Summary

스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

Published: January 07, 2019
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Summary

SEM 분석 또는 phenotypic 종 식별에 원조 하는 효과적인 방법입니다. 이 세 가지 대표적인 유형의 생물의 특정 형태학 정보를 검사 하는 방법을 설명 합니다 프로토콜과 organismal 많은 기능 검사에 광범위 하 게 적용 될 것 이라고 및 조직 유형.

Abstract

스캐닝 전자 현미경 (SEM) 개별 단백질에서 세포, 조직, 세포, 및 전체 유기 체에 이르기까지 생물 표본 연구에 적용 된 널리 사용할 수 있는 기술 이다. 이 프로토콜은 두 개의 화학 건조 방법, hexamethyldisilazane (HMDS) 및 t-부 틸 알코올 (미정), 및 SEM.를 사용 하 여 간결한과 진 핵 생물의 이미지를 그들의 응용 프로그램에 초점을 맞추고합니다 이 문서에서는, 우리가 해결, 세척, 탈수, 건조, 탑재, 코트, 스퍼터 및 생물의 세 종류를 이미지 하는 방법을 설명: 박테리아 (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., 그리고 알 수 없는 sp.), 2 euglenoids Monomorphina 속에서 (M. aenigmatica, M. pseudopyrum), 그리고 과일 파리 (Drosophila melanogaster). 이 프로토콜의 목적은 구조, 크기, 표면 특성에 대 한 생물의 큰 범위를 광범위 하 게 적용 될 수 있는 표본에 대 한 자세한 정보를 얻기 위해, 저렴 한, 빠르고 간단한 방법을 설명 하는 형태소 평가입니다. 이 프로토콜의 성공적인 완료는 그들의 시스템에이 기법을 적용 하 여 샘플을 시각화 하기 위해 SEM을 사용 하는 다른 수 있게 됩니다.

Introduction

스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이차 전자 형태 및 샘플1의 지형에서에서 이미지를 생성 하 고 에너지 전자의 집중된 광선을 사용 합니다. SEM는 직접 샘플, 표면 구조 및 3 차원 모양 제공 큰 해상도의 실제 크기와 가벼운 현미경 검사 법에 비해 피사계 큰 깊이 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 전자 현미경 (EM)의 또 다른 형태, 전송 전자 현미경 (TEM) 내부 구조의 정밀한 세부 사항 가진 이미지를 생성 하는 샘플을 통해 전달 하는 집중 된 전자를 사용 합니다. 가장 빛 또는 SEM 보다 더 높은 해상도 작은 단일 원자 구조를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다, 그것은 세 가지 주요 단점: 광범위 한 샘플 준비, 보기의 작은 필드와 필드2,3의 얕은 깊이. 비록 다른 시각 프로토콜 특정 세포, 세포, 또는 조직4,5,6,7,,89, 검사를 SEM을 사용 하 여 존재 10 ,이 프로토콜은 독특한 형태학 평가 대 한 생물의 큰 범위를 광범위 하 게 적용 될 수 있는 방법 설명.

Sem의 지질, 산업, 및 소재 과학14, 나노 입자11,12, 폴리머13및 수많은 응용 프로그램을 포함 하는 무기 재료를 조사 하기 위한 광범위 한 응용 프로그램을 발견 했다 15,16. 생물학, SEM 오래 개별 단백질에서 전체 유기 체17,18에 이르기까지 생물 학적 샘플을 조사 하기 위한 방법으로 사용 되었습니다. Sem의 과학적 발견을 알리기 위하여 형태학 표면 세부 정보를 사용할 수 있으므로 특정 값입니다. SEM 분석은 구조, 크기, 그리고 다양 한 생물 학적 샘플의 표면 특성에 대 한 자세한 정보를 얻기 위해, 저렴 한, 빠르고 간단한 방법입니다.

일반적으로 SEM 고속 전자의 일관 된 빔을 지원 하기 위해 높은 진공 (10-6 Torr 최소) 밑에 운영 한다, 때문에 액체는 진공을 형성 하지 아니 액체 (물, 기름, 알콜) 샘플 챔버에 허용 됩니다. 따라서, 모든 샘플 SEM을 사용 하 여 검사 해야 합니다 탈수 일반적으로 건조 과정 뒤 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 에탄올을 제거. 공기 건조, 동결은, 임계점 건조 (일일) 장치, 또는 t-부 틸 알코올 (미정) 또는 hexamethyldisilazane (HMDS)19, 를 사용 하 여 건조 하는 화학 물질의 사용을 포함 하 여 SEM에서 사용 하기 위해 생물 학적 조직의 건조의 여러 방법이 있다 20 , 21 , 22. 가장 자주, 건조 방법의 선택은 경험적 이후 각 생물 학적 샘플 각 건조 방법에 다르게 반응할 수 있습니다. 각각의 장단점을 비교 하는 것은 적절 한 방법을 선택 하는 데 유용 하므로 어떤 주어진된 샘플에 대 한 모든 이러한 방법의 적절 한, 있을 수 있습니다.

실내 온도에 또는 건조 오븐 (60 ° C)에서 샘플을 건조 공기는 가장 간단한 방법은, 대부분의 생물 학적 샘플 건조-손상 shriveling 등을 표시 하 고 축소, 왜곡은 견본에서 결과. 동결은 과정 또한 제거 물 (또는 얼음) 샘플, 하지만 플래시-냉동 수 샘플을 필요로 하 고 승화, 잠재적으로 샘플 손상의 과정을 통해 얼음 제거 진공에서 배치. 또한, 사용자는 lyophilizer에 액세스할 수 있어야 합니다. SEM에 대 한 샘플을 탈수에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 방법 (일일)을 건조 하는 중요 한 포인트입니다. 일일 비용, 액체 이산화탄소 (CO2)와, 특정 온도 압력 조건 함으로써 표면 장력을 만들지 않고 증발 임계점 (31.1 ° C와 1,073 psi), CO2 로 알려진에서 샘플에 에탄올이 대체 됩니다. 샘플의 형태 및 구조 기능을 효과적으로 유지. 일일은 일반적으로 표준 방법, 그것은 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 과정 뿐만 아니라, 하지만 또한 액체 이산화탄소의 사용을 필요로 하는 중요 한 포인트, 건조 기에 대 한 액세스를 필요 합니다. 둘째, 건조 수 있는 샘플의 크기의 임계점 건조 기 챔버 크기 제한 됩니다. 셋째, 일일 동안 액체의 교류는 샘플을 손상 시킬 수 있는 난 기류를 발생할 수 있습니다.

화학 건조 일일 비용 이상의 많은 장점을 제공 하 고 SEM 샘플 준비에서 널리 이용 되는 적당 한 대안 역할. 미정 및 HMDS와 같은 화학 dehydrants 사용 하 여 샘플의 구조적 무결성 유지 하면서 다른 방법에, 저렴 한, 빠르고 간단한 대안을 제공 합니다. 우리는 최근에 조직 또는 일일 비용 또는 미정 성인 초파리 망막 조직을23건조 방법으로 사용 하는 경우 캡처한 최종 이미지의 품질의 무결성에 차이가 있었다는 것을 보여주었다. 일일, 달리 미정 HMDS 필요 하지 않습니다는 건조 또는 액체 CO2 하 고 건조 하는 샘플의 크기에 제한이 없습니다. 화학 물질을 얻는 이외에 표준 화학 증기 두건 및 적절 한 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 외 투, 및 안전 고글) 건조 과정을 완료 하는 데 필요 합니다. 미정 및 HMDS는 가연성, 미정은 적은 독성과 더 저렴 (약 1/3의 HMDS 비용) HMDS 보다.

이 문서에서는, 우리가 해결, 세척, 탈수, 건조, 탑재, 코트, 스퍼터 및 생물의 세 종류를 이미지 하는 방법을 설명: 박테리아 (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., 그리고 알 수 없는 sp.), 2 euglenoids Monomorphina 속에서 (M. aenigmatica, M. pseudopyrum), 그리고 과일 파리 (Drosophila melanogaster). 이러한 생물 대표 다양 한 크기 (4 m m 0.5 µ m)과 세포 다양성 (단 세포 다세포에), 아직 모든 SEM 분석을 쉽게 순종 견본 준비에 필요한 작은 변화만. 이 프로토콜 화학 탈수 및 SEM 분석을 사용 하 여 생물의 세 종류의 형태학 세부 사항을 검사 하는 방법을 설명 합니다 및 많은 organismal 검토에 광범위 하 게 적용 될 것 이라고 및 조직 유형.

Protocol

1. 준비 및 고정 박테리아를 준비 합니다. 14:10 h에 28 ° C의 온도에 F/2 미디어24,25 unialgal 문화 성장 빛 어두운 주기에. 해결 하기 위해 15 분을 허용, 후 세균 펠 릿 크기에 약 0.05 mL 충분 한 문화 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송 합니다. 미디어를 제거 (1.25%도, 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.0) 정착 액의 1.5 mL를 바꿉니다, 그리고 부드럽게 여러 번 반전 및 4 °…

Representative Results

남조류는 글로벌 탄소, 산소, 그리고 질소 사이클28,29에 중요 한 생물의 간결한 그룹. 박테리아30의 예상 6000 종의 가장 커버와 함께 셀을 연결 하는 mucilaginous 칼 집 있고 다른 구조에31, 될 수 있는 모양, 함께 해결 미세32. 셀 크기, 모양, 및 안료 현재 개별 종 구별 그리고 수 ?…

Discussion

여기 우리는 세 가지 유형의 다른 사람 유기 체 또는 직물의 많은 종류의 기능을 검사에 적용할 수 있는 생물의 외부 형태학 상 특성에 대 한 자세한 정보를 SEM을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 각 단계에서 발생할 수 있습니다 아래에 자세히 설명 되어 있는 오류의 잠재적인 포인트가 있다.

정착 액 및 세척 여기에서 주어진 볼륨 특정 있지만, 일반적으로 정?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품 연구의 사무실 및 중앙 미시간 대학에서 대학원에서 MAK로 MLS와 여름 학술 상 교부 금에 의해 투자 되었다. 남조류는 해안 연구, 텍사스 A & M 대학교 코 퍼스 크리스티에 대 한 Zimba 및 플랑크톤 연구소, 센터의 부분에 의해 공급 되었다. Euglenoids는 Triemer 연구소, 미시간 주립 대학에 의해 공급 되었다.

Materials

 gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given – see link 
AF6 media Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given – see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given – see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE The company doesn't appear to sell this model any longer 

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).
  2. Goldstein, J., et al. . Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).
  3. Egerton, R. F. . Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc, ., C, , et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. . Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. . Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. . National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  38. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

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Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

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