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Biology

原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM 解析、種の同定や表現型差別を支援する効果的な方法です。このプロトコルは 3 つの代表的なタイプの菌の形態学的詳細を調べる方法について説明し、多くの個体の特徴を調べることに広く適用されると組織型。

Abstract

走査電子顕微鏡 (SEM) は、個々 のタンパク質から細胞、組織、器官、でも全体の有機体に至るまでの生物的標本を研究に適用されている広く利用可能な技術です。このプロトコルが SEM. を用いた原核生物と真核生物のイメージングへの応用と t-ブチル アルコール (TBA) ヘキサメチルジシラザン (HMDS) 2 つの化学的乾燥方法に焦点を当ててください。この記事で述べる修正、洗浄、脱水、乾燥、マウント、スパッタ コート、およびイメージの 3 つのタイプの菌する方法: シアノ バクテリア (Toxifilum mysidocida、 Golenkina sp、不明な sp)、2 つの euglenoids 属Monomorphina から(M. aenigmatica と m. pseudopyrum) とフルーツ フライ (ショウジョウバエ)。このプロトコルの目的は、高速、安価で、シンプルな構造、サイズ、および有機体のための大規模な範囲に広く適用できる標本の表面特性について詳細な情報を取得するメソッドを記述する形態評価。このプロトコルを正常に完了は、他の SEM を使用して彼らのシステムにこれらの技術を適用することによってサンプルを視覚化することができます。

Introduction

走査型電子顕微鏡 (SEM) は、サンプル1の地形と形態を示す二次電子から画像を生成するのに高エネルギー電子の集束ビームを使用します。SEM は、直接サンプル、提供のより高い解像度と表面構造三次元形状の物理サイズと光学顕微鏡と比較してフィールドの大きい深さを決定する使用できます。電子顕微鏡検査 (EM) の別のフォーム、透過型電子顕微鏡 (TEM) は、内部構造の細部のイメージを生成するサンプルを通過集中電子を使用します。TEM 光または SEM より高い解像度があり単一原子のような小さな構造を解決する使用ことができます、それは 3 つの主要な不利な点: 広範なサンプル準備、小さな視野とフィールド2,3の浅い深さ。その他可視化プロトコルが SEM を使用して特定の細胞、細胞小器官や組織4,5,6,7,8,9,を調べる存在する10 、このプロトコルは、固有生物形態学的評価のための大規模な範囲に広く適用することができる方法について述べる。

SEM は、地質、産業、科学、材料14,のナノ粒子11,12, ポリマー13, と多数のアプリケーションを含む無機材料を検査するための広範なアプリケーションを発見した15,16。生物学で、SEM は長い個々 の蛋白質から全体生物17,18に至るまで生物学的サンプルを調べるための方法として使用されています。SEM は、科学的発見を知らせるため表面の形態学的詳細を使用できるため、特定の値が。SEM 解析は、構造、サイズ、および幅広い生体試料の表面特性について詳細な情報を取得する高速、安価で、簡単な方法です。

SEM は、一貫した高速電子ビームをサポートする高真空 (10-6 Torr の最小) の下で通常動作するため液体 (水、油、アルコール) は許可されません試料室の真空が形成するを防ぐ液体として。したがって、SEM を用いてすべてのサンプルは、通常乾燥プロセスによって続く傾斜エタノール シリーズを使用したエタノールを削除、脱水される必要があります。乾燥空気乾燥、凍結乾燥、臨界点乾燥 (CPD) デバイス、または化学 t-ブチル アルコール (未定) またはヘキサメチルジシラザン (HMDS)19、を使用して乾燥の使用など、SEM で使用するため生体組織のいくつかの方法があります。20,21,22. 各生物学的サンプルが異なるそれぞれの乾燥方法に反応するのでほとんどの場合、乾燥方法の選択は経験的。任意の指定されたサンプルのすべてのこれらのメソッドがあります適切な長所とそれぞれの短所を比較することは適切な方法を選択する際に便利ですので。

部屋の温度や乾燥炉 (60 ° C) 試料の乾燥空気は、最も簡単な方法は、ほとんどの生物学的サンプル shriveling など乾燥によるダメージを表示する、折りたたむには、供試体の歪みの結果します。凍結乾燥のプロセスも水 (または氷)、サンプルから削除しますが、フラッシュ凍結サンプルを必要として有害なサンプル、昇華のプロセスを介して氷を削除する真空下に置かれます。さらに、ユーザーは、エアカーテンへのアクセスに必要です。SEM のためのサンプルをステータス退避に最も一般的に使用されるメソッドは、臨界点乾燥 (CPD) です。液体の二酸化炭素 (CO2) と、特定の温度と臨界点 (31.1 ° C、1,073 psi) CO2気化により表面張力を作成せずとして知られている圧力条件の下で、CPD のサンプルでエタノールが置き換えられますサンプルの形態や構造の特徴を効果的に維持します。CPD は、標準的な方法では一般的に、いくつかの欠点があります。最初に、プロセスでは、臨界点乾燥機は高価なだけでなく、また液体の二酸化炭素の使用が必要になりますへのアクセスが必要です。第二に、乾燥することができますサンプルのサイズは、臨界点乾燥機のチャンバー サイズに制限されます。第三に、CPD の中に液体の交換は、サンプルを傷つけることができる乱流を可能性があります。

化学乾燥 CPD に比べて多くの利点を提供しています、SEM 試料の普及に伴い、適切な代替として機能します。未定、HMD など化学の dehydrants の使用は、サンプルの構造の整合性を維持しながら他の方法を高速、安価で、シンプルな代替を提供しています。我々 は最近、組織または大人のショウジョウバエ網膜組織23の乾燥方法として CPD または未定を使用する場合に、最終的な画像品質の整合性の違いがなかったことを示した。CPD とは異なり乾燥器や液体 CO2未定と HMD は必要ありません、乾燥試料のサイズに制限はありません。化学物質を取得、に加えて標準の化学発煙のフードと適切な個人用保護具 (手袋、白衣、安全メガネ) だけは乾燥のプロセスを完了する必要があります。TBA は毒性の少ないより少なく高価な未定と HMD は可燃性ですが、(約 1/3 HMD のコスト) HMD より。

この記事で述べる修正、洗浄、脱水、乾燥、マウント、スパッタ コート、およびイメージの 3 つのタイプの菌する方法: シアノ バクテリア (Toxifilum mysidocida、 Golenkina sp、不明な sp)、2 つの euglenoids 属Monomorphina から(M. aenigmatica と m. pseudopyrum) とフルーツ フライ (ショウジョウバエ)。これらの生物は、サイズ (4 mm 0.5 μ m) と (単細胞多細胞に) 細胞の多様性の広い範囲を表すまだすべては、だけ小さな変化が切片作製に必要な SEM 解析へ簡単に従う義務があります。このプロトコルは 3 つのタイプの菌の形態学的詳細を調べます化学脱水と SEM 分析を使用する方法について説明し、多くの生物を調べることに広く適用されると組織型。

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Protocol

1. 準備と固定

  1. シアノ バクテリアを準備します。
    1. 14:10 h に 28 ° C の温度で F/2 メディア24,25 unialgal 文化を成長ライト暗い周期。後 15 分を解決するを許可すると、細菌のペレットがサイズで約 0.05 mL、1.5 mL 遠心チューブに十分な文化を転送します。メディアを取り出し、1.5 ml (1.25% グルタルアルデヒド、0.1 M のリン酸バッファー pH 7.0) は定着剤の交換、優しく数回を反転、4 ° C で一晩インキュベート
    2. セルのサイズによって、0.8 または 0.2 μ m 孔を持つポリカーボネートの 25 mm フィルターを含むガラス ピペット 10 mL ろ過装置 (図 1) に、固定セルを転送します。側の腕を密封し、ファンネルの文化を含むゴム製ス トッパーと漏斗します。両方のストッパーを削除した後穏やかな真空ろ過フラスコに定着剤を削除します。
      注: ポリカーボネート フィルターの細胞密度が最適でない場合使用されるカルチャを開始する量を調整します。
  2. 単細胞藻類 (euglenoids) を準備します。
    1. AF 6 メディア26 14:10 h に 22 の ° C の温度で、メディアに追加市販土壌水分中の 150 mL L-1 unialgal 文化を育てる光暗いサイクル。低密度の 2 mL を転送 (外径600 < 0.5) ガラス製ピペット 10 mL ろ過装置 (図 1) に 8 μ m の細孔を有するポリカーボネートの 25 mm フィルターを含む文化。側の腕を密封し、ファンネルの文化を含むゴム製ス トッパーと漏斗します。
      注: ポリカーボネート フィルターの細胞密度が最適でない場合使用されるカルチャを開始する量を調整します。
    2. 文化に直接 4% 四酸化オスミウム (OsO4) の 3 滴を追加し、インキュベート 30 分両方のストッパーを削除した後穏やかな真空ろ過フラスコに定着剤を削除することができます。
      注: OsO4は急性の毒素 (皮膚、口腔と吸入ルート)、目および呼吸器感作性にダメージを与える、皮膚を腐食。OsO4は、手袋、白衣、眼の保護など適切な個人用保護具を使用して化学の発煙のフード処理必要があります。
  3. ショウジョウバエ(ミバエ)23を準備します。
    1. 100% の二酸化炭素を使用して成虫を麻酔します。場所は、大人 (10 に 30 ハエ) 小さなプラスチック スクリュー キャップ バイアルまたは 1.5 mL 遠心管中を麻酔しました。
    2. 4 ° C で 1 ml 2 h (または夜通し) 漬けます (1.25% グルタルアルデヒド、0.1 M のリン酸バッファー pH 7.2) の麻酔のハエを浸すハエは定着剤の表面に浮かぶ場合、は、組織の合計浸漬を可能にする固定液の表面張力を弱めるため 2.5% ポリエチレング リコール tert-オクチルフェニル エーテルを数滴を追加します。ガラス ピペットを使用して定着剤を削除します。

2. 洗濯・脱水

  1. 洗って、シアノ バクテリアを脱水します。
    1. 0.1 M リン酸バッファー pH 7.0 10 min. の室温で 5 mL で 3 回固定サンプルを洗います。フラスコと漏斗栓洗浄を保持するために維持します。両方のストッパーを削除した後、穏やかな真空ろ過フラスコで各洗浄を削除します。
    2. 目標到達プロセスの 5 mL の量で 10 分間傾斜エタノール シリーズを使用して連続浸漬を維持しながらサンプルを脱水します。傾斜エタノール濃度: 25%、50%、75%、95%、100% のエタノールの 2 つの変更。両方経由でフラスコと漏斗に損失を防止する漏斗にエタノールを含んでいる栓を保つ蒸発とパッシブ フィルターを通過。
    3. 穏やかな真空ろ過フラスコにエタノールを両方のストッパーを削除した後削除します。フィルター/サンプルを乾燥する前にサンプルをカバーするだけの十分な 100% エタノールを含んでいる皿の重量を量る使い捨てアルミに転送します。
  2. 洗って、単細胞藻類 (euglenoids) を脱水します。
    1. 10 分の室温で 5 mL の脱イオン水を使用して 3 回固定サンプルを洗ってください。フラスコと漏斗漏斗で洗浄を含む栓をしてください。両方のストッパーを削除した後、穏やかな真空ろ過フラスコで各洗浄を削除します。
    2. 目標到達プロセスの 5 mL の量で 10 分間傾斜エタノール シリーズを使用して連続浸漬を維持しながらサンプルを脱水します。傾斜エタノール濃度: 25%、50%、75%、95%、100% のエタノールの 2 つの変更。両方経由でフラスコと漏斗に損失を防止する漏斗にエタノールを含んでいる栓を保つ蒸発とパッシブ フィルターを通過。
    3. 穏やかな真空ろ過フラスコにエタノールを両方のストッパーを削除した後削除します。フィルター/サンプルを乾燥する前にサンプルをカバーするだけの十分な 100% エタノールを含んでいる皿の重量を量る使い捨てアルミに転送します。
  3. 洗いし、脱水ショウジョウバエ(ミバエ)。
    1. 1.5 mL 遠心チューブに 0.1 M リン酸バッファー pH 7.2 10 分室温で 1 mL で 3 回固定サンプルを洗います。ハエを削除しないように注意されているガラス ピペットで各洗浄を削除します。
    2. および microfuge の管に 1 mL の量で 10 分間傾斜エタノール シリーズを使用してサンプルを脱水します。エタノール濃度: 25%、50%、75%、80%、95%、100%。ハエを削除しないように注意されているガラス ピペットでエタノールを削除します。
    3. 乾燥する前にサンプルをカバーするだけの十分な 100% エタノールで 1.5 mL 遠心チューブにサンプルを保持します。

3. 乾燥

  1. T-ブチル アルコール (TBA)27を使用して化学乾燥を実行します。
    1. 100% エタノール溶液を 20 分 20 分 100% 未定で 1:1 ソリューションを二度繰り返し置換未定と 100% エタノールの 1:1 のソリューションに置き換えます。未定が凍結しないように、37 ° C でのソリューションを保持します。
      注: 100% 未定は 25.5 ° C の凍結ポイント1:1 の解決策は、室温では停止しません。未定は可燃性、眼に対する重篤な炎症の原因、吸入した場合有害である、めまいや眠気、呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。未定は、手袋、白衣、眼の保護など適切な個人用保護具を使用して化学の発煙のフード処理必要があります。
    2. 使い捨てアルミ皿の重さに 1.5 mL 遠心チューブの場合は未定でサンプルを転送します。一度アルミ計量皿、未定を削除し、サンプルをカバーするだけの十分な新鮮な 100% 未定で置き換えます。10 分の 4 ° C で TBA を凍結します。
    3. 未定凍結を保つために冷凍ジェル パックの真空デシケータ (ベルジャー) に転送します。避難し、少なくとも 3 時間冷凍未定の真空昇華乾燥または一晩にサンプルを許可するロータリー ポンプと真空を維持します。
  2. ヘキサメチルジシラザン (HMDS)20を使用して化学乾燥を実行します。
    1. HMD の 1:2 の溶液で 100% エタノール溶液を交換して、100% のエタノール 20 分の HMD の 2:1 の溶液で 1:2 ソリューションを置き換えるし、100% のエタノール 20 分の 2:1 の交換により、100 %20 分 HMD をもう一度繰り返します。
      注: HMDS は可燃性と急性毒素 (皮膚ルートです)。HMD は、手袋、白衣、眼の保護など適切な個人用保護具を使用して化学の発煙のフード処理必要があります。
    2. 1.5 mL 遠心チューブの場合使い捨てアルミ皿の重さに HMD でサンプルを転送します。アルミ 100% を置き換える計量皿、一度 HMD だけで十分な新鮮な 100% のサンプルをカバーする HMD。
    3. 新鮮な乾燥剤 (5-6 cm) をプラスチックやガラス、非真空デシケータにサンプルを転送し、化学の発煙のフードで配置。また、サンプルの上に落ちてから破片を防ぐために、ボックスなどの緩やかなふた付け乾燥させる化学発煙のフードに直接サンプルを配置します。12 ~ 24 時間乾燥するサンプルを許可します。

4. 取付

  1. シアノ バクテリアと euglenoids をマウントします。
    1. 何が上に配置されていることを示すようにスタブをマウント 12 または 25 mm のアルミニウムの下部にラベルを付けます。12 mm スタブを使用して場合、きれいなかみそり刃またはメスの四分の一にカット乾燥細胞ポリカーボネート フィルターまたは 25 mm スタブを使用して場合、全体のフィルターを配置します。
    2. 接着剤またはスタブの上部に固定されている炭素接着] タブで各フィルターを配置します。
  2. マウントショウジョウバエ(ミバエ)。
    1. 何が上に配置されているを示すアルミニウム実装スタブの下にラベルを付けます。
      乾燥したはえを精密ピンセットで解剖顕微鏡の下でスタブの上部に固定接着剤やカーボンの接着] タブで目的の位置に配置します。
    2. 銀の導電性接着剤、すなわち、銀塗装、スタブの外側のエッジの周りを適用します。導電性を確保するためにつまようじを使用してハエにシルバーのペイントを接続します。塗装目的の撮像領域をタッチをできないようにします。
    3. スタブ ホルダー ボックスにスタブを配置し、デシケータでオープン スタブ ホルダー ボックスを配置します。少なくとも 3 時間を乾燥または最良の結果のために一晩にシルバーのペイントを許可します。

5. スパッタ コーティング

  1. アルゴンのガスの 4 ~ 5 フラッシュを実行することによりスパッタ コーティング装置を準備します。湿度が高い場合 (すなわち部屋の空気が湿った、通常について感じている相対湿度 50%)、6 ~ 7 のフラッシュを実行します。スパッタは、製造元の指示に従ってスタブをコートします。
  2. 標本に基づいてコート サンプルが使用されます。
    1. シアノ バクテリア フィルター, 上 180 s ストレート コートをスパッタするタイマーを設定します。
    2. 真核生物の藻類、すなわちeuglenoids のためのフィルター 120 s、ストレート、20 s は 45 ° の角度で 3 つの側面のためのコートをスパッタするタイマーを設定します。
    3. すなわち、飛ぶヘッド、大型サンプルの 45 ° の角度で両側に 60 s、ストレート、30 秒のためのコートをスパッタするタイマーを設定します。
      注: コーティングが完了すると、スタブは色でライトグレーをする必要があります。

6. 画像

  1. 画像のサンプル走査型電子顕微鏡によるには二次電子 (SE) 検出器が含まれます。
    1. シアノ バクテリア、設定: 3-5 kV 加速電圧 (AC)、20-30 プローブ電流 (PC)、5 ミリメートル作動距離 (WD)。Euglenoids、3 kV AC、30 を使用して PC と 5 mm WD。ハエ、5 kV AC、30 を使用して PC と 5 〜 10 mm WD。
  2. 詳細または視覚化されるオブジェクトのサイズに応じて倍率を調整します。明確なイメージが作成されるまで、stigmators、開口部とフォーカスを調整します。SEM の製造元の指示に従って高解像度の設定を使用してイメージをキャプチャします。

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Representative Results

シアノ バクテリアは原核生物地球規模の炭素、酸素、および窒素サイクル28,29に重要な生物群が。シアノ バクテリア30推定 6000 種のほとんどをカバーし、セルを一緒に接続する粘液質の鞘があるし、他の構造に31、図形と一緒にすることができます解決顕微鏡32。セルのサイズ、形状、および顔料の存在、個々 の種を区別し、水生生息地では、シアノ バクテリア「花」28として視覚化できます。現代のシアノ バクテリアの分類は、光学顕微鏡、電子顕微鏡、SEM と分子データ33を使用可能なすべての形態学的特徴を兼ね備えています。藍藻類の粘質物シースと同様に、ペリクルは、系統の決定 euglenoid 種援助のストリップします。Euglenoids 形態と行動の多様性の多くを所有している水生ケイソウ、SEM 分析異なる種を分類するのに役立っています。具体的には、euglenoids は、並列タンパク質ストリップとペリクル34,35,36と呼ばれる、微小管で構成されるその膜の下に特異な構造を持っています。番号、整理及びペリクル ストリップのサイズは、重要な形態のコンパレータは、分子系統学的データと共にユーグレノゾア37系統を構築する使用されます。

シアノ バクテリアと euglenoids の両方の準備の第一歩はその成長媒体から生物をフィルタ リングを必要とし、ろ過装置 (図 1 a) を組み立てることによって達成されます。誤嚥は、ポリカーボネート フィルター、フィルターの表面に生物を残して、中をプルする使用されます。そのまま生物を通過しないような、ポリカーボネート フィルターの細孔径を選択する必要があります (図 1 bと1 Cを比較)。図 2は、藍藻類の 3 つの異なる属の代表的な結果を示しています。2 は淡水、海洋であります。表面の形状とテクスチャを含むセルの詳細は表示だけでなく、粘液や細胞からの神経投射の鞘。図 3は、SEM を使用して、2 つの異なる euglenoid 種のペリクル ストリップを視覚化する方法を示します。ペリクルのラセン配置系統定量尾援助を形成するMonomorphina aenigmatica (図 3 aと3 b) とMonomorphina pseudopyrum (を比較するときに後部の端にそのマージをストリップします。図 3と3 D)。

種を識別する形態的特徴、に加えて、ショウジョウバエなどのモデル生物の外部形態は化合物を構成する光受容器ニューロンを用いた遺伝的修飾因子を識別するために使用できます。ショウジョウバエ目の38。目はハエの非本質的な組織なので、網膜細胞に有害な蛋白質を表現し、遺伝子組み換えが目に形態学的変化を調べる SEM を使用することが可能です。通常のフライの目は、しかし、アルツハイマー病に関連するタンパク質の発現は「粗目」表現型 (図 4 b) と呼ばれるものを作成する毛と (図 4 a) レンズの配列によって特徴付けられます。(図 4) を抑制または荒い目の表現型 (図 4) を高める遺伝子が病気の進行に生理学的な役割を果たすし、ターゲティング39の可能性があります。不適切な乾燥技術 (図 4E) と電子が不足しているスパッタ コーティング中に表示されるからの充電から目の折りたたまれた構造の例を含むを避けるために潜在的な落とし穴の例をまた図 4に示す画像の取得 (図 4 fと4 G)。

Figure 1
図 1: SEM のポリカーボネート フィルターのろ過装置の略図。(A) この装置はシアノ バクテリアやその成長媒体から euglenoids など小規模または単一の単細胞生物を区切るために使用します。ポリカーボネート フィルターとフィルターの表面に生物を残してろ過フラスコの底に、真空のフラスコの側面のアームへの応用は目標到達プロセスの内容を取得します。サンプルとして抽出 (B) SEM 0.8 μ m 孔のフィルターは、流用のため失われました。スケール バー = 20 μ m. (C) SEM シアノ バクテリア存在で 0.8 μ m 孔フィルターの。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: シアノ バクテリアの SEM 写真。(A, B)Toxifilum mysidocida、糸状の淡水種コロラド州から目に見える鞘と質物 (M)。スケール バー = 5 μ m. (C, D) A 淡水Golenkina sp. オハイオ州から。個々 の細胞時々 コロニーを形作る粘液 (M) の薄層によって一緒に保持します。フィラメントのような突起 (白い矢印) を個々 のセルに拡張します。スケール バー = 10 μ m (E, F) 不明な糸状種テキサス沿岸海域における高塩分河口から。個々 のセル (黒い矢印) と分裂細胞 (白い矢印) が表示されます。パネル E のスケール バー パネル F で 2 μ m スケール バーを = = 1 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: Euglenoids の 2 種のストリップをペリクルの SEM 写真。(A, B)Monomorphina aenigmatica。(A) セル全体の画像を低倍率。スケール バーの後端の 5 μ m. (B) 高倍率を =。スケール バー 3 μ m. (C, D) = Monomorphina pseudopyrum。(C) 低倍率セル全体像スケール バーの後端の 10 μ m. (D) 高倍率を =。スケール バー = 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4:ショウジョウバエの目の形質改変の SEM 解析します。毛の配列と (A) のフライの目のレンズの通常の外観と比較して、有毒なタンパク質 tau の式は「粗目」表現型 (B) を生成する光受容器ニューロン死を発生します。(C) を抑制または (D) タウの大まかな目を高める遺伝的修飾因子の発現は、タウ神経毒性の役割を担うかもしれない遺伝子の証拠を提供します。サンプルの不十分なコーティングが引き起こす充電、画像取り込み、中にホワイト (F) または黒 (G) のバンドとして出現する手順を乾燥中に不適切な手法が (E) の目の構造の崩壊につながることができます。矢印で表示されます。スケール バー = 400 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

ここで我々 は生物や組織の多くの種類の機能に適用できる他の有機体の 3 種類の外部形態的特性について詳細な情報を取得する SEM を使用してプロトコルを記述しました。プロトコルの各ステップ内では、潜在的なエラーで発生する可能性があり、詳細は以下で説明している点があります。

定着剤と洗浄ここに与えられたボリュームが特定は一般に定着剤と洗浄が試料量 × 5-10 をする必要があります。などの問題が発生した場合、すべて固定・洗濯・脱水時間が私たちの経験に基づいていますサンプルの shriveling、脱水や乾燥の各ステップの時間を増加する必要があります。あなたの 1 つのセルのサンプルによってグルタルアルデヒド固定と四酸化オスミウムのポスト固定の両方を行う必要があります。決闘固定がある場合必要なシアノ バクテリアの 1.1.2 手順後カバー同量 2% 同じバッファーで OsO4と単一のセルの手順の手順 1.2.2 から進みます。仕事はここでは示しませんからことショウジョウバエできますか定着性の次の anesthetization に直接配置または-20 ° c および microfuge の管で無期限に凍結でき完成に違いがないと後で定着剤に配置を発見しました。画質。

洗濯と脱水の手順の中にゆっくりと注意集中を飛ばすことがなく傾斜エタノール シリーズを通じて移動することが不可欠です。サンプルがあまりにも速く脱水状態、組織の基になる構造のコンポーネントに悪影響を与えるそれと標本が縮ませるだろう、枯れる、または折りたたみます。図 4Eに組織崩壊の例を示します。さらに、凝集、形態学的特徴の平坦化などの成果物の導入を防ぐためには、脱水時にステップ間サンプルをカバーする十分なエタノールだけを残すために重要と乾燥です。

ろ過装置を使用している場合をアセンブルするとき、ベースの水を一滴は場所にフィルターを保持します。また、フィルターは光沢のある側を上に配置する必要があります、サンプルを洗い流すように注意してフィルターを処理するように注意しながら、穏やかにすべての液体を追加必要があります。同等の品質の HMD または未定のいずれかを使用して乾燥の結果見出した、未定を使用してお勧め: 約 3 分の 1 HMD よりコスト ・少ない毒性 HMD と未定は可燃性ですが、未定であります。

あなたのサンプルが簡単に (埋没) 塗料で覆うことが適用するとき注意銀導電性接着剤 (また呼ばれるシルバー塗装) を使用して、実装時それによって不明瞭形態の細部を使用。スパッタ コーティング時間は、サンプルによって異なりますが、ここで指定された値の経験に基づいています。不十分なスパッタ コーティングの 1 つの潜在的な否定的な結果は、充電と呼ばれる現象最終的なイメージで、しばしば白または黒の線 (時々 フラッシュ) として表示される (例、図 4 fおよびGを参照)。加速電圧を下げるなど、さまざまな顕微鏡パラメーターを調整することにより緩和するビーム電流、コンデンサー レンズ強度の増加および/またはより小さいを使用して可能な限り観測充電量は最小限場合があります。対物レンズ有効径。ほとんど SEMs 生体試料用二次電子検出器をあるは、しかし、いくつかの Sem がありますまた後方散乱検出器または環境の二次電子検出器を減らすか、最小限の影響を排除するはすべて調整できますが装備されます。充電中です。充電の効果がより顕著に、サンプルの貧しい接地がある可能性か、少なすぎる場合は標本で構築し、自発的に解放される、帯電した電子を引き起こして、生産二次電子を生成するコーティングをスパッタします。集録中に画像の歪み。ほとんどの顕著な充電、厚いコーティングまたは銀の塗料で良い接地で解決。すぎると少なすぎるのスパッタ コーティングは、画像の品質を悪影響ことができますため、時間の変数を調整することによって適用される塗料の量を最適化するためにお勧め (10 に 180 s) と圧力 (70 に 150 mTorr)、オプティムを達成するためにスパッタ コーターal コーティング。コーティングは、一度のサンプルに適用削除できません、テストの実行をすべてのサンプルをコーティングする前に 1 つのサンプルを推奨します。

SEM パラメーターなど加速電圧 (kV) で、プローブ電流 (PC) と作動距離 (WD) を調整して、我々 の経験に基づいてパラメーターを開始ここで指定された設定が示唆されて、最高の画像を実現する必要があります。サンプルの品質はケアの準備で撮影に依存して、最終的な画像の品質は経験と SEM オペレーターのスキルに依存します。したがって、SEM の技術者の使用または独自の SEM のスキルの開発に時間を費やすをお勧めします。すべての本稿で示すデータ (含むサンプル準備およびイメージ投射) は学部教職員私たち顕微鏡技術者からの指導で、カーネギー メロン大学で生物顕微鏡プログラムによって生成されました。

ここで説明されているプロトコルには、潜在的に有害化学物質の使用、ユーザー、これらの化学物質を処理することがあります、特に学生を保護するために適切な安全対策を観察常に必要がありますがあります。ユーザーが常に必要がありますプロトコルは、初回使用時に個々 の化学物質の安全性に関する懸念を指定、: (1) 化学発煙のフードを使用する、(2)、緊急眼洗浄やシャワーへのアクセスを持っている (3) 適切な個人用保護具などを使用白衣、ニトリル手袋、目の保護、および (4) は、どこに書かれた安全手順手続き、指定を含む利用を知っている除染手順の手順をこぼすし、ごみの廃棄手順。

結論としては、これらの生物は、それぞれの外部表面の三次元地形に関する情報は系統学的グループ化または修飾子の分析に役立つ方法について説明します。シアノ バクテリア、光学顕微鏡、電子顕微鏡からの追加データとの組み合わせで SEM から特定の機能を使用ことができ、識別するため、分子の研究、評価、シアノ バクテリアの名前します。Euglenoids、数、幅、配置 (ヘリカルまたはストレート)、および装飾場合は、ペリクルのストリップ使用できます他の形態学的データを識別するために必要な分子データ、評価、euglenoids に名前を付ける場合。また、単細胞の藻類や原生動物マイクロ無脊椎動物の他の種類を作成し、構造や外部の装飾の詳細を送り、鞭毛など外部の形態学的特徴を決定する同様の方法で検討しました。マイクロ無脊椎動物の場合付属。最後に、SEM は病の遺伝的修飾因子を特徴付けるモデル系ショウジョウバエの目などの形態学的詳細を調べるため広範なアプリケーションです。ここで説明されているプロトコル利用の複雑さに関して大きく異なる生物はまだすべてはの多くの異なるはいにわたる科学的発見の重要な形態学的情報を収集するために SEM 分析に適しています。生物学。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は研究局、セントラル ミシガン大学大学院研究から MAK に MLS と夏学者賞の助成金によって賄われていた。シアノ バクテリアは、沿岸域、テキサス A & M 大学コーパスクリスティの Zimba とプランクトン研究室、センターの一部によって供給されました。Euglenoids は、Triemer の実験室、ミシガン州立大学によって供給されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

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生物学、問題 143、走査電子顕微鏡 (SEM)、シアノ バクテリア、euglenoid、フルーツ フライ、ショウジョウバエ臨界点乾燥 (CPD) ヘキサメチルジシラザン (HMDS) t-ブチル アルコール (未定)
原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備
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