SEM er en effektiv metode for å hjelpe i arter identifikasjon eller fenotypiske diskriminering. Denne protokollen beskriver metodene for å undersøke bestemte morfologiske detaljer av tre representant organismer og ville være bredt aktuelt å undersøke funksjonene i mange organismebiologi og vev.
Skanning elektronmikroskop (SEM) er en allment tilgjengelig teknikk som brukes for å studere biologiske prøver alt fra individuelle proteiner til celler, vev, organeller og hele organismer. Denne protokollen fokuserer på kjemiske drying metodene, hexamethyldisilazane (HMDS) og t-butyl alkohol (TBA) og deres bruk bildebehandling av både prokaryotic og eukaryotic organismer med SEM. I denne artikkelen beskriver vi hvordan å fikse, vask, tørke, tørr, montere, spraking pels og image tre typer organismer: Cyanobakterie (Toxifilum mysidocida Golenkina sp. og en ukjent sp.), to euglenoids fra slekten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og frukt fly (Drosophila melanogaster). Formålet med denne protokollen er å beskrive en rask, billig og enkel metode for å få detaljert informasjon om strukturen, størrelse og overflate kjennetegner prøver som grovt kan brukes på et stort utvalg av organismer for morfologiske vurdering. Vellykket gjennomføring av denne protokollen vil tillate andre å bruke SEM for å visualisere prøver ved å bruke disse teknikkene på deres system.
En scanning elektron mikroskop (SEM) bruker en fokusert stråle av kraftkrevende elektroner generere et bilde fra videregående elektroner som viser morfologi og topografi eksempel1. SEM kan brukes til direkte bestemmer den fysiske størrelsen av en prøve, overflatestruktur, tredimensjonal form, og tilbyr større oppløsning og større dybdeskarphet sammenlignet * lys. En annen form for elektronmikroskop (EM), overføring elektronmikroskop (TEM) bruker fokusert elektroner som passerer gjennom utvalget, genererer bilder med fine detaljer av intern struktur. Mens TEM har høyere oppløsning enn lys eller SEM og kan brukes til å løse strukturer så liten som enkelt atomer, har tre store ulemper: omfattende utvalg forberedelse, en liten synsfelt og en grunne dybde på feltet2,3. Selv om andre visualisert protokoller eksisterer ved hjelp av SEM undersøke bestemte celler, organeller eller vev4,5,6,7,8,9, 10 , denne protokollen er unik i at vi beskriver metoder som grovt kan brukes på et stort utvalg av organismer morfologiske vurdering.
SEM har funnet bred programmer for å undersøke uorganisk materiale inkludert nanopartikler11,12, polymerer13og mange programmer i geologiske, industrielle og materielle vitenskap14, 15,16. I biologi, har SEM lenge vært brukt for å undersøke biologiske prøver alt fra individuelle proteiner til hele organismer17,18. SEM er av spesiell verdi fordi morfologiske detaljer fra overflaten kan brukes til å informere vitenskapelige funn. SEM er en rask, billig og enkel metode for å få detaljert informasjon om strukturen, størrelse og overflate kjennetegner et bredt spekter av biologiske prøver.
Fordi en SEM normalt opererer under høyvakuum (10-6 Torr minimum) å støtte en sammenhengende stråle av høyhastighets elektroner, tillates ingen væske (vann, oljer, alkoholer) i eksemplet kammeret, som væsker hindre et vakuum dannes. Således, alle prøver undersøkt ved hjelp av SEM må bli dehydrert vanligvis bruke en gradert etanol serie etterfulgt av en tørkeprosessen fjerne etanol. Det finnes flere metoder for tørking biologisk vev for bruk i SEM, inkludert luft tørker, lyophilization, bruk av et kritisk punkt tørking (CPD) enhet eller kjemiske tørking t-butyl alkohol (TBA) eller hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. oftest utvalg av tørking metode er empirisk siden hvert biologiske utvalg kan reagere forskjellig på hver tørking metode. For enhver gitt prøven, alle disse metodene vil være riktig så sammenligne fordeler og ulemper av hver er nyttig i å velge den riktige metoden.
Air tørking et utvalg ved romtemperatur eller i tørking ovn (60 ° C) er den enkleste metoden, de fleste biologiske prøver viser tørking-indusert skade som shriveling og kollaps, som resulterer i forvrengning av prøven. Prosessen med lyophilization også fjerner vann (eller is) fra en prøve, men krever å være flash-frosne og plassert under vakuum fjerne is via prosessen med sublimering, potensielt skadelige prøven. I tillegg må brukeren ha tilgang til en lyophilizer. Den vanligste metoden for dehydrating prøver for SEM er kritisk punkt tørking (CPD). CPD, er etanol i en prøve erstattet med flytende karbondioksid (CO2), og under bestemte temperatur og trykk forhold kjent som kritisk punkt (31,1 ° C og 1073 psi), CO2 fordamper uten å opprette overflatespenning, og dermed effektivt opprettholde de morfologiske og strukturelle funksjonene av utvalget. CPD er vanligvis standard metode, har den flere ulemper. Først krever prosessen tilgang til et kritisk punkt tørketrommel, som er ikke bare dyrt, men også nødvendiggjør bruk av flytende karbondioksid. Andre er størrelsen på prøven som kan tørkes begrenset til kammeret størrelsen på det kritiske punktet tørketrommel. Tredje, utveksling av væsker under CPD kan forårsake turbulens som kan skade prøven.
Kjemisk tørking gir mange fordeler over CPD og fungerer som et egnet alternativ som er blitt mye brukt i SEM eksempel forberedelse. Bruk av kjemiske dehydrants som TBA og HMDS tilbyr en rask, billig og enkelt alternativ til andre metoder, samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til prøven. Vi har nylig viste at det var ingen forskjell i integriteten til vev eller kvaliteten på det endelige bildet tatt når du bruker CPD eller TBA som tørking metode i voksen Drosophila netthinnen vev23. I motsetning til CPD, TBA og HMDS krever ikke en tørking instrument eller flytende CO2 , og det er ingen begrensning på størrelsen på utvalget å. I tillegg til å skaffe kjemikalier, må et standard kjemiske avtrekksvifte og riktig personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) fullføre tørkeprosessen. Mens både TBA og HMDS er brannfarlig, TBA er mindre giftig og billigere (ca 1/3 kostnaden for HMDS) enn HMDS.
I denne artikkelen beskriver vi hvordan å fikse, vask, tørke, tørr, montere, spraking pels og image tre typer organismer: Cyanobakterie (Toxifilum mysidocida Golenkina sp. og en ukjent sp.), to euglenoids fra slekten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og frukt fly (Drosophila melanogaster). Disse organismene representerer et bredt spekter (0,5 µm 4 mm) og mobilnettet mangfold (encellede til flercellet), men alle er lett mottakelig for SEM analyse med kun små variasjoner nødvendig for prøven forberedelse. Denne protokollen beskriver metodene for å bruke kjemiske dehydrering og SEM analyse for å undersøke morfologiske detaljene av tre typer organismer og ville være bredt aktuelt å undersøke mange organismebiologi og vev.
Her beskrev vi en protokoll som SEM for å få detaljert informasjon om eksterne morfologiske kjennetegn av tre typer organismer som andre kan bruke til å undersøke funksjonene i mange typer organismer eller vev. I hvert trinn av protokollen er det steder feil som kan oppstå og diskuteres i detalj nedenfor.
Mens volumene for bindemiddel og vasker gitt her er bestemt, skal generelt bindemiddel og vasker 5-10 x volumet av prøven. Fiksering, vask og dehydrering tidene er basert på vår erfar…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning MLS og en sommer Scholar Award til MAK fra Office for forskning og høyere grads studier ved Central Michigan University. Cyanobakterie ble levert av den Zimba og plankton lab, del av Center for kyst studier, Texas A & M University i Corpus Christi. Euglenoids ble levert av Triemer lab, Michigan State University.
gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |