêtement de l’al. Que le revêtement ne peut être retiré une fois appliquée à l’échantillon, une série de tests est recommandé auprès d’un échantillon unique avant revêtement tous les échantillons.

Paramètres de SEM comme accélérant la tension (en kV), sonde de courant (PC), et la distance de travail (WD) doit être ajustée pour obtenir la meilleure image possible, comme les paramètres donnés ici sont proposés à partir des paramètres basés sur notre expérience. Alors que la qualité de l’échantillon dépend directement du soin apporté à la préparation, la qualité de l’image finale s’appuie sur l’expérience et la compétence de l’opérateur de SEM. Ainsi, nous recommandons de travailler avec un technicien de SEM ou passer du temps à développer vos compétences de SEM. Toutes les données (y compris préparation des échantillons et imagerie) montrées dans cet article ont été générés par des étudiants de premier cycle dans le programme de biologie microscopie à la CMU, avec les conseils de faculté et notre technicien de microscopie.

Les protocoles décrits ici comprennent l’utilisation de produits chimiques potentiellement dangereux, et les mesures de sécurité adéquates doivent être impérativement respectées pour protéger les utilisateurs, en particulier les étudiants qui peuvent gérer ces produits chimiques. Alors que les protocoles précisent les problèmes de sécurité associés à chaque produit chimique à la première utilisation, les utilisateurs doivent toujours : (1) utiliser une hotte chimique, (2) ont accès à une douche oculaire d’urgence de lavage et de sécurité, (3) l’utilisation des équipements de protection individuelle appropriés y compris gants en nitrile, blouse de laboratoire et l’oeil protection et (4) savent où trouver les procédures de sécurité écrite y compris les procédures, désignés de traitement utilisent des zones, des déversements, des procédures et des procédures de décontamination et modalités d’élimination des déchets.

En conclusion, ces organismes illustrent comment les informations sur la topographie tridimensionnelle des surfaces extérieures de chacun sont utiles pour l’analyse phylogénétique de regroupement ou de modificateur. Pour les cyanobactéries, caractéristiques déterminées par la SEM peuvent être utilisés en combinaison avec des données additionnelles de microscopie photonique, TEM, et des études moléculaires pour identifier, caractériser et nommer les cyanobactéries. Pour les euglènes, le nombre, largeur, arrangement (hélicoïdale ou droite) et ornementation, le cas échéant, de la pellicule bandes peuvent être utilisés avec d’autres données morphologiques, et si les données moléculaires nécessaires, pour identifier, caractérisent et nommez les euglènes. En outre, autres types d’algues unicellulaires et de protozoaires ou de micro-invertébrés peuvent être préparés et examinés de manière similaire, pour déterminer les caractéristiques morphologiques externes tels que des flagelles, structure, ornementation extérieure ou des détails de l’alimentation appendices dans le cas de micro-invertébrés. Enfin, SEM a des applications larges pour l’examen des détails morphologiques, telles que le œil du système modèle drosophile, pour caractériser des modificateurs génétiques de la maladie. Les protocoles décrits ici utilisent les organismes qui varient grandement en ce qui concerne la complexité, mais tous sont prêtent à l’analyse de la SEM pour recueillir des informations morphologiques utiles qui est critiques pour la découverte scientifique s’étendant sur nombreuses différentes sous-disciplines de biologie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par une subvention de MLS et une bourse de chercheur de l’été à MAK du bureau de la recherche et des études supérieures à l’Université de Central Michigan. Cyanobactéries ont été fournis par le Zimba et laboratoire de plancton, une partie du centre d’études côtières, Texas A & M University à Corpus Christi. Euglènes ont été fournis par le laboratoire Triemer, Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

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Biologie numéro 143 Scanning electron microscopy (SEM) cyanobactéries euglenoid mouche à fruit drosophile point critique (CPD) de séchage hexaméthyldisilazane (HMDS) t-butanol (TBA)
Préparation des organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de séchage chimique pour l’analyse morphologique en microscopie électronique (MEB)
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Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

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