Forberedelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af kemiske tørring til morfologisk analyse i Scanning elektronmikroskopi (SEM)
Summary
SEM analyse er en effektiv metode til at støtte i identifikation af arter eller fænotypiske forskelsbehandling. Denne protokol beskriver metoder til at undersøge specifikke morfologiske oplysninger for tre repræsentative typer af organismer og ville gælde generelt at undersøge egenskaber i mange kropsligt og vævstyper.
Abstract
Scanning elektronmikroskopi (SEM) er et almindeligt tilgængelige teknik, der er blevet anvendt til at undersøge biologiske enheder spænder fra individuelle proteiner til celler, væv, organeller og endda hele organismer. Denne protokol fokuserer på to kemiske tørring metoder, hexamethyldisilazane (HMDS) og Thomsen-butyl alkohol (TBA) og deres anvendelse til billeddannelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af SEM. I denne artikel vil vi beskrive hvordan man fix, vaske, dehydrere, tørre, montere, sputter frakke og image tre typer af organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. og en ukendt sp.), to euglenoids fra slægten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og bananfluen (Drosophila melanogaster). Formålet med denne protokol er at beskrive en hurtig, billig og enkel metode til at få detaljerede oplysninger om struktur, størrelse og overfladekarakteristika for enheder, der kan anvendes bredt på en lang række organismer til morfologiske vurdering. Vellykket gennemførelse af denne protokol vil tillade andre at bruge SEM for at visualisere prøver ved at anvende disse teknikker på deres system.
Introduction
En scanning elektron mikroskop (SEM) bruger en fokuseret stråle af højenergi elektroner til at generere et billede fra sekundære elektroner, der viser morfologi og topografi af en prøve1. SEM kan bruges til direkte bestemme den fysiske størrelse af en prøve, overfladestruktur, og tre-dimensionelle form, og tilbyder højere opløsning og større dybdeskarphed i forhold til lysmikroskopi. En anden form for elektronmikroskopi (EM), transmissions elektronmikroskopi (TEM) bruger fokuseret elektroner, der passerer gennem prøven, generere billeder med fine detaljer af interne struktur. Mens TEM har højere opløsning end lys eller SEM og kan bruges til at løse strukturer så lille som enkelt atomer, det har tre store ulemper: omfattende prøveforberedelse, et mindre synsfelt og lavvandede dybde af feltet2,3. Selv om andre visualiseret protokoller findes ved hjælp af SEM for at undersøge specifikke celler, organeller eller væv4,5,6,7,8,9, 10 , denne protokol er unik, idet vi beskriver metoder, der kan anvendes bredt på en lang række organismer til morfologiske vurdering.
SEM har fundet bred programmer for behandlingen af uorganiske materialer herunder nanopartikler11,12, polymerer13og talrige anvendelser i geologiske, industrielle og materielle sciences14, 15,16. I biologi, har SEM længe været brugt som en metode til at undersøge biologiske prøver spænder fra individuelle proteiner til hele organismer17,18. SEM er af ganske særlig værdi fordi morfologiske overflade detaljer kan bruges til at informere videnskabelig opdagelse. SEM analyse er en hurtig, billig og enkel metode til at få detaljerede oplysninger om struktur, størrelse og overfladekarakteristika for en bred vifte af biologiske prøver.
Fordi en SEM normalt opererer under højt vakuum (10-6 Torr minimum) til at støtte en sammenhængende stråle af højhastighedstog elektroner, er ingen væsker (vand, alkoholer, olier) tilladt i prøve salen, da væsker forhindrer, at et vakuum formning. Således skal alle prøver undersøgt ved hjælp af SEM være dehydreret, typisk ved hjælp af en gradueret ethanol serie efterfulgt af en tørringsproces fjerne ethanol. Der er flere metoder til tørring biologiske væv til brug i SEM, herunder lufttørring, ingot, brug af et kritisk punkt tørring (CPD) enhed, eller kemiske tørring ved hjælp af Thomsen-butyl alkohol (TBA) eller hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. oftest, udvælgelse af en tørring metode er empiriske da hver biologisk prøve kan reagere forskelligt på hver tørring metode. For enhver given prøve, kan alle disse metoder være passende, så sammenligne fordele og ulemper ved hver er nyttige i at vælge den relevante metode.
Mens lufttørring en prøve ved stuetemperatur eller i et varmeskab (60 ° C) er den enkleste metode, de fleste biologiske prøver viser tørring-induceret skade som shriveling og sammenbrud, medfører forvridning af modellen. Processen med ingot også fjerner vand (eller is) fra en prøve, men kræver prøver at være flash-frosset og placeret under vakuum til at fjerne is via processen af sublimering, potentielt skadelige prøven. Derudover skal brugeren have adgang til en lyophilizer. Den hyppigst anvendte metode til tørring prøver for SEM er kritiske punkt tørring (CPD). I CPD, er ethanol i en stikprøve erstattet med flydende kuldioxid (CO2) og under specifikke temperatur og trykforholdene kendt som det kritiske punkt-(31,1 ° C og 1.073 psi), CO-2 fordamper uden at skabe overfladespænding, hvorved effektivt fastholde de morfologiske og strukturelle elementer i prøven. Mens CPD er generelt den standardmetode, har det flere ulemper. Først, processen kræver adgang til et kritisk punkt tørretumbler, der er ikke kun dyre, men også kræver anvendelsen af flydende kuldioxid. Andet, størrelsen af den prøve, der kan tørres er begrænset til størrelsen afdeling af det kritiske punkt tørretumbler. Tredje, udvekslingen af væsker under CPD kan forårsage uro, der kan skade prøven.
Kemiske tørring tilbyder mange fordele i forhold til CPD og fungerer som et egnet alternativ, der er ved at blive udbredt i SEM prøveforberedelse. Brugen af kemiske dehydrants såsom TBA og HMDS tilbyder en hurtig, billig og enkel alternativ til andre metoder, mens den stadig vedholdt den strukturelle integritet af prøven. Vi viste for nylig, at der var ingen forskel i integriteten af væv eller kvaliteten af det endelige billede fanget ved brug af CPD eller TBA som tørring metode i voksen Drosophila retinale væv23. I modsætning til CPD, TBA og HMDS kræver ikke en tørring instrument eller flydende CO2 og der er ingen begrænsning på størrelsen af prøven tørres. Ud over at opnå kemikalierne, er kun en standard kemisk stinkskab og passende personlige værnemidler (handsker, laboratoriekittel og beskyttelsesbriller) kræves for at fuldføre tørringsprocessen. Mens både TBA og HMDS er brandfarlige, TBA er mindre giftige og billigere (ca. 1/3 udgifterne til HMDS) end HMDS.
I denne artikel vil vi beskrive hvordan man fix, vaske, dehydrere, tørre, montere, sputter frakke og image tre typer af organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. og en ukendt sp.), to euglenoids fra slægten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og bananfluen (Drosophila melanogaster). Disse organismer repræsenterer en bred vifte i størrelse (0,5 µm til 4 mm) og cellulære mangfoldighed (encellede til flercellede), men alle er let indstillet til SEM analyse med kun små variationer til prøvepræparation. Denne protokol beskriver metoder til at bruge kemiske dehydrering og SEM analyse for at undersøge morfologiske oplysninger om tre typer af organismer og ville gælde generelt at undersøge mange kropsligt og vævstyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en protokol bruger SEM for at indhente detaljerede oplysninger om eksterne morfologiske karakteristika af tre typer af organismer, som andre kan anvende til at undersøge funktioner af mange typer af organismer eller væv. Inden for hvert enkelt trin i protokollen er der potentielle point af fejl, der måtte opstå og diskuteres i detaljer nedenfor.
Mens diskenheder for fiksativ og vasker givet her er specifikke, bør generelt fiksativ og vasker være 5-10 x volumen af prøven. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud til MLS og en sommer Scholar Award til MAK fra Office for forskning og studier ved Central Michigan University. Cyanobakterier blev leveret af Zimba og plankton lab, en del af Center for kystnære undersøgelser, Texas A & M University i Corpus Christi. Euglenoids blev leveret af Triemer lab, Michigan State University.
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
References
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).
- Goldstein, J., et al. . Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).
- Egerton, R. F. . Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).
- Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
- Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
- Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
- Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Miquel Guennoc, ., C, , et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
- Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
- Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
- Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
- Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
- Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
- Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
- Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
- Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Wolff, T. . Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
- Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
- Guillard, R. R. L. . Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).
- Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. . National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).
- Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
- Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
- Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
- Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
- Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
- Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
- Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
- Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).
