스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

Summary

SEM 분석 또는 phenotypic 종 식별에 원조 하는 효과적인 방법입니다. 이 세 가지 대표적인 유형의 생물의 특정 형태학 정보를 검사 하는 방법을 설명 합니다 프로토콜과 organismal 많은 기능 검사에 광범위 하 게 적용 될 것 이라고 및 조직 유형.

Abstract

스캐닝 전자 현미경 (SEM) 개별 단백질에서 세포, 조직, 세포, 및 전체 유기 체에 이르기까지 생물 표본 연구에 적용 된 널리 사용할 수 있는 기술 이다. 이 프로토콜은 두 개의 화학 건조 방법, hexamethyldisilazane (HMDS) 및 t-부 틸 알코올 (미정), 및 SEM.를 사용 하 여 간결한과 진 핵 생물의 이미지를 그들의 응용 프로그램에 초점을 맞추고합니다 이 문서에서는, 우리가 해결, 세척, 탈수, 건조, 탑재, 코트, 스퍼터 및 생물의 세 종류를 이미지 하는 방법을 설명: 박테리아 (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., 그리고 알 수 없는 sp.), 2 euglenoids Monomorphina 속에서 (M. aenigmatica, M. pseudopyrum), 그리고 과일 파리 (Drosophila melanogaster). 이 프로토콜의 목적은 구조, 크기, 표면 특성에 대 한 생물의 큰 범위를 광범위 하 게 적용 될 수 있는 표본에 대 한 자세한 정보를 얻기 위해, 저렴 한, 빠르고 간단한 방법을 설명 하는 형태소 평가입니다. 이 프로토콜의 성공적인 완료는 그들의 시스템에이 기법을 적용 하 여 샘플을 시각화 하기 위해 SEM을 사용 하는 다른 수 있게 됩니다.

Introduction

스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이차 전자 형태 및 샘플¹의 지형에서에서 이미지를 생성 하 고 에너지 전자의 집중된 광선을 사용 합니다. SEM는 직접 샘플, 표면 구조 및 3 차원 모양 제공 큰 해상도의 실제 크기와 가벼운 현미경 검사 법에 비해 피사계 큰 깊이 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 전자 현미경 (EM)의 또 다른 형태, 전송 전자 현미경 (TEM) 내부 구조의 정밀한 세부 사항 가진 이미지를 생성 하는 샘플을 통해 전달 하는 집중 된 전자를 사용 합니다. 가장 빛 또는 SEM 보다 더 높은 해상도 작은 단일 원자 구조를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다, 그것은 세 가지 주요 단점: 광범위 한 샘플 준비, 보기의 작은 필드와 필드^2,3의 얕은 깊이. 비록 다른 시각 프로토콜 특정 세포, 세포, 또는 조직^4,5,6,7,,89, 검사를 SEM을 사용 하 여 존재 ¹⁰ ,이 프로토콜은 독특한 형태학 평가 대 한 생물의 큰 범위를 광범위 하 게 적용 될 수 있는 방법 설명.

Sem의 지질, 산업, 및 소재 과학^14, 나노 입자^11,12, 폴리머¹³및 수많은 응용 프로그램을 포함 하는 무기 재료를 조사 하기 위한 광범위 한 응용 프로그램을 발견 했다 ^15,16. 생물학, SEM 오래 개별 단백질에서 전체 유기 체^17,18에 이르기까지 생물 학적 샘플을 조사 하기 위한 방법으로 사용 되었습니다. Sem의 과학적 발견을 알리기 위하여 형태학 표면 세부 정보를 사용할 수 있으므로 특정 값입니다. SEM 분석은 구조, 크기, 그리고 다양 한 생물 학적 샘플의 표면 특성에 대 한 자세한 정보를 얻기 위해, 저렴 한, 빠르고 간단한 방법입니다.

일반적으로 SEM 고속 전자의 일관 된 빔을 지원 하기 위해 높은 진공 (10^-6 Torr 최소) 밑에 운영 한다, 때문에 액체는 진공을 형성 하지 아니 액체 (물, 기름, 알콜) 샘플 챔버에 허용 됩니다. 따라서, 모든 샘플 SEM을 사용 하 여 검사 해야 합니다 탈수 일반적으로 건조 과정 뒤 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 에탄올을 제거. 공기 건조, 동결은, 임계점 건조 (일일) 장치, 또는 t-부 틸 알코올 (미정) 또는 hexamethyldisilazane (HMDS)^19, 를 사용 하 여 건조 하는 화학 물질의 사용을 포함 하 여 SEM에서 사용 하기 위해 생물 학적 조직의 건조의 여러 방법이 있다 ^{20 , 21 , 22}. 가장 자주, 건조 방법의 선택은 경험적 이후 각 생물 학적 샘플 각 건조 방법에 다르게 반응할 수 있습니다. 각각의 장단점을 비교 하는 것은 적절 한 방법을 선택 하는 데 유용 하므로 어떤 주어진된 샘플에 대 한 모든 이러한 방법의 적절 한, 있을 수 있습니다.

실내 온도에 또는 건조 오븐 (60 ° C)에서 샘플을 건조 공기는 가장 간단한 방법은, 대부분의 생물 학적 샘플 건조-손상 shriveling 등을 표시 하 고 축소, 왜곡은 견본에서 결과. 동결은 과정 또한 제거 물 (또는 얼음) 샘플, 하지만 플래시-냉동 수 샘플을 필요로 하 고 승화, 잠재적으로 샘플 손상의 과정을 통해 얼음 제거 진공에서 배치. 또한, 사용자는 lyophilizer에 액세스할 수 있어야 합니다. SEM에 대 한 샘플을 탈수에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 방법 (일일)을 건조 하는 중요 한 포인트입니다. 일일 비용, 액체 이산화탄소 (CO₂)와, 특정 온도 압력 조건 함으로써 표면 장력을 만들지 않고 증발 임계점 (31.1 ° C와 1,073 psi), CO₂ 로 알려진에서 샘플에 에탄올이 대체 됩니다. 샘플의 형태 및 구조 기능을 효과적으로 유지. 일일은 일반적으로 표준 방법, 그것은 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 과정 뿐만 아니라, 하지만 또한 액체 이산화탄소의 사용을 필요로 하는 중요 한 포인트, 건조 기에 대 한 액세스를 필요 합니다. 둘째, 건조 수 있는 샘플의 크기의 임계점 건조 기 챔버 크기 제한 됩니다. 셋째, 일일 동안 액체의 교류는 샘플을 손상 시킬 수 있는 난 기류를 발생할 수 있습니다.

화학 건조 일일 비용 이상의 많은 장점을 제공 하 고 SEM 샘플 준비에서 널리 이용 되는 적당 한 대안 역할. 미정 및 HMDS와 같은 화학 dehydrants 사용 하 여 샘플의 구조적 무결성 유지 하면서 다른 방법에, 저렴 한, 빠르고 간단한 대안을 제공 합니다. 우리는 최근에 조직 또는 일일 비용 또는 미정 성인 초파리 망막 조직을²³건조 방법으로 사용 하는 경우 캡처한 최종 이미지의 품질의 무결성에 차이가 있었다는 것을 보여주었다. 일일, 달리 미정 HMDS 필요 하지 않습니다는 건조 또는 액체 CO₂ 하 고 건조 하는 샘플의 크기에 제한이 없습니다. 화학 물질을 얻는 이외에 표준 화학 증기 두건 및 적절 한 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 외 투, 및 안전 고글) 건조 과정을 완료 하는 데 필요 합니다. 미정 및 HMDS는 가연성, 미정은 적은 독성과 더 저렴 (약 1/3의 HMDS 비용) HMDS 보다.

이 문서에서는, 우리가 해결, 세척, 탈수, 건조, 탑재, 코트, 스퍼터 및 생물의 세 종류를 이미지 하는 방법을 설명: 박테리아 (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., 그리고 알 수 없는 sp.), 2 euglenoids Monomorphina 속에서 (M. aenigmatica, M. pseudopyrum), 그리고 과일 파리 (Drosophila melanogaster). 이러한 생물 대표 다양 한 크기 (4 m m 0.5 µ m)과 세포 다양성 (단 세포 다세포에), 아직 모든 SEM 분석을 쉽게 순종 견본 준비에 필요한 작은 변화만. 이 프로토콜 화학 탈수 및 SEM 분석을 사용 하 여 생물의 세 종류의 형태학 세부 사항을 검사 하는 방법을 설명 합니다 및 많은 organismal 검토에 광범위 하 게 적용 될 것 이라고 및 조직 유형.

Protocol

1. 준비 및 고정 박테리아를 준비 합니다. 14:10 h에 28 ° C의 온도에 F/2 미디어24,25 unialgal 문화 성장 빛 어두운 주기에. 해결 하기 위해 15 분을 허용, 후 세균 펠 릿 크기에 약 0.05 mL 충분 한 문화 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송 합니다. 미디어를 제거 (1.25%도, 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.0) 정착 액의 1.5 mL를 바꿉니다, 그리고 부드럽게 여러 번 반전 및 4 °…

Representative Results

남조류는 글로벌 탄소, 산소, 그리고 질소 사이클28,29에 중요 한 생물의 간결한 그룹. 박테리아30의 예상 6000 종의 가장 커버와 함께 셀을 연결 하는 mucilaginous 칼 집 있고 다른 구조에31, 될 수 있는 모양, 함께 해결 미세32. 셀 크기, 모양, 및 안료 현재 개별 종 구별 그리고 수 ?…

Discussion

여기 우리는 세 가지 유형의 다른 사람 유기 체 또는 직물의 많은 종류의 기능을 검사에 적용할 수 있는 생물의 외부 형태학 상 특성에 대 한 자세한 정보를 SEM을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 각 단계에서 발생할 수 있습니다 아래에 자세히 설명 되어 있는 오류의 잠재적인 포인트가 있다.

정착 액 및 세척 여기에서 주어진 볼륨 특정 있지만, 일반적으로 정?…

Materials

gold–palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110606
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 media	Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	No Catalog number given – see link
AF6 media	Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	No Catalog number given – see link
Soil water medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	No Catalog number given – see link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE	The company doesn't appear to sell this model any longer