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Biology

Preparazione di organismi procarioti ed eucarioti mediante essiccazione chimica per analisi morfologica in microscopia elettronica (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

Analisi SEM sono un metodo efficace per aiutare nell'identificazione di specie o discriminazione fenotipica. Questo protocollo descrive i metodi per l'esame di specifici dettagli morfologici dei tre tipi rappresentativi di organismi e sarebbe ampiamente applicabile ad esaminare le caratteristiche di molti organismi e tipi di tessuto.

Abstract

Microscopia elettronica (SEM) è una tecnica ampiamente disponibile che è stata applicata per lo studio di campioni biologici che vanno da singole proteine, cellule, tessuti, organelli e persino interi organismi. Questo protocollo si concentra su due metodi di essiccazione chimiche, esametildisilazano (HMDS) e alcol t-butilico (TBA) e loro applicazione all'imaging di organismi sia procarioti ed eucarioti utilizzando SEM In questo articolo, descriviamo come difficoltà, lavare, disidratare, asciugare, montare, polverizza il cappotto e tre tipi di organismi di immagine: cianobatteri (Toxifilum mysidocida, SP. Golenkina e an SP sconosciuto), due euglene dal genere Monomorphina (M. Enigmonia e M. pseudopyrum) e la Mosca della frutta (Drosophila melanogaster). Lo scopo del presente protocollo è di descrivere un metodo veloce, economico e semplice per ottenere informazioni dettagliate sulla struttura, dimensioni e caratteristiche superficiali degli esemplari che possono essere ampiamente applicati a una vasta gamma di organismi per morfologica valutazione. Completamento del presente protocollo permetterà ad altri di utilizzare SEM per visualizzare esempi di applicazione di queste tecniche al loro sistema.

Introduction

Un microscopio elettronico a scansione (SEM) usa un fascio focalizzato di elettroni ad alta energia per generare un'immagine da elettroni secondari che mostra la morfologia e topografia di un campione1. SEM può essere utilizzato per determinare direttamente la dimensione fisica di un campione, la struttura della superficie e la forma tridimensionale e offre una risoluzione maggiore e maggiore profondità di campo rispetto alla microscopia. Un'altra forma di microscopia elettronica (EM), microscopia elettronica a trasmissione (TEM) utilizza concentrati gli elettroni che passano attraverso il campione, generando le immagini con dettagli raffinati della struttura interna. Mentre TEM ha risoluzione superiore a quella luce o SEM e può essere utilizzato per risolvere strutture piccole come singoli atomi, ha tre inconvenienti principali: preparazione del campione vasto, un piccola campo di vista e una profondità di campo2,3. Anche se altri visualizzati protocolli esistano utilizzando SEM per esaminare specifiche cellule, organelli o tessuti4,5,6,7,8,9, 10 , questo protocollo è unico in quanto Descriviamo i metodi che possono essere ampiamente applicate a una vasta gamma di organismi per la valutazione morfologica.

SEM ha trovato grandi applicazioni per l'esame di materiali inorganici tra cui nanoparticelle11,12, polimeri13e numerose applicazioni in Scienze geologiche, industriale e materiale14, 15,16. In biologia, SEM è stato utilizzato a lungo come un metodo per l'esame di campioni biologici che vanno da singole proteine a interi organismi17,18. SEM è di particolare valore perché morfologiche particolari di superficie possono essere utilizzati per informare la scoperta scientifica. Analisi SEM sono un metodo veloce, economico e semplice per ottenere informazioni dettagliate sulla struttura, dimensioni e caratteristiche superficiali di una vasta gamma di campioni biologici.

Perché un SEM opera normalmente sotto alto vuoto (10-6 Torr minimo) per supportare un fascio coerente di elettroni ad alta velocità, liquidi (acqua, oli, alcoli) non sono consentito nel pozzetto di misurazione, come liquidi che impedire il formarsi di un vuoto. Così, tutti i campioni esaminati usando SEM devono essere disidratati, in genere utilizzando una serie di graduali etanolo seguita da un processo di essiccazione per rimuovere l'etanolo. Ci sono diversi metodi di essiccazione tessuti biologici per l'uso nel SEM, tra cui essiccazione all'aria, liofilizzazione, utilizzo di un dispositivo di punto critico essiccazione (CPD), o essiccazione utilizzando alcol t-butilico (TBA) o esametildisilazano (HMDS)19, chimica 20 , 21 , 22. più spesso, la selezione di un metodo di essiccazione è empirico poiché ogni campione biologico può reagire diversamente a ogni metodo di essiccazione. Per qualsiasi dato campione, tutti questi metodi può essere appropriati, quindi confrontare i vantaggi e gli svantaggi di ciascuno è utile per selezionare il metodo appropriato.

Mentre aria asciugatura un campione a temperatura ambiente o in un forno di essiccazione (60 ° C) è il metodo più semplice, maggior parte dei campioni biologici mostrano danni indotti da essiccazione come avvizzimento e collasso, con conseguente distorsione del campione. Il processo di liofilizzazione inoltre rimuove l'acqua (o ghiaccio) da un campione, ma richiede campioni per essere congelato flash e messo sottovuoto per rimuovere il ghiaccio tramite il processo di sublimazione, potenzialmente danneggiare il campione. Inoltre, l'utente deve avere accesso a un liofilizzatori. Il metodo più comunemente usato per la disidratazione di campioni per il SEM è punto critico essiccazione (CPD). In CPD, l'etanolo in un campione viene sostituita con liquido anidride carbonica (CO2) e, sotto specifica condizioni di temperatura e pressione conosciute come il punto critico (31,1 ° C e 1.073 psi), CO2 vaporizza senza creare tensione superficiale, quindi in modo efficace mantenendo le caratteristiche morfologiche e strutturali del campione. Mentre CPD è generalmente il metodo standard, ha diversi inconvenienti. In primo luogo, il processo richiede l'accesso a un punto critico asciugacapelli, che non è solo costoso, ma richiede anche l'uso di anidride carbonica liquida. In secondo luogo, la dimensione del campione che possa essere essiccato è limitata alla dimensione camera del punto critico asciugacapelli. In terzo luogo, lo scambio di liquidi durante CPD può causare turbolenze che possono danneggiare il campione.

Essiccazione chimica offre molti vantaggi rispetto CPD e serve come un'alternativa appropriata diventando ampiamente utilizzato nella preparazione del campione di SEM. L'uso di dehydrants chimici quali TBA e HMDS offre un'alternativa veloce, poco costoso e semplice ad altri metodi, pur mantenendo l'integrità strutturale del campione. Recentemente abbiamo dimostrato che non c'era nessuna differenza nell'integrità del tessuto o la qualità dell'immagine finale catturato quando si utilizza CPD o TBA come il metodo di essiccazione in adulto Drosophila tessuto retinico23. A differenza di CPD, TBA e HMDS non necessitano di uno strumento di essiccazione o liquido CO2 e non c'è nessuna limitazione sulla dimensione del campione per essere asciugato. Oltre a ottenere le sostanze chimiche, solo una cappa chimica standard e appropriati dispositivi di protezione individuale (guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza) sono necessari per completare il processo di essiccazione. Mentre TBA sia HMDS sono infiammabili, TBA è meno tossico e meno costoso (circa 1/3 del costo di HMDS) di HMDS.

In questo articolo, descriviamo come difficoltà, lavare, disidratare, asciugare, montare, polverizza il cappotto e tre tipi di organismi di immagine: cianobatteri (Toxifilum mysidocida, SP. Golenkina e an SP sconosciuto), due euglene dal genere Monomorphina (M. Enigmonia e M. pseudopyrum) e la Mosca della frutta (Drosophila melanogaster). Questi organismi rappresentano una vasta gamma di dimensioni (0,5 µm a 4 mm) e la diversità cellulare (unicellulare a pluricellulare), eppure tutte sono facilmente suscettibili di analisi SEM con solo piccole variazioni necessarie per la preparazione dei campioni. Questo protocollo descrive i metodi per l'utilizzo di disidratazione chimica e analisi SEM per esaminare i dettagli morfologici di tre tipi di organismi e sarebbe ampiamente applicabile all'esame di molti organismi e tipi di tessuto.

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Protocol

1. preparazione e la fissazione

  1. Preparare i cianobatteri.
    1. Coltivare colture unialgali in F/2 media24,25 ad una temperatura di 28 ° C su un 14:10 h ciclo scuro della luce. Trasferire cultura sufficiente in una microcentrifuga da 1,5 mL, in modo che dopo 15 min di stabilirsi, il pellet batterico è circa 0,05 mL di dimensioni. Rimuovere il supporto e sostituire con 1,5 mL di fissativo (1,25% glutaraldeide, 0.1 M tampone fosfato pH 7.0), delicatamente capovolgendo e incubare per una notte a 4 ° C.
    2. Trasferire le cellule fisse con una pipetta di vetro in un impianto di filtrazione di 10 mL (Figura 1) che contiene un filtro di 25 mm in policarbonato con 0,8 o 0,2 µm pori, a seconda delle dimensioni delle cellule. Il braccio laterale della guarnizione e imbuto con tappi di gomma per contenere la cultura nell'imbuto. Rimuovere il fissativo da dolce vuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi.
      Nota: Se la densità delle cellule sul filtro in policarbonato non è ottima, regolare la quantità di avvio impostazioni cultura utilizzate.
  2. Preparare le alghe unicellulare (euglene).
    1. Coltivare colture unialgali AF-6 media26 con 150 mL L-1 di mezzo commercialmente disponibile del suolo-acqua aggiunto ai media, ad una temperatura di 22 ° C su un 14:10 h ciclo scuro della luce. Trasferire 2 mL di densità bassa (OD600 < 0,5) cultura con una pipetta di vetro in un impianto di filtrazione di 10 mL (Figura 1) che contiene un filtro di 25 mm in policarbonato con 8 µm pori. Il braccio laterale della guarnizione e imbuto con tappi di gomma per contenere la cultura nell'imbuto.
      Nota: Se la densità delle cellule sul filtro in policarbonato non è ottima, regolare la quantità di avvio impostazioni cultura utilizzate.
    2. Aggiungere tre gocce di 4% tetrossido di osmio (OsO4) direttamente alla cultura e lasciar per incubare per 30 minuti, rimuovere il fissativo da dolce vuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi.
      Nota: OsO4 è una tossina acuta (cutanea, orale e inalazione routes), corrosivo per la pelle, dannoso per gli occhi e un sensibilizzante delle vie respiratorie. OsO4 deve essere gestita in una cappa chimica mediante appropriati dispositivi di protezione individuale, compresi guanti, camice e occhiali protettivi.
  3. Preparare la Drosophila melanogaster (moscerino della frutta)23.
    1. Anestetizzare mosche adulte utilizzando il 100% di anidride carbonica. Posto anestetizzati adulti (circa 10-30 mosche) in una provetta da centrifuga tappo a vite in plastica piccolo flaconcino o 1,5 mL.
    2. Immergere anestetizzati mosche in 1 mL di fissativo (1,25% glutaraldeide, tampone fosfato 0,1 M a pH 7,2) per 2 ore (o tutta la notte) a 4 ° C. Se le mosche galleggiano sulla superficie del fissativo, aggiungere poche gocce di 2,5% polietilene glicole etere tert-octylphenyl per indebolire la tensione superficiale del fissativo permettendo per immersione totale del tessuto. Rimuovere il fissativo usando una pipetta di vetro.

2. lavaggio e disidratazione

  1. Lavare e disidratare i cianobatteri.
    1. Lavare il campione fisso tre volte con 5 mL di tampone fosfato 0,1 M a pH 7.0 a temperatura ambiente per 10 min. ciascuno. Mantenere il matraccio ed imbuto tappato per contenere il lavaggio. Rimuovere ogni lavaggio delicato sottovuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi.
    2. Disidratare il campione mantenendo immersione continua usando una serie graduata di etanolo, per 10 min in un volume di 5 mL nell'imbuto. Le concentrazioni di etanolo graduato sono: 25%, 50%, 75%, 95% e 2 cambi di etanolo al 100%. Mantenere il pallone e l'imbuto tappato per contenere l'etanolo nell'imbuto, prevenire la perdita di entrambi tramite evaporazione e passivo flusso attraverso il filtro.
    3. Eliminare l'etanolo dal delicato vuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi. Trasferire il filtro/campione per un USA e getta in alluminio peso piatto contenente appena sufficiente etanolo al 100% per coprire il campione prima dell'essiccazione.
  2. Lavare e disidratare le alghe unicellulare (euglene).
    1. Lavare il campione fisso tre volte con 5 mL di acqua deionizzata a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno. Mantenere il matraccio ed imbuto tappato per contenere il lavaggio nell'imbuto. Rimuovere ogni lavaggio delicato sottovuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi.
    2. Disidratare il campione mantenendo immersione continua usando una serie graduata di etanolo per 10 min in un volume di 5 mL nell'imbuto. Le concentrazioni di etanolo graduato sono: 25%, 50%, 75%, 95% e 2 cambi di etanolo al 100%. Mantenere il pallone e l'imbuto tappato per contenere l'etanolo nell'imbuto, prevenire la perdita di entrambi tramite evaporazione e passivo flusso attraverso il filtro.
    3. Rimuovere l'etanolo dal delicato vuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi. Trasferire il filtro/campione per un USA e getta in alluminio peso piatto contenente appena sufficiente etanolo al 100% per coprire il campione prima dell'essiccazione.
  3. Lavare e disidratare Drosophila melanogaster (moscerino della frutta).
    1. Lavare il campione fisso tre volte con 1 mL di tampone fosfato 0,1 M a pH 7,2 a temperatura ambiente per 10 min in una microcentrifuga da 1,5 mL. Rimuovere ogni lavaggio con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non rimuovere le mosche.
    2. Disidratare il campione usando una serie graduata di etanolo, per 10 min in un volume di 1 mL in un tubo di microfuge. Le concentrazioni di etanolo sono: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Rimuovere l'etanolo con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non rimuovere le mosche.
    3. Conservare il campione nel tubo microcentrifuga da 1,5 mL con appena abbastanza etanolo al 100% per coprire il campione prima dell'essiccazione.

3. asciugatura

  1. Eseguire l'essiccazione chimica utilizzando t-butil alcool (TBA)27.
    1. Sostituire la soluzione di etanolo 100% con una soluzione di 1:1 di etanolo TBA e 100% per 20 min. sostituire la soluzione di 1:1 con TBA 100% per 20 min., ripetere due volte. Mantenere la soluzione a 37 ° C per non ricongelare TBA.
      Nota: 100% TBA ha un punto di congelamento di 25,5 ° C; non congelare la soluzione di 1:1 a temperatura ambiente. TBA è infiammabile, provoca grave irritazione oculare, è nocivo se inalato e può provocare irritazione delle vie respiratorie, sonnolenza o vertigini. TBA deve essere gestita in una cappa chimica mediante appropriati dispositivi di protezione individuale, compresi guanti, camice e occhiali protettivi.
    2. Trasferire il campione in TBA, se in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, in un piatto di pesatura di alluminio usa e getta. Una volta sul piatto di pesatura in alluminio TBA di rimuovere e sostituire con appena abbastanza fresco 100% TBA per coprire il campione. Congelare il TBA a 4 ° C per 10 min.
    3. Trasferire in un essiccatore sotto vuoto (campana) con confezioni di gel congelato per mantenere TBA congelato. Evacuare e mantenere il vuoto con una pompa rotativa a lasciare il campione a secco di sublimazione sottovuoto il TBA congelato per almeno 3 ore o durante la notte.
  2. Eseguire l'essiccazione chimica utilizzando esametildisilazano (HMDS)20.
    1. Sostituire la soluzione di etanolo 100% con una soluzione di 1:2 di HMDS ed etanolo al 100% per 20 min. sostituire la soluzione di 1:2 con una soluzione di 2:1 di HMDS ed etanolo al 100% per 20 min. 2:1 soluzione con 100% HMDS per 20 min. Ripetere un' volta.
      Nota: HMDS è infiammabile e una tossina acuta (via cutanea). HMDS deve essere gestita in una cappa chimica mediante appropriati dispositivi di protezione individuale, compresi guanti, camice e occhiali protettivi.
    2. Trasferire il campione in HMDS, se in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, in un piatto di pesatura di alluminio usa e getta. Una volta in alluminio peso piatto, sostituire il 100% HMDS con appena abbastanza fresco 100% HMDS per coprire il campione.
    3. Trasferire il campione nell'essiccatore non-vuoto di plastica o vetro con essiccante fresco (5-6 cm di profondità) e inserire in una cappa chimica. In alternativa, è possibile posizionare il campione direttamente in una cappa chimica a secco con un coperchio, ad esempio una casella, per evitare che i detriti cadano sul campione. Lasciare asciugare per 12-24 h il campione.

4. montaggio

  1. Montare i cianobatteri ed euglene.
    1. Etichettare il fondo sia un alluminio di 12 o 25 mm montaggio albero mozzo per indicare ciò che è stato posto sulla parte superiore. Il filtro in policarbonato con le cellule secche tagliate a quarti con una lama di rasoio pulito o bisturi se utilizza uno stub di 12 mm, o posizionare l'intero filtro se si utilizza uno stub di 25 mm.
    2. Posizionare ogni filtro adesivo o una scheda adesiva carbonio fissata alla parte superiore di uno stub.
  2. Montare Drosophila melanogaster (moscerino della frutta).
    1. Etichetta fondo lo stub di montaggio in alluminio per indicare ciò che è stato posto sulla parte superiore.
      Posizionare le mosche secche nella posizione desiderata nella scheda adesiva adesivo o carbonio fissata alla parte superiore di uno stub sotto un microscopio per dissezione con pinzette di precisione.
    2. Applicare l'adesivo conduttivo argento, cioè, argento vernice, intorno ai bordi esterni degli stub. Collegare la vernice d'argento per le mosche con uno stuzzicadenti per garantire la conducibilità. Non consentire la vernice di toccare l'area di imaging desiderato.
    3. Posizionare gli stub in una scatola di supporto albero mozzo e posizionare la casella di titolare stub aperto in un essiccatore. Consentire la vernice argento asciugare almeno 3 ore o durante la notte per ottenere i migliori risultati.

5. ricopertura

  1. Preparare l'apparato di rivestimento di polverizzazione eseguendo quattro o cinque vampate di gas argon. Se l'umidità è alta (cioè, l'aria della stanza si sente umida, di solito circa 50% di umidità relativa), eseguire vampate di sei o sette. Polverizzi ricoprire gli stub seguendo le istruzioni del produttore.
  2. I campioni di cappotto basati sull'esemplare utilizzato:
    1. Per i filtri con i cianobatteri, impostare il timer per sputter cappotto per 180 s dritto su.
    2. Per i filtri con alghe eucariote, cioè, euglene, impostare il timer per sputter cappotto per 120 s dritto su, quindi 20 s su tre lati ad un angolo di 45 °.
    3. Per campioni di grandi dimensioni, ossia, volare teste, impostare il timer per sputter cappotto per 60 s dritto, poi 30 s su ogni lato ad un angolo di 45 °.
      Nota: Dopo che il rivestimento è completo, Stub deve essere grigio chiaro a colori.

6. imaging

  1. Esempi di immagine utilizzando un microscopio elettronico a scansione che include un rivelatore elettronico secondario (SE).
    1. Per i cianobatteri, applicare le seguenti impostazioni: 3-5 kV tensione di acceleratore (AC), 20-30 sonda corrente (PC) e 5 mm di distanza di lavoro (WD). Per euglene, utilizzare 3 kV AC, 30 PC e 5mm WD. Per le mosche, utilizzare 5 kV AC, 30 PC e 5 a 10 mm WD.
  2. Regolare l'ingrandimento a seconda delle dimensioni del dettaglio o oggetto da visualizzare. Regolare il stigmators, diaframmi e messa a fuoco fino a produrre un'immagine chiara. Acquisire l'immagine utilizzando le impostazioni ad alta risoluzione secondo le istruzioni del produttore di SEM.

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Representative Results

I cianobatteri sono un procariotico gruppo di organismi che sono fondamentali per il globale del carbonio, ossigeno e azoto cicli28,29. Di circa 6000 specie di cianobatteri30, la maggior parte hanno una guaina mucillaginosa che coprono e collegare insieme le cellule e ad altre strutture31, che, insieme con la forma, può essere risolto microscopicamente32. Dimensione delle cellule, forma e pigmenti presenti distinguono singole specie e in habitat acquatici, possono essere visualizzati come cianobatterica "fioriture"28. La classificazione moderna cianobatterica combina tutte le caratteristiche morfologiche possibili utilizzando la microscopia chiara, TEM, SEM, nonché e dati molecolari33. Simile alla guaina di mucillagine di cianobatteri, pellicle strisce di euglenoid specie aiuto nella determinazione di filogenesi. Euglene sono flagellati acquatici che possiedono una grande quantità di diversità morfologiche e comportamentali, e analisi SEM si sono dimostrato utile nella classificazione specie distinte. In particolare, euglene possiedono strutture romanzo sotto loro membrana del plasma che sono composti di strisce parallele proteinico e microtubuli, chiamati il pellicle34,35,36. Il numero, disposizione e dimensioni delle strisce di pellicola sono critici comparatori morfologiche e insieme ai dati filogenetici molecolari, vengono utilizzati per costruire la filogenesi per Euglenozoa37.

Il primo passo nella preparazione sia di cianobatteri ed euglene richiede filtri gli organismi da loro crescita medio e avviene mediante l'assemblaggio di un impianto di filtrazione (Figura 1A). L'aspirazione viene utilizzato per tirare il mezzo attraverso un filtro in policarbonato, lasciando gli organismi sulla superficie del filtro. La dimensione dei pori del filtro in policarbonato dovrebbe essere selezionata in modo dagli organismi intatti non passerà attraverso (confronta Figura 1B e 1C). La figura 2 Mostra i risultati rappresentativi di tre generi differenti di cianobatteri. Due sono d'acqua dolce e uno è marino. Dettagli della cellula, compreso la forma e la consistenza della superficie sono visibili, come pure una guaina di mucillagine o proiezioni dalle cellule. La figura 3 illustra come SEM viene utilizzato per visualizzare le strisce di pellicola di due euglenoid diverse specie. La disposizione elicoidale della pellicola strisce che si fondono all'estremità posteriore per formare un coda aiuto nella determinazione di filogenesi quando si confrontano Monomorphina Enigmonia (Figura 3A e 3B) con Monomorphina pseudopyrum ( Figura 3 e 3D).

Oltre alle caratteristiche morfologiche che identificano la specie, la morfologia esterna di organismi modello come Drosophila melanogaster può essere utilizzata per identificare geni modificatori utilizzando i neuroni fotorecettori che comprendono il composto Drosofila occhio38. Poiché l'occhio è un tessuto non essenziali in mosche, è possibile esprimere proteine tossiche in cellule retiniche e utilizzare SEM per esaminare i cambiamenti morfologici che la modificazione genetica ha sull'occhio. Occhi normali sono caratterizzati da una matrice ordinata di setole e lenti (Figura 4A), tuttavia espressione di proteine associate con la malattia di Alzheimer creare quello che viene chiamato il fenotipo 'ruvido occhio' (Figura 4B). Geni che sopprimono (Figura 4) o migliorare (Figura 4), il fenotipo di occhio ruvido possono svolgere un ruolo fisiologico nella progressione della malattia e hanno potenziale per drug targeting39. Anche illustrato nella Figura 4 sono riportati esempi di potenziali insidie da evitare tra cui un esempio di struttura crollata dell'occhio da impropria tecnica di asciugatura (Figura 4E) e di elettroni carica dal rivestimento di polverizzazione insufficiente che appare durante acquisizione di immagini (Figura 4F e 4G).

Figure 1
Figura 1 : Rappresentazione schematica del impianto di filtrazione e SEM di un filtro in policarbonato. (A), questo apparecchio viene utilizzato per separare singoli o piccoli organismi monocellulari come cianobatteri ed euglene dal loro terreno di coltura. Applicazione di un vuoto al braccio laterale del pallone tirerà il contenuto dell'imbuto attraverso il filtro in policarbonato e nella base del pallone filtrazione, lasciando gli organismi sulla superficie del filtro. Filtro (B) SEM di un poro di 0,8 µm con nessun campione del campione è stato perso a causa di cattiva gestione. Barra della scala = 20 µm. (C) SEM di un filtrante di porosità 0,8 µm con cianobatteri presenti. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Micrografia SEM di cianobatteri. (A, B) Toxifilum mysidocida, una specie d'acqua dolce filamentosa da Colorado con una guaina visibile di mucillagine (M). Scala bar = 5 µm. (C, D) A d'acqua dolce Golenkina SP. dall'Ohio. Singole celle a volte formano colonie tenute insieme da un sottile strato di mucillagine (M). Filamento-come sporgenze (frecce bianche) si estendono per le singole celle. Barre di scala = 10 µm. (E, F) filamentose specie sconosciuta da un estuario di alta salinità nelle acque costiere del Texas. Singola cella (frecce nere) e la divisione delle cellule (frecce bianche) sono visibili. Barra della scala nel pannello E = 2 µm. barra della scala nel pannello F = 1 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Micrografia SEM della pellicola strisce da due specie di euglene. (A, B) Monomorphina Enigmonia. Immagini di ingrandimento basso (A) dell'intera cella. Barra della scala = 5 µm. (B) ad alto ingrandimento dell'estremità posteriore. Barra della scala = 3 µm. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. Immagini di ingrandimento basso (C) dell'intera cella. Barra della scala = 10 µm. (D) ad alto ingrandimento dell'estremità posteriore. Barra della scala = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Analisi SEM delle modificazioni fenotipiche dell'occhio Drosophila . Rispetto per l'aspetto esterno normale di lenti dell'occhio Vola (A) e la matrice ordinata di setole, espressione del tau proteina tossica provoca la morte dei neuroni del fotoricettore, generando il fenotipo 'ruvido occhio' (B). Espressione di geni modificatori che sopprimere (C) o migliorano (D) l'occhio ruvido tau fornisce la prova di geni che possono svolgere un ruolo nella neurotossicità di tau. Tecnica impropria durante l'asciugatura passaggi può portare a un collasso della struttura dell'occhio (E) mentre rivestimento insufficiente del campione causerà in carica, che appare come una banda nera (G) o bianco (F) durante l'acquisizione di immagini, come indicato dalla freccia. Barra della scala = 400 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui abbiamo descritto un protocollo utilizzando SEM per ottenere informazioni dettagliate sulle caratteristiche morfologiche esterne di tre tipi di organismi che gli altri possono applicare per esaminare le caratteristiche di molti tipi di organismi o tessuti. All'interno di ogni passaggio del protocollo, ci sono potenziali punti di errore che possono verificarsi e sono discussi in dettaglio di seguito.

Mentre i volumi per il fissativo e lavaggi dati qui sono specifici, in generale il fissativo e lavaggi dovrebbero essere 5-10 volte il volume del campione. Tutti i tempi di fissazione, lavaggio e disidratazione si basano sulla nostra esperienza, se dovessero sorgere problemi, ad esempio, avvizzimento del campione, potrebbe essere necessario aumentare i tempi di ogni fase di disidratazione o essiccamento. A seconda del vostro campione singola cella, potrebbe essere necessario fare sia una fissazione di glutaraldeide e una post-fissazione in tetrossido di osmio. Se una fissazione di duello è necessaria dopo punto 1.1.2 della procedura cianobatteri, coprire con un importo uguale 2% OsO4 nello stesso buffer e procedere dal punto 1.2.2 della procedura singola cella. Dal lavoro non mostrato qui, abbiamo trovato che Drosophila possono sia direttamente inserito nel fissativo seguente amputate o può essere congelato a tempo indeterminato a-20 ° C in un tubo di microfuge e posizionato in fissativo in un secondo momento senza differenza di finito qualità dell'immagine.

Durante le fasi di lavaggio e disidratazione, è imperativo per spostarsi all'interno della serie di etanolo graduato lentamente e senza saltare una concentrazione nota. Se i campioni sono disidratati troppo rapidamente, essa influisce negativamente i componenti strutturali sottostanti nel tessuto ed esemplare sarà avvizzire, appassire o collasso. Un esempio del collasso del tessuto è illustrato nella Figura 4E. Inoltre, per evitare l'introduzione di elementi quali ragruppare e appiattimento delle caratteristiche morfologiche, è fondamentale per lasciare solo abbastanza etanolo per coprire il campione tra i passaggi durante la disidratazione e asciugatura.

Quando si utilizza l'impianto di filtrazione, una goccia d'acqua sulla base conterrà il filtro in posizione durante il montaggio. Inoltre, il filtro deve essere posizionato con il lato lucido fino e tutti i liquidi devono essere aggiunti delicatamente, facendo attenzione a gestire il filtro con cura per evitare il dilavamento del campione. Anche se abbiamo trovato i risultati di asciugatura utilizzando HMDS o TBA per essere di pari qualità, si consiglia di utilizzare TBA: mentre HMDS sia TBA sono infiammabili, TBA è circa un terzo del costo e meno tossici rispetto HMDS.

Durante il montaggio quando utilizzando argento adesivo conduttivo (anche chiamato vernice argento), fare attenzione quando si applica come il vostro campione può essere facilmente coperto (sepolto) nella vernice, quindi oscurando dettagli raffinati nella morfologia. Polverizza rivestimento volte possono variare basato sul tuo campione, ed i valori qui riportati sono basati sulla nostra esperienza. Un potenziale esito negativo del rivestimento insufficiente polverizzazione è un fenomeno chiamato in carica, che spesso appare come una linea di bianca o nera (a volte un flash) nell'immagine finale (per esempi, vedere Figura 4F e G ). Se la quantità di carica osservata è minima, è possibile mitigare gli effetti regolando i vari parametri del microscopio, come ad esempio abbassando la tensione accelerare o fascio attuale, aumentando la forza di lente condensatore, e/o usando un più piccolo apertura dell'obiettivo. Maggior parte SEMs utilizzato per campioni biologici sono rivelatori di elettroni secondari, tuttavia alcuni SEMs può anche essere dotati con rilevatori di backscatter o rilevatori ambientali secondaria dell'elettrone, che può essere regolata per diminuire o eliminare gli effetti del minimo ricarica. Se gli effetti di ricarica sono più pronunciati, è probabile che vi sia scarsa messa a terra del campione o troppo poca polverizza rivestimento per produrre gli elettroni secondari, causando gli elettroni caricati costruire nel campione e uscirà spontaneamente, producendo distorsione dell'immagine durante l'acquisizione. Ricarica pronunciate più spesso viene risolto con un rivestimento più spesso o meglio messa a terra con vernice d'argento. Perché sia troppo e troppo poco polverizza rivestimento può compromettere la qualità dell'immagine, si consiglia di ottimizzare la quantità di rivestimento applicato regolando le variabili di tempo (da 10 a 180 s) e pressione (70-150 mTorr) della polverizza coater per raggiungere un optim al rivestimento. Come il rivestimento non può essere rimosso una volta applicato al campione, un'esecuzione dei test è raccomandato con un singolo campione prima di tutti i campioni del rivestimento.

Parametri di SEM ad esempio accelerando tensione (kV), sonda corrente (PC), e distanza di lavoro (WD) deve essere regolato per ottenere la migliore immagine possibile, come le impostazioni date qui sono suggerite a partire i parametri in base alla nostra esperienza. Mentre la qualità del campione è dipendente la cura nella preparazione, la qualità dell'immagine finale si basa sull'esperienza e l'abilità dell'operatore di SEM. Così, si consiglia di lavorare con un tecnico di SEM o spendere tempo a sviluppare le vostre abilità di SEM. Tutti i dati (compreso preparazione del campione e imaging) indicati in questa carta sono stati generati da studenti universitari nel programma di biologia microscopia alla CMU, con la Guida di facoltà e il nostro tecnico di microscopia.

I protocolli descritti qui includono l'uso di sostanze chimiche potenzialmente nocive, e le misure di sicurezza appropriate devono essere sempre osservate per proteggere gli utenti, in particolare gli studenti che possono essere la gestione di queste sostanze chimiche. Mentre i protocolli specificano le preoccupazioni di sicurezza associate a ogni prodotto chimico al primo utilizzo, gli utenti dovrebbero sempre: (1) utilizzare una cappa chimica, (2) avere accesso a una doccia di sicurezza e lavaggio di emergenza occhio, (3) utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale tra cui guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhio protezione e (4) sapere dove trovare le procedure di sicurezza scritta comprensivi di gestione delle procedure, indicate utilizzano aree, versare, procedure di decontaminazione e procedure di smaltimento dei rifiuti.

In conclusione, questi organismi illustrano come informazioni sulla topografia tridimensionale delle superfici esterne di ciascuno sono utile per analisi filogenetica di raggruppamento o modificatore. Per i cianobatteri, caratteristiche determinate da SEM possono essere utilizzati in combinazione con dati aggiuntivi da microscopia chiara, TEM, e gli studi molecolari per identificare, caratterizzare e denominare i cianobatteri. Per euglene, il numero, larghezza, arrangiamento (elicoidale o dritto) e ornamenti, se presente, della pellicola strisce possono essere utilizzati con altri dati morfologici, e se necessari dati molecolari, per identificare, caratterizzano ed euglene il nome. Inoltre, possono essere preparati ed esaminati in un modo simile per determinare le caratteristiche morfologiche esterne quali flagelli, alimentazione struttura, ornamenti esterni o dettagli di altri tipi di alghe unicellulari e protozoi o micro-invertebrati appendici in caso di micro-invertebrati. Infine, SEM ha vaste applicazioni per l'esame di particolari morfologici, come l'occhio del sistema modello drosofila, caratterizzare geni modificatori della patologia delle malattie. I protocolli descritti qui utilizzano organismi che variano notevolmente per quanto riguarda la complessità, ma tutti sono suscettibili di analisi SEM per raccogliere utili informazioni morfologiche che sono fondamentale per la scoperta scientifica che attraversa molti diversi lelettronica di biologia.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione per MLS e un estate Scholar Award a MAK dal ufficio di ricerca e studi universitari presso l'Università centrale del Michigan. I cianobatteri sono stati forniti dal Zimba e laboratorio di plancton, parte del centro per studi costieri, Texas A & M University al Corpus Christi. Euglene sono stati forniti dal laboratorio Triemer, Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

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Biologia numero 143 scansione microscopia elettronica (SEM) cianobatteri euglenoid moscerino della frutta Drosophila punto critico essiccazione (CPD) esametildisilazano (HMDS) alcol t-butilico (TBA)
Preparazione di organismi procarioti ed eucarioti mediante essiccazione chimica per analisi morfologica in microscopia elettronica (SEM)
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