Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM-Analyse ist eine effektive Methode um Speziesidentifizierung oder phänotypischen Diskriminierung zu unterstützen. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Untersuchung der morphologischer Besonderheiten der drei repräsentative Arten von Organismen und zur Untersuchung der Eigenschaften von vielen organismal breit anwendbar wäre und Gewebetypen.

Abstract

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) ist eine verbreitete Technik, die angewendet wurden, um biologische Proben von einzelne Proteine, Zellen, Gewebe, Organellen und sogar ganze Organismen bis hin zu untersuchen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei chemischen Trocknungsmethoden, Hexamethyldisilazane (HMDS) und t-Butyl-Alkohol (TBA) und deren Anwendung auf Bildgebung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit SEM In diesem Artikel beschreiben wir, wie zu reparieren, waschen, entwässern, trocknen, montieren, sputter-Mantel und Bild drei Arten von Organismen: Cyanobakterien (Toxifilum Mysidocida, Golenkina SP., und eine unbekannte SP.), zwei Euglenoids aus der Gattung Monomorphina (M. Aenigmatica und M. Pseudopyrum), und der Taufliege (Drosophila Melanogaster). Dieses Protokoll soll beschreiben, eine schnelle, preiswerte und einfache Methode, um erhalten detaillierte Informationen über die Struktur, Größe und Oberflächenbeschaffenheit der Exemplare, die im großen und ganzen auf eine große Auswahl an Organismen für angewendet werden können morphologische Bewertung. Erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls können andere SEM verwenden Proben durch Anwendung dieser Techniken, um ihr System zu visualisieren.

Introduction

Ein Rasterelektronenmikroskop (REM) nutzt einen fokussierten Strahl von hochenergetischen Elektronen erzeugen ein Bild von Sekundärelektronen, die Morphologie und die Topographie von Beispiel1zeigt. SEM kann verwendet werden, um direkt die physische Größe einer Probe, die Oberflächenstruktur und die dreidimensionale Form, und bietet höhere Auflösung und größere Schärfentiefe im Vergleich zu Lichtmikroskopie bestimmen. Eine andere Form der Elektronenmikroskopie (EM), nutzt Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) fokussierte Elektronen, die durch die Probe, erzeugen Bilder mit feinen Details der internen Struktur übergeben. TEM hat höhere Auflösung als Licht oder SEM und kann verwendet werden, um Strukturen so klein wie einzelne Atome zu lösen, hat es drei große Nachteile: umfangreiche Probenvorbereitung, ein kleines Sichtfeld und einer geringen Tiefe von Feld2,3. Obwohl andere visualisiert Protokolle gibt es mit SEM zu bestimmten Zellen, Organellen oder Gewebe4,5,6,7,8,9, 10 , dieses Protokoll ist einzigartig, da wir Methoden beschreiben, die im großen und ganzen auf eine Vielzahl von Organismen zur morphologischen Beurteilung angewendet werden können.

SEM findet breite Anwendungen für die Prüfung von anorganischer Materialien einschließlich Nanopartikel11,12, Polymere13und zahlreiche Anwendungen in geologischen, industriellen und materiellen Wissenschaften14, 15,16. In der Biologie wurde SEM lange als eine Methode zur Untersuchung von biologischer Proben von einzelnen Proteine bis hin zu ganzen Organismen17,18eingesetzt. SEM ist von besonderem Wert, weil morphologische Oberflächendetails verwendet werden, um wissenschaftliche Entdeckung informieren. SEM-Analyse ist eine schnelle, preiswerte und einfache Methode, um detaillierte Informationen über die Struktur, Größe und Oberflächenbeschaffenheit eine Vielzahl von biologischen Proben.

Da ein SEM normalerweise im Hochvakuum (10-6 minimale Torr arbeitet), einen kohärenten Strahl von High-Speed-Elektronen zu unterstützen, dürfen keine Flüssigkeiten (Wasser, Öle, Alkohole) in die Probenkammer, wie Flüssigkeiten ein Vakuum zu verhindern. Somit müssen alle Proben mit SEM untersucht dehydriert werden in der Regel mit einer abgestuften Ethanol-Reihe gefolgt von einem Trocknungsprozess, um das Ethanol zu entfernen. Es gibt mehrere Methoden der Trocknung biologischer Gewebes für den Einsatz in der SEM, einschließlich Lufttrocknung, Gefriertrocknung, Verwendung eines kritischen Punkt Trocknungseinrichtung (CPD) oder chemische Trocknung mit t-Butyl-Alkohol (TBA) oder Hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. in den meisten Fällen Auswahl an einem Trocknungsverfahren ist empirisch, da jede biologische Probe auf jedes Trocknungsverfahren unterschiedlich reagieren kann. Für jede Probe kann all diesen Methoden geeignet also vergleicht die vor- und Nachteile der einzelnen nützlich ist bei der Auswahl der geeigneten Methode.

Während Lufttrocknung eine Probe bei Raumtemperatur oder in einem Trockenschrank (60 ° C) die einfachste Methode ist, die meisten biologische Proben trocknen-induzierten Schäden wie Ausdörrende zeigen und zusammenbrechen, was zu Verzerrungen der Probe. Der Prozess der Lyophilisation entfernt Wasser (oder Eis) aus dem Beispiel, aber erfordert Proben Blitz eingefroren werden und platziert unter Vakuum zu entfernen, das Eis über den Prozess der Sublimation, potenziell schädliche Probe. Darüber hinaus muss der Benutzer über ein Gefriertrockner verfügen. Die am häufigsten verwendete Methode für das Austrocknen von Proben für SEM ist kritischer Punkt trocknen (CPD). In CPD wird das Ethanol in einer Probe mit flüssigem Kohlendioxid (CO2) und unter bestimmten Temperatur- und Druckbedingungen bekannt, da der kritische Punkt (31,1 ° C und 1.073 Psi), CO2 verdampft ohne Oberflächenspannung, wodurch ersetzt effektiv Erhaltung der morphologischen und strukturellen Eigenschaften der Probe. Während der CPD im Allgemeinen die Standardmethode ist, hat es einige Nachteile. Der Prozess erfordert zunächst, Zugang zu einem kritischen Punkt Trockner, die ist nicht nur teuer, sondern erfordert auch die Verwendung von flüssigem Kohlendioxid. Zweitens ist die Größe der Stichprobe, die getrocknet werden kann auf die Kammergröße des kritischen Punktes Trockner beschränkt. Drittens kann der Austausch von Flüssigkeiten während der CPD Turbulenzen verursachen, die die Probe beschädigen können.

Chemische Trocknung bietet viele Vorteile gegenüber CPD und dient als eine geeignete Alternative, die in SEM Probenvorbereitung verbreitet werden. Die Verwendung von chemischen Dehydrants wie TBA und HMD bietet eine schnelle, preiswerte und einfache Alternative zu anderen Methoden, unter Beibehaltung der strukturellen Integritätdes der Probe. Wir haben vor kurzem gezeigt, es keinen Unterschied in die Integrität des Gewebes oder die Qualität des fertigen Bildes erfasst gab bei der Verwendung von CPD oder TBA als Trocknungsverfahren in Erwachsenen Drosophila Netzhautgewebe23. Im Gegensatz zu CPD TBA und HMD erfordern keine Trocknung Instrument oder flüssiges CO2 und es gibt keine Beschränkung der Größe der Stichprobe, die getrocknet werden. Neben die Chemikalien, sind nur ein standard chemische Dampfhaube und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe und Kittel) erforderlich, um den Trocknungsprozess zu vervollständigen. TBA und HMD brennbar sind, TBA ist weniger giftig und weniger teuer (ca. 1/3 der Kosten des HMDS) als HMD.

In diesem Artikel beschreiben wir, wie zu reparieren, waschen, entwässern, trocknen, montieren, sputter-Mantel und Bild drei Arten von Organismen: Cyanobakterien (Toxifilum Mysidocida, Golenkina SP., und eine unbekannte SP.), zwei Euglenoids aus der Gattung Monomorphina (M. Aenigmatica und M. Pseudopyrum), und der Taufliege (Drosophila Melanogaster). Diese Organismen repräsentieren ein breites Spektrum an Größe (0,5 µm bis 4 mm) und zelluläre Vielfalt (einzellige, mehrzelligen), doch alles sind SEM-Analyse leicht zugänglicher mit nur kleinen Variationen für Probenvorbereitung erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden für die Verwendung von chemischen Dehydrierung und SEM Analyse um morphologische Details der drei Arten von Organismen zu untersuchen und zu prüfen viele organismal breit anwendbar wäre und Gewebetypen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vorbereitung und Fixierung

  1. Cyanobakterien vorzubereiten.
    1. Unialgal Kulturen in f/2 Medien24,25 bei einer Temperatur von 28 ° C auf einem 14:10 h wachsen Licht-dunklen Zyklus. Übertragen Sie ausreichend Kultur zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, so dass nach Abzug der 15 min zu begleichen, die bakterielle Pellet ca. 0,05 mL Größe. Entfernen Sie den Datenträger ersetzen mit 1,5 mL Fixativ (1,25 % Glutaraldehyd, 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,0), sanft mehrmals umkehren und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
    2. Die festen Zellen mit einer Glaspipette in ein 10 mL-Filtration-Rig (Abbildung 1) mit einer Polycarbonat-25 mm-Filter mit 0,8 oder 0,2 µm-Poren, abhängig von der Größe der Zellen zu übertragen. Der Seitenarm verschließen und Trichter mit Gummistopfen, die Kultur in den Trichter zu enthalten. Entfernen Sie das Fixiermittel durch sanfte Vakuum auf die Filtration Kolben, nach dem Entfernen der beiden Stopper.
      Hinweis: Wenn die Zelldichte auf dem Polycarbonat-Filter nicht optimal ist, passen Sie die Menge der verwendeten Kultur ab.
  2. Bereiten Sie die einzelligen Algen (Euglenoids).
    1. Wachsen Unialgal Kulturen in AF-6 Medien26 mit 150 mL L-1 von handelsüblichen Bodenwasser Medium hinzugefügt zu den Medien, bei einer Temperatur von 22 ° C auf einem 14:10 h Licht-dunklen Zyklus. Transfer von 2 mL mit niedriger Dichte (OD600 < 0,5) Kultur mit einer Glaspipette in ein 10 mL-Filtration-Rig (Abbildung 1), einen Polycarbonat 25 mm Filter mit 8 µm-Poren enthält. Der Seitenarm verschließen und Trichter mit Gummistopfen, die Kultur in den Trichter zu enthalten.
      Hinweis: Wenn die Zelldichte auf dem Polycarbonat-Filter nicht optimal ist, passen Sie die Menge der verwendeten Kultur ab.
    2. Fügen Sie drei Tropfen 4 % Osmium ausgefällt (OsO4) direkt an die Kultur und inkubieren Sie für 30 min. entfernen das Fixiermittel durch sanfte Vakuum auf die Filtration-Flasche nach dem Entfernen der beiden stopfen lassen.
      Hinweis: OsO4 ist eine akute Toxin (dermal, Oral und Inhalation Routen), ätzend auf die Haut, die schädlich für die Augen und Atemwege sensibilisierend. OsO4 sollten in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Kittel und Augenschutz behandelt werden.
  3. Drosophila Melanogaster (Fruchtfliege)23vorzubereiten.
    1. Fliegen mit 100 % Kohlendioxid zu betäuben. Platz betäubt Erwachsene (etwa 10 bis 30 fliegen) in einem kleinen Kunststoff-Schraubverschluss Vial oder 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
    2. Tauchen Sie narkotisierten fliegen in 1 mL Fixativ (1,25 % Glutaraldehyd, 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,2) für 2 Stunden (oder über Nacht) bei 4 ° C. Wenn die fliegen an der Oberfläche des Fixiermittels schweben, Tropfen Sie ein paar 2,5 % Polyethylenglykol Tert-Octylphenyl Ether, die Oberflächenspannung des das Fixiermittel für totale Überflutung des Gewebes zu schwächen. Entfernen Sie das Fixiermittel mit einem Glas pipettieren.

2. Waschen und Austrocknung

  1. Waschen und Cyanobakterien zu entwässern.
    1. Waschen Sie die feste Probe dreimal mit 5 mL 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,0 bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Halten Sie die Flasche und Trichter verschlossen um die Wäsche zu halten. Entfernen Sie jedem Waschgang durch sanfte Vakuum auf die Filtration-Flasche nach dem Entfernen der beiden Stopper.
    2. Die Probe unter Beibehaltung der kontinuierlichen eintauchen mit einer abgestuften Ethanol-Reihe, für 10 min in einem Volumen von 5 mL in den Trichter zu entwässern. Die abgestufte Ethanol-Konzentrationen sind: 25 %, 50 %, 75 %, 95 % und 2 Änderungen von 100 % Ethanol. Halten Sie die Flasche und Trichter verschlossen um das Ethanol in den Trichter verhindert Verlust enthalten beide über Verdunstung und passive Durchströmung des Filters.
    3. Entfernen Sie Ethanol durch sanfte Vakuum auf die Filtration-Flasche nach dem Entfernen der beiden Stopper. Übertragen Sie die Filter/Probe auf eine Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Schale mit gerade genug 100 % Ethanol zur Deckung die Probe vor der Trocknung.
  2. Waschen Sie und trocknen Sie einzelligen Algen (Euglenoids).
    1. Waschen Sie die feste Probe dreimal mit 5 mL entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Halten Sie die Flasche und Trichter verschlossen um die Wäsche in den Trichter enthalten. Entfernen Sie jedem Waschgang durch sanfte Vakuum auf die Filtration-Flasche nach dem Entfernen der beiden Stopper.
    2. Die Probe unter Beibehaltung der kontinuierlichen eintauchen mit einer abgestuften Ethanol-Reihe für 10 min in einem Volumen von 5 mL in den Trichter zu entwässern. Die abgestufte Ethanol-Konzentrationen sind: 25 %, 50 %, 75 %, 95 % und 2 Änderungen von 100 % Ethanol. Halten Sie die Flasche und Trichter verschlossen um das Ethanol in den Trichter verhindert Verlust enthalten beide über Verdunstung und passive Durchströmung des Filters.
    3. Entfernen Sie das Ethanol durch sanfte Vakuum auf die Filtration Kolben, nach dem Entfernen der beiden Stopper. Übertragen Sie die Filter/Probe auf eine Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Schale mit gerade genug 100 % Ethanol zur Deckung die Probe vor der Trocknung.
  3. Waschen und Drosophila Melanogaster (Fruchtfliege) zu entwässern.
    1. Waschen Sie die feste Probe dreimal mit 1 mL 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,2 bei Raumtemperatur für 10 min in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Entfernen Sie jedem Waschgang mit einer Glaspipette, wobei Sie darauf achten, nicht um die fliegen zu entfernen.
    2. Die Probe mit Hilfe einer abgestuften Ethanol-Reihe für 10 min in ein Volumen von 1 mL in einem Microfuge Rohr zu entwässern. Die Ethanol-Konzentrationen sind: 25 %, 50 %, 75 %, 80 %, 95 %, 100 %. Entfernen Sie das Ethanol mit einer Glaspipette, wobei Sie darauf achten, nicht um die fliegen zu entfernen.
    3. Behalten Sie die Probe in den 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit gerade genug 100 % Ethanol auf die Probe vor der Trocknung zu decken.

3. Trocknung

  1. Führen Sie die chemische Trocknung mit t-Butyl-Alkohol (TBA)-27.
    1. Ersetzen Sie die 100 %-Ethanol-Lösung mit einer 1:1 Lösung von TBA und 100 % Ethanol für 20 min. ersetzen die 1:1-Lösung mit 100 % TBA für 20 min. zweimal wiederholen. Halten Sie die Lösung bei 37 ° C, so dass TBA nicht einfriert.
      Hinweis: 100 % TBA hat einen Gefrierpunkt von 25,5 ° C; die 1:1-Lösung wird bei Raumtemperatur nicht einfrieren. TBA ist brennbar, verursacht schwere Augenreizung ist gesundheitsschädlich beim Einatmen und Reizung der Atemwege, Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen. TBA sollten in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Kittel und Augenschutz behandelt werden.
    2. Übertragen Sie Probe in TBA, wenn in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch in eine Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Gericht. Einmal in der mit einem Gewicht von Aluminium-Schale, TBA entfernen und ersetzen mit gerade genug frische 100 % TBA um die Probe zu decken. Einfrieren der TBA bei 4 ° C für 10 Minuten.
    3. Übertragen Sie auf ein Vakuum Exsikkator (Bell Jar) mit gefrorenen Gel-Packs, TBA gefroren zu halten. Evakuieren und Vakuum mit einer Kreiselpumpe erlauben die Probe trocken durch Vakuum Sublimierung des gefrorenen TBA für mindestens 3 Stunden oder über Nacht zu erhalten.
  2. Führen Sie die chemische Trocknung mit Hexamethyldisilazane (HMDS)20.
    1. Ersetzen Sie die 100 %-Ethanol-Lösung mit einer 1:2-Lösung von HMDS und 100 % Ethanol für 20 min. ersetzt die 1:2-Lösung mit einer 2:1 Lösung von HMDS und 100 % Ethanol für 20 min. ersetzen das 2:1-Lösung mit 100 % HMDS für 20 min. einmal wiederholen.
      Hinweis: HMD ist entzündlich und eine akute Toxin (dermal Route). HMDS sollten in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Kittel und Augenschutz behandelt werden.
    2. Übertragen Sie Probe in HMDS, wenn in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch in eine Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Gericht. Sobald das Aluminium mit einem Gewicht von Gericht, ersetzen Sie in 100 % HMDS mit gerade genug frische 100 % HMDS um die Probe zu decken.
    3. Übertragen Sie die Probe auf ein Kunststoff oder Glas-Vakuum-Exsikkator mit frischen Trockenmittel (ca. 5-6 cm tief) und setzen Sie in einem chemischen Abzug. Alternativ legen Sie die Probe direkt in einem chemischen Abzug mit einem losen Deckel, z. B. ein Feld, um zu verhindern, dass Schmutz fallen auf die Probe zu trocknen. Lassen Sie die Probe für 12 bis 24 h trocknen.

4. Montage

  1. Montieren Sie Cyanobakterien und Euglenoids.
    1. Beschriften Sie unten entweder eine 12 - 25 mm Aluminium Montage Stub um anzugeben, was an der Spitze platziert wird. Vierteln des Polycarbonat-Filters mit den getrockneten Zellen mit einer sauberen Rasierklinge oder einem Skalpell benutzen einen 12 mm-Stub, oder ganzen Filter einsetzen, wenn einen Stub 25 mm zu verwenden.
    2. Legen Sie jeden Filter auf Kleber oder ein Carbon Klebstoff Tab sicherte sich an die Spitze der a Stummel.
  2. Montieren Sie Drosophila Melanogaster (Fruchtfliege).
    1. Beschriften Sie unten Aluminium Montage Stub um anzugeben, was an der Spitze platziert wird.
      Legen Sie die getrockneten fliegen in die gewünschte Position auf Klebstoff oder Carbon Klebstoff Tab an die Spitze der einen Stub unter dem sezierenden Mikroskop mit Präzision Pinzette gesichert.
    2. Gelten Sie Silber Leitkleber, d.h., Silber Farbe, an den äußeren Rändern der die Stubs. Schließen Sie die silberne Farbe an die fliegen mit einem Zahnstocher um die Leitfähigkeit zu gewährleisten. Lassen Sie sich nicht die Farbe der gewünschten imaging-Bereich zu berühren.
    3. Die Stubs in eine Stub-Halter-Box und der offenen Stub Halter Box in den Exsikkator gestellt. Die silberne Farbe trocknen mindestens 3 Stunden oder über Nacht für beste Ergebnisse zu ermöglichen.

5. sputter-Beschichtung

  1. Vorbereiten der Sputter-Beschichtung-Apparat durch Ausführen von vier bis fünf Leerungen von Argongas. Wenn die Luftfeuchtigkeit hoch ist (d. h. die Raumluft fühlt sich feucht, in der Regel etwa 50 % Relative Luftfeuchtigkeit), sechs bis sieben Spülungen durchführen. Sputter-Mantel die Stubs, die Anweisungen des Herstellers.
  2. Mantel-Proben anhand der Probe verwendet:
    1. Stellen Sie für Filter mit Cyanobakterien den Timer zu Mantel für 180 s gerade an zu stottern.
    2. Stellen Sie für Filter mit eukaryotischen Algen, d. h. Euglenoids den Timer, sputter-Mantel für 120 s geradeaus, dann 20 s auf drei Seiten in einem Winkel von 45°.
    3. Stellen Sie für große Proben, d.h. fliegen Köpfe den Timer, sputter-Mantel für 60 s geradeaus, dann 30 s auf jeder Seite in einem Winkel von 45°.
      Hinweis: Nach der Beschichtung abgeschlossen ist, sollte Stubs hellgrau in Farbe sein.

6. Bildgebung

  1. Bildbeispiele, die mit einem Rasterelektronenmikroskop enthält, einen Sekundär-Elektronen (SE)-Detektor.
    1. Für Cyanobakterien, gelten die folgenden Einstellungen: 3-5 kV Beschleuniger Spannung (AC), 20-30 Sonde Strom (PC) und 5 mm Arbeitsabstand (WD). Verwenden Sie für Euglenoids, 3 kV AC 30 PC und 5 mm WD. Verwenden Sie für fliegen, 5 kV AC 30 PC und 5 bis 10 mm WD.
  2. Passen Sie die Vergrößerung abhängig von der Größe des einzelnen oder des Objekts visualisiert werden. Passen Sie die Stigmators, Öffnungen und Fokus, bis ein klares Bild entsteht. Das Bild mit hoher Auflösung Einstellungen entsprechend den Anweisungen des Herstellers des SEM

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cyanobakterien sind eine prokaryotische Gruppe von Organismen, die für die globale Kohlenstoff, Sauerstoff und Stickstoff Zyklen28,29von entscheidender Bedeutung sind. Von den geschätzten 6000 Arten von Cyanobakterien30die meisten haben eine schleimigen Hülle, die Decken und die Zellen miteinander verbinden und zu anderen Strukturen gelöst31, die zusammen mit der Form kann mikroskopisch32. Zellengröße, Form und Pigmente vorhanden einzelne Arten zu unterscheiden und in aquatischen Lebensräumen als Cyanobakterien "Blüten"28visualisiert werden. Die moderne cyanobakterielle Klassifikation verbindet alle morphologischen Merkmale mit Lichtmikroskopie, TEM, SEM, sowie und molekulare Daten33möglich. Ähnlich wie der Schleim Mantel der Cyanobakterien, Streifen Häutchen von Euglenoid Arten Hilfe bei Bestimmung der Phylogenie. Euglenoids sind aquatische Geißeltierchen, die eine große morphologische und Verhaltensstörungen Vielfalt besitzen, und SEM-Analyse hat sich bewährt bei der Klassifizierung der verschiedenen Arten. Euglenoids besitzen insbesondere neuartige Strukturen unterhalb der Plasmamembran, die aus parallelen proteinhaltige Streifen und Mikrotubuli, genannt die Häutchen34,35,36bestehen. Die Anzahl, Anordnung und Größe der Pellikel Streifen sind kritische morphologische Komparatoren und zusammen mit molekulare phylogenetische Daten werden verwendet, um die Stammesgeschichte für Euglenozoa37zu konstruieren.

Der erste Schritt bei der Vorbereitung von Cyanobakterien und Euglenoids erfordert, filtern die Organismen ihre Wachstumsmedium und geschieht durch Montage einer Filtration Rigs (Abbildung 1A). Aspiration wird verwendet, um das Medium durch einen Polycarbonat-Filter, so dass der Organismen auf der Oberfläche des Filters zu ziehen. Die Porengröße des Filters Polycarbonat gewählt werden, so dass die intakten Organismen nicht passieren werden (Vergleiche Abbildung 1 b und 1 C). Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse der drei verschiedenen Gattungen von Cyanobakterien. Zwei sind Süßwasser und marinen ist. Details der Zelle, einschließlich Form und Textur der Oberfläche sind sichtbar, sowie eine Hülle aus Schleim oder Projektionen aus den Zellen. Abbildung 3 illustriert wie SEM verwendet wird, um die Häutchen Streifen von zwei verschiedenen Euglenoid Arten zu visualisieren. Die spiralförmige Anordnung der das Häutchen Streifen am hinteren Ende eine Heck-Hilfe in Phylogenie Entschlossenheit zu bilden, beim Vergleich von Monomorphina Aenigmatica (Abbildung 3A und 3 b) mit Monomorphina Pseudopyrum ( , zusammenführen Abbildung 3 und 3D).

Neben morphologischen Merkmalen, die Spezies zu identifizieren, kann die externe Morphologie von Modellorganismen wie Drosophila Melanogaster zur identifizieren genetischer Modifikatoren, die mit den Photorezeptoren Neuronen, die die Verbindung umfassen Drosophila Augen-38. Da das Auge ein unwesentlicher Gewebe in fliegen ist, ist es möglich, toxische Proteinen in Netzhautzellen auszudrücken und SEM verwenden, um die morphologischen Veränderungen zu untersuchen, die gentechnische Veränderung am Auge hat. Normale fliegende Augen zeichnen sich durch ein geordnetes Array von Borsten und Linsen (Abbildung 4A), aber Expression von Proteinen, die verbunden sind mit der Alzheimer-Krankheit verursachen, was die "grobe Auge" Phänotyp (Abbildung 4 b) genannt ist. Gene, die unterdrücken (Abbildung 4) oder erhöhen (Abbildung 4) grobe Auge Phänotyp können eine physiologische Rolle bei Fortschreiten der Erkrankung und haben Potential für Drug targeting39. Auch in Abbildung 4 dargestellt sind Beispiele für mögliche Fallstricke zu vermeiden, mit einem Beispiel der eingestürzten Struktur des Auges von unsachgemäßen Trocknungstechnik (Abb. 4E) und Elektron Aufladung von unzureichend Sputter-Beschichtung, die bei Bildaufnahme (Abbildung 4F und 4 G).

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Filtration Rig und SEM eines Polycarbonat-Filters. (A) dieses Gerät wird verwendet, um kleine oder einzelne einzellige Organismen wie Cyanobakterien und Euglenoids Weg von ihren Wachstumsmedium zu trennen. Anwendung von Vakuum auf den Seitenarm des Kolbens wird der Inhalt des Trichters durch den Polycarbonat-Filter und in den unteren Teil der Filtration-Küvette, verlassen der Organismen auf der Oberfläche des Filters ziehen. (B) SEM eine Pore 0,8 µm Filter mit keine Probe wie die Probe war wegen Misshandlung verloren. Maßstabsleiste = 20 µm. (C) SEM von 0,8 µm Pore Filter mit Cyanobakterien vorhanden. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : SEM Schliffbild von Cyanobakterien. (A, B) Toxifilum Mysidocida, einem faserigen Süßwasserarten aus Colorado mit einem sichtbaren Mantel von Schleim (M). Skalieren von Balken = 5 µm. (C, D) A Süßwasser Golenkina SP. aus Ohio. Einzelne Zellen manchmal Kolonien bilden zusammen mit einer dünnen Schicht von Schleim (M) statt. Filament-Vorsprünge (weisse Pfeile) verlängern für die einzelnen Zellen. Skalieren von Balken = 10 µm. (E, F) unbekannte filamentöse Spezies von einem hohen Salzgehalt-Mündung in Texas Küstengewässern. Einzelne Zelle (schwarze Pfeile) und teilenden Zellen (weiße Pfeilspitzen) sind sichtbar. Maßstabsleiste im Bedienfeld "E" = 2 µm. Maßstabsleiste im Bedienfeld "F" = 1 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : SEM Schliffbild der das Häutchen Streifen aus zwei Arten von Euglenoids. (A, B) Monomorphina Aenigmatica. (A) geringer Vergrößerung Bilder der gesamten Zelle. Maßstabsleiste = 5 µm. (B) hohe Vergrößerung des hinteren Endes. Maßstabsleiste = 3 µm. (C, D) Monomorphina Pseudopyrum. (C) geringer Vergrößerung Bilder der gesamten Zelle. Maßstabsleiste = 10 µm. (D) hoher Vergrößerung des hinteren Endes. Maßstabsleiste = 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : SEM Analyse der phänotypischen Veränderung des Auges Drosophila . Im Vergleich zu normalen äußerlich geordnetes Array von Borsten und Objektive der Fliege Auge (A), verursacht Ausdruck der giftige Protein Tau den Tod der Photorezeptor Neuronen, generieren die "grobe Auge" Phänotyp (B). Ausdruck der genetischen Modifikatoren, die entweder zu (C unterdrücken) oder (D) das Tau grobe Auge erhöhen liefert Beweise von Genen, die bei Tau Neurotoxizität eine Rolle spielen kann. Unsachgemäße Technik während der Trocknung Schritte kann zu einem Zusammenbruch der Struktur des Auges (E) führen, während unzureichende Beschichtung der Probe aufladen führen, die entweder als weiße (F) oder schwarz (G) Band während der Bildaufnahme angezeigt wird, wie durch den Pfeil gezeigt. Maßstabsleiste = 400 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier haben wir ein Protokoll mit SEM detaillierte Informationen über externe morphologischen Charakteristika der drei Arten von Organismen, die anderen anwenden können, um Eigenschaften von vielen Arten von Organismen oder Gewebe zu untersuchen. In jedem Schritt des Protokolls gibt es mögliche Punkte der Fehler, der auftreten und werden nachfolgend ausführlich erläutert.

Während die Volumina für Fixiermittel und Waschungen, die hier gegeben sind, sollte im allgemeinen Fixiermittel und Waschungen 5-10 x das Volumen der Probe sein. Fixierung, Wasch- und Dehydrierung jederzeit basieren auf unserer Erfahrung, falls Probleme auftreten, z. B. Ausdörrende der Probe, möglicherweise müssen Sie die Zeiten bei jedem Schritt des trocknen oder Dörren erhöhen. Je nach Ihrem einzigen Zellprobe kann eine Glutaraldehyd Fixierung und ein Post-Fixierung in Osmium ausgefällt tun müsst. Wenn eine Duell-Fixierung ist erforderlich nach Verfahrensschritt 1.1.2 Cyanobakterien OsO4 in dem gleichen Puffer mit einen gleichen Betrag von 2 % abdecken und gehen von Verfahrensschritt 1.2.2 Einzelzelle. Von der Arbeit, die hier nicht gezeigt haben wir festgestellt, dass Drosophila kann entweder direkt in Fixativ folgende Anesthetization gesetzt werden oder bei-20 ° C in einem Microfuge Rohr auf unbestimmte Zeit eingefroren und platziert werden kann in Fixiermittel zu einem späteren Zeitpunkt mit keinen Unterschied in der fertigen Verbesserung der Bildqualität.

Während der Reinigung und Austrocknung Schritte ist es unerlässlich, durch die abgestufte Ethanol-Serie langsam und ohne Überspringen einer bekannten Konzentration bewegen. Wenn Proben zu schnell dehydriert sind, es wirkt sich negativ auf die zugrunde liegenden strukturellen Komponenten im Gewebe und Probe welken, verwelken oder zusammenbrechen. Ein Beispiel für Gewebe Zusammenbruch zeigt Abbildung 4E. Darüber hinaus um die Einführung von Artefakten wie verklumpen und Abflachung der morphologischen Merkmale zu vermeiden, ist es entscheidend, gerade genug Ethanol zur Deckung die Probe zwischen den Schritten während der Austrocknung zu verlassen und Trocknung.

Wenn die Filtration Rig verwenden, wird ein Tropfen Wasser auf der Basis des Filters in Position zu halten bei der Montage. Auch der Filter sollte mit der glänzenden Seite nach oben gelegt werden und alle Flüssigkeiten sollte hinzugefügt werden sanft, achten Sie darauf, die Filter mit Sorgfalt, um zu verhindern, Waschen entfernt die Probe behandeln. Obwohl wir die Ergebnisse der Trocknung mit HMDS oder TBA von gleicher Qualität sein gefunden haben, wir empfehlen die Verwendung von TBA: HMD und TBA brennbar sind, TBA ist etwa ein Drittel der Kosten und weniger toxisch als HMD.

Bei der Montage wenn mit Silber Leitkleber (auch genannt Silberfarbe), seien Sie vorsichtig bei der Anwendung, da Ihre Probe leicht (begraben) in der Farbe abgedeckt werden kann, verdeckt dadurch feine Details in der Morphologie. Sputter-Beschichtung können variieren basierend auf Ihrer Probe, und die hier angegebenen Werte basieren auf unserer Erfahrung. Eine mögliche negative Ergebnis unzureichend Sputter-Beschichtung ist ein Phänomen namens aufladen, die oft als weiße oder schwarze Linie (manchmal ein Blitz) im endgültigen Bild erscheint (siehe Abbildung 4F und G für Beispiele). Wenn der Betrag der Aufladung beobachteten gering ist, kann es möglich sein, zur Abschwächung der Auswirkungen durch die Anpassung verschiedener Mikroskop Parameter, wie z. B. die Senkung der Beschleunigungsspannung oder Strahl Strom, Erhöhung der Kondensator Objektiv Festigkeit, und/oder mit einer kleineren Objektive Blende. Die meisten SEMs benutzt für biologische Proben haben Sekundär-Elektronen-Detektoren, aber auch einige SEMs mit Backscatter-Detektoren oder ökologischen Sekundär-Elektronen-Detektoren, die angepasst werden können verringern oder beseitigen die Auswirkungen minimal ausgestattet werden kann aufladen. Wenn die Aufladungseffekten stärker ausgeprägt sind, es ist wahrscheinlich, dass es schlechte Erdung der Probe oder zu wenig sputter-Beschichtung zur Herstellung der Sekundärelektronen, verursacht die geladenen Elektronen in der Probe aufzubauen und spontan freigesetzt werden, produzieren Verzerrungen im Bild während der Akquisition. Ausgeprägte laden ist in den meisten Fällen mit einer dickeren Schicht oder besser mit Silberfarbe Erdung gelöst. Da sowohl zuviel als auch zuwenig Sputter-Beschichtung die Bildqualität negativ beeinflussen kann, es empfiehlt sich, die Höhe der Beschichtung durch Anpassung der Variablen Zeit optimieren (10 bis 180 s) und Druck (70 bis 150 mTorr) von der Sputter Coater, eine Optim zu erreichen Al-Beschichtung. Da die Beschichtung entfernt werden kann, einmal angewendet, zum Beispiel empfiehlt sich ein Testlauf mit einer einzigen Probe vor der Beschichtung aller Proben.

SEM Parameter wie Beschleunigung Spannung (im kV), Sonde Strom (PC) und Arbeitsabstand (WD) muss angepasst werden, um das bestmögliche Bild erhalten, wie die hier angegebenen Einstellungen vorgeschlagen sind Startparameter basierend auf unserer Erfahrung. Während die Qualität der Probe abhängig von der Sorgfalt bei der Zubereitung ist, stützt sich die Qualität des fertigen Bildes auf die Erfahrung und das Geschick des Operators SEM. Wir empfehlen daher, mit einem SEM-Techniker arbeiten oder Zeit entwickeln Sie Ihre eigenen SEM-Fähigkeiten. Alle Daten (einschließlich Probenvorbereitung und Bildgebung) gezeigt in diesem Papier wurden durch Studenten in der Biologie Mikroskopie-Programm an der CMU, unter Anleitung von Dozenten und unsere Techniker Mikroskopie erzeugt.

Die hier beschriebenen Protokolle umfassen die Verwendung von potenziell schädlichen Chemikalien, und die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen sollten immer zum Schutz der Benutzer, vor allem Studenten, die Umgang mit diesen Chemikalien kann beobachtet werden. Während die Protokolle Sicherheitsbedenken zugeordnete jede chemische Substanz bei der ersten Verwendung angeben, sollten Benutzer immer: (1) verwenden Sie eine chemische Dampfhaube, (2) haben Sie Zugriff auf einen Notfall waschen und Sicherheit Augendusche, (3) Nutzung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung einschließlich Nitril-Handschuhe, Kittel und Auge Schutz und (4) wissen, wo Sie finden schriftliche Sicherheitsverfahren inklusive Abwicklung, benannten Bereichen nutzen spill Prozeduren, Dekontamination und Entsorgungsverfahren zu verschwenden.

Zusammenfassend zeigen diese Organismen wie Informationen über die dreidimensionale Topographie von den Außenflächen der einzelnen nützlich für die phylogenetische Analyse der Gruppierung oder Modifikator. Cyanobakterien Funktionen bestimmt das SEM können verwendet werden, in Kombination mit weiteren Daten von Lichtmikroskopie, TEM, und molekulare Studien zu identifizieren, zu charakterisieren, und nennen Sie die Cyanobakterien. Für Euglenoids, die Anzahl, Breite, Anordnung (schraubenförmige oder gerade) und Ornamentik, falls vorhanden, das Häutchen Streifen verwendbar mit anderen morphologischen Daten und wenn notwendig molekulare Daten zu identifizieren, zu charakterisieren und Euglenoids zu nennen. Darüber hinaus können andere Arten von einzelligen Algen und Protozoen oder Mikro-Wirbellose vorbereitet und geprüft in ähnlicher Weise externe morphologische Merkmale wie Flagellen, Fütterung, Struktur, externe Ornamentik oder Details zu bestimmen Anhängsel bei Mikro-wirbellose Tiere. SEM hat breite Anwendungen für die Prüfung von morphologischen Details, wie das Auge des Modellsystems Drosophila, um genetische Modifikatoren der Krankheit Pathologie zu charakterisieren. Die hier beschriebenen Protokolle nutzen Organismen, die in Bezug auf Komplexität stark variieren, doch alles sind SEM-Analyse, morphologische Informationen zu sammeln, der für wissenschaftliche Entdeckung, die aus vielen verschiedenen Teildisziplinen der entscheidend zugänglicher Biologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss an MLS und ein Sommer Scholar Award, MAK aus dem Office of Research und Graduate Studies an der Central Michigan University finanziert. Cyanobakterien waren von der Zimba und Plankton Lab, Teil des Zentrums für Coastal Studien, Texas A & M University an Fronleichnam bereitgestellt. Euglenoids wurden von Triemer Lab, Michigan State University geliefert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

Biologie Ausgabe 143 scannen Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Cyanobakterien Euglenoid Fruchtfliege Drosophila kritischer Punkt-Trocknung (CPD) Hexamethyldisilazane (HMDS) t-Butyl-Alkohol (TBA)
Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter