إعداد الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائية للتحليل المورفولوجي في المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)
Summary
تحليل وزارة شؤون المرأة طريقة فعالة للمساعدة في تحديد الأنواع أو التمييز المظهرية. هذا البروتوكول يصف الأساليب لدراسة التفاصيل المورفولوجية الخاصة ثلاثة أنواع تمثيلية من الكائنات الحية وستطبق على نطاق واسع لدراسة ملامح كثيرة العضوي وأنواع الأنسجة.
Abstract
المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) هي تقنية متاحة على نطاق واسع تم تطبيقه لدراسة العينات البيولوجية بدءاً من البروتينات الفردية إلى الخلايا والأنسجة والعضيات والكائنات كلها حتى. ويركز هذا البروتوكول على طريقتين التجفيف الكيميائية هيكساميثيلديسيلازاني (همدس) والكحول تي-بوتيل (يضاف) وتطبيقها لتصوير الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة على حد سواء باستخدام sem. في هذه المقالة، نحن تصف كيفية إصلاح وتغسل ويذوي، جاف، جبل، وتفل معطف والصورة ثلاثة أنواع من الكائنات الحية: البكتيريا الزرقاء (ميسيدوسيدا توكسيفيلوم، جولينكينا sp.، و sp. غير معروف)، يوجلينويدس اثنين من جنس مونومورفينا (أينيجماتيكا م. و. م. بسيودوبيروم)، وذبابة الفاكهة (melanogaster المورفولوجية). والغرض من هذا البروتوكول هو وصف طريقة سريعة وغير مكلفة وبسيطة للحصول على معلومات مفصلة عن هيكل وحجم، والخصائص السطحية للعينات التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمجموعة كبيرة من الكائنات الحية من أجل الخصائص المورفولوجية تقييم. النجاح في إنجاز هذا البروتوكول يسمح للآخرين باستخدام SEM لتصور عينات بتطبيق هذه التقنيات على النظام الخاص بهم.
Introduction
المسح الإلكتروني المجهري (SEM) يستخدم مركزة شعاع من الإلكترونات ذات الطاقة العالية لإنشاء صورة من الإلكترونات الثانوية التي تظهر مورفولوجية والطوبوغرافيا ل نموذج1. يمكن استخدام وزارة شؤون المرأة لمباشرة تحديد الحجم الفعلي عينة والبنية السطحية، وشكل ثلاثي الأبعاد، ويوفر دقة أكبر وأكبر عمق الميدان مقارنة بالفحص المجهري الخفيفة. نموذج آخر الميكروسكوب الإلكتروني (م)، يستخدم مجهر إلكتروني (TEM) تركز الإلكترونات التي تمر من خلال العينة، توليد الصور مع التفاصيل الدقيقة للهيكل الداخلي. في حين تيم بدقة أعلى من الضوء أو وزارة شؤون المرأة، ويمكن استخدامها لحل هياكل صغيرة مثل ذرة واحدة، فقد العيوب الرئيسية الثلاثة: إعداد عينة واسعة النطاق ومجال رؤية صغيرة وعمق ضحل من الميدان2،3. على الرغم من أن البعض تصور وجود بروتوكولات استخدام وزارة شؤون المرأة لدراسة محددة الخلايا أو العضيات، أو الأنسجة4،5،6،،من78،9، 10 ، هذا البروتوكول فريدة من نوعها في ذلك يمكننا وصف الأساليب التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمجموعة كبيرة من الكائنات الحية من أجل تقييم الخصائص المورفولوجية.
ووزارة شؤون المرأة قد وجدت تطبيقات واسعة النطاق لفحص المواد غير العضوية، بما في ذلك جسيمات نانوية11،12،13من البوليمرات، والعديد من التطبيقات في العلوم الجيولوجية والصناعية، والمواد14، 15،16. في علم الأحياء، استخدمت وزارة شؤون المرأة منذ فترة طويلة كوسيلة لفحص العينات البيولوجية بدءاً من البروتينات الفردية لكل الكائنات17،18. وزارة شؤون المرأة ذات قيمة خاصة لأنه يمكن استخدام التفاصيل السطحية المورفولوجية لإبلاغ الاكتشافات العلمية. تحليل وزارة شؤون المرأة طريقة سريعة وغير مكلفة وبسيطة للحصول على معلومات مفصلة عن هيكل وحجم، والخصائص السطحية لمجموعة واسعة من العينات البيولوجية.
عادة يعمل وزارة شؤون المرأة تحت التفريغ العالي (10-6 عربة الحد الأدنى) لدعم متماسك شعاع من الإلكترونات عالية السرعة، لا يسمح أي السوائل (الماء، الزيوت، الكحول) في قاعة عينة، كسوائل منع تشكيل فراغ. وهكذا، يجب أن المجففة جميع العينات التي درست باستخدام SEM، عادة باستخدام سلسلة متدرجة من إيثانول تليها عملية تجفيف لإزالة في الإيثانول. هناك عدة طرق لتجفيف الأنسجة البيولوجية لاستخدامها في وزارة شؤون المرأة، بما في ذلك تجفيف الهواء، ليوفيليزيشن، واستخدام جهاز (وثيقة البرنامج القطري) التجفيف النقطة الحرجة، أو الكيميائية التجفيف باستخدام t-بوتيل الكحول (TBA) أو، هيكساميثيلديسيلازاني (همدس)19 20 , 21 , 22-في معظم الأحيان، اختيار أسلوب التجفيف التجريبية منذ كل عينة بيولوجية قد تتفاعل بشكل مختلف لكل أسلوب التجفيف. لأي نموذج معين، كل هذه الأساليب قد يكون من المناسب، حتى مقارنة مزايا وعيوب كل منها ويكون مفيداً في تحديد الأسلوب المناسب.
بينما الهواء تجفيف عينة في درجة حرارة الغرفة أو في فرن تجفيف (60 درجة مئوية) هو الأسلوب الأبسط، معظم العينات البيولوجية تظهر الأضرار التي يسببها تجفيف مثل شريفلينغ وانهيار، أدى إلى تشويه للعينة. عملية lyophilization أيضا إزالة الماء (أو الجليد) من عينة، ولكن يتطلب عينات لتكون مجمدة في فلاش وتوضع تحت الفراغ لإزالة الثلج عن طريق عملية التسامي، من المحتمل أن تكون ضارة العينة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون المستخدم الوصول إلى ليوفيليزير. الأسلوب الأكثر استخداماً للتجفيف عينات لوزارة شؤون المرأة نقطة حرجة التجفيف (وثيقة البرنامج القطري). في وثيقة البرنامج القطري، يتم استبدال الإيثانول في عينة السائل من ثاني أكسيد الكربون (CO2)، وتحت درجة حرارة معينة وضغط الظروف المعروفة النقطة الحرجة (31.1 درجة مئوية وهذه المبادرة 1,073)، أول أكسيد الكربون2 يبخر دون خلق التوتر السطحي، مما المحافظة على فعالية الميزات البنيوية والهيكلية للعينة. بينما وثيقة البرنامج القطري هو عموما الطريقة القياسية، فقد عدة عيوب. أولاً، العملية تتطلب الوصول إلى نقطة حرجة مجفف، التي ليست مكلفة فقط، بل يتطلب أيضا استخدام ثاني أكسيد الكربون السائل. ثانيا، أن حجم العينة التي يمكن أن تجفف يقتصر على حجم الدائرة النقطة الحرجة مجفف. وثالثاً، يمكن أن يسبب تبادل السوائل خلال وثيقة البرنامج القطري الاضطرابات التي يمكن أن تلحق الضرر العينة.
تجفيف المواد الكيميائية ويوفر مزايا عديدة أكثر من وثيقة البرنامج القطري ويخدم كبديل مناسب أصبح يستخدم على نطاق واسع في إعداد نموذج وزارة شؤون المرأة. ويتيح استخدام ديهيدرانتس الكيميائية مثل القابلات التقليديات وهمدس بديلاً سريعة وغير مكلفة وبسيطة لأساليب أخرى، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للعينة. ونحن مؤخرا أظهرت أن لم يكن هناك فرق في سلامة الأنسجة أو جودة الصورة النهائية التقاطها عند استخدام وثيقة البرنامج القطري أو القابلات التقليديات كأسلوب التجفيف في نسيج الشبكية المورفولوجية الكبار23. وخلافا لوثيقة البرنامج القطري، القابلات التقليديات وهمدس لا تتطلب أداة تجفيف أو السائل CO2 وتوجد أية قيود على الحجم العينة أن تجفف. بالإضافة إلى الحصول على المواد الكيميائية، فقط غطاء الأبخرة الكيميائية القياسية ومعدات الحماية الشخصية المناسبة (القفازات، ومعطف مختبر، ونظارات واقية) المطلوبة لإكمال عملية التجفيف. بينما كل من القابلات التقليديات وهمدس القابلة للاشتعال، يضاف أقل سمية وأقل تكلفة (حوالي 1/3 تكلفة همدس) من همدس.
في هذه المقالة، نحن تصف كيفية إصلاح وتغسل ويذوي، جاف، جبل، وتفل معطف والصورة ثلاثة أنواع من الكائنات الحية: البكتيريا الزرقاء (ميسيدوسيدا توكسيفيلوم، جولينكينا sp.، و sp. غير معروف)، يوجلينويدس اثنين من جنس مونومورفينا (أينيجماتيكا م. و. م. بسيودوبيروم)، وذبابة الفاكهة (melanogaster المورفولوجية). هذه الكائنات تمثل نطاقا واسعاً في الحجم (0.5 ميكرومتر إلى 4 مم) والتنوع الخلوية (وحيدة الخلية إلى متعددة الخلايا)، ولكن كلها بسهولة قابلة للتحليل ووزارة شؤون المرأة مع اختلافات صغيرة فقط بحاجة لإعداد العينات. هذا البروتوكول يصف الأساليب لاستخدام الجفاف الكيميائية والتحليل ووزارة شؤون المرأة للنظر في تفاصيل المورفولوجي لثلاثة أنواع من الكائنات الحية، ويمكن تطبيقها على نطاق واسع في دراسة كثير العضوي وأنواع الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يمكننا وصف بروتوكول باستخدام وزارة شؤون المرأة للحصول على معلومات مفصلة حول الخصائص المورفولوجية الخارجية من ثلاثة أنواع من الكائنات الحية أن الآخرين يمكن أن تنطبق على دراسة السمات لأنواع عديدة من الكائنات الحية أو الأنسجة. في كل خطوة من البروتوكول، هناك نقاط محتملة للخطأ التي قد تن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل بمنحه إلى MLS وجائزة الباحث الصيف إلى MAK من مكتب البحوث والدراسات العليا في جامعة ميشيغان الوسطى. البكتيريا الزرقاء التي تم توفيرها زيمبا ومختبر العوالق، وجزء من المركز “الدراسات الساحلية”، تكساس A & M جامعة في كوربوس كريستي. يوجلينويدس التي تم توفيرها بمختبر تريمير، وجامعة ولاية ميشيغان.
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
References
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).
- Goldstein, J., et al. . Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).
- Egerton, R. F. . Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).
- Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
- Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
- Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
- Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Miquel Guennoc, ., C, , et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
- Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
- Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
- Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
- Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
- Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
- Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
- Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
- Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Wolff, T. . Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
- Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
- Guillard, R. R. L. . Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).
- Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. . National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).
- Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
- Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
- Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
- Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
- Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
- Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
- Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
- Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).
