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Biology

Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM análise é um método eficaz para auxiliar na identificação de espécies ou discriminação fenotípica. Este protocolo descreve os métodos para examinar detalhes morfológicos específicos dos três tipos de representante dos organismos e seria amplamente aplicável para examinar características de muitos organismos e tipos de tecido.

Abstract

Microscopia eletrônica (SEM) é uma técnica amplamente disponível que foi aplicada para estudar espécimes biológicos variando entre proteínas individuais para as células, tecidos, organelas e organismos nem todo. Este protocolo centra-se em dois métodos de secagem químicos, hexamethyldisilazane (HMDS) e álcool t-butílico (TBA) e sua aplicação para geração de imagens de organismos procariotas e eucariotas, usando SEM. Neste artigo, descrevemos como corrigir, lavar, desidratar, secar, montar, salpicar o casaco e três tipos de organismos de imagem: cianobactérias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. e um desconhecido SP.), dois Ciliophora do género Monomorphina (M. aenigmatica e M. pseudopyrum) e a mosca da fruta (Drosophila melanogaster). O propósito do presente protocolo é descrever um método rápido, barato e simples para obter informações detalhadas sobre a estrutura, tamanho e características de superfície das amostras que podem ser amplamente aplicadas a uma grande variedade de organismos, para morfológica avaliação. Conclusão bem-sucedida do presente protocolo permitirá que os outros a usar SEM Visualizar amostras aplicando essas técnicas a seu sistema.

Introduction

Um microscópio eletrônico de varredura (MEV) utiliza um feixe focalizado de elétrons de alta energia para gerar uma imagem de elétrons secundários que mostra a morfologia e topografia de uma amostra de1. SEM pode ser usado para determinar diretamente o tamanho físico de uma amostra, a estrutura de superfície e a forma tridimensional e oferece maior resolução e maior profundidade de campo em comparação com microscopia de luz. Outra forma de (EM) microscopia eletrônica de varredura, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) usa focalizado de elétrons que passam através da amostra, gerando imagens com detalhes finos da estrutura interna. Enquanto TEM tem uma resolução maior do que a luz ou SEM e pode ser usado para resolver estruturas tão pequenas quanto átomos único, tem três desvantagens principais: preparação da amostra extensa, um pequeno campo de visão e uma profundidade de campo,2,3. Embora outros visualizado protocolos existem usando SEM examinar específicas das células, organelas ou tecidos4,5,6,7,8,9, 10 , este protocolo é o único que podemos descrever métodos que podem ser amplamente aplicados a uma grande variedade de organismos, para avaliação morfológica.

SEM tem encontrado grandes aplicações pela análise de materiais inorgânicos, incluindo as nanopartículas11,12, polímeros13e numerosas aplicações em Ciências Geológicas, industrial e material14, 15,16. Em biologia, SEM tem sido muito utilizado como um método para analisar amostras biológicas variando entre proteínas individuais para toda organismos17,18. SEM é de particular valor porque detalhes morfológicos de superfície podem ser usados para informar a descoberta científica. SEM análise é um método rápido, barato e simples para obter informações detalhadas sobre a estrutura, tamanho e características de superfície de uma vasta gama de amostras biológicas.

Porque um SEM normalmente opera sob alto vácuo (10-6 Torr mínimo) para oferecer suporte a um feixe coerente de elétrons de alta velocidade, nada de líquidos (água, óleos, álcoois) é permitida na câmara de amostra, como líquidos evitar um vácuo de formando. Assim, todas as amostras examinadas usando SEM devem ser desidratadas, tipicamente usando uma série gradual do etanol, seguida por um processo de secagem para remover o etanol. Existem vários métodos de secagem de tecidos biológicos para uso em SEM, incluindo o ar de secagem, liofilização, uso de um ponto crítico secagem (CPD) dispositivo, ou químico de secagem usando álcool t-butílico (TBA) ou hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. mais frequentemente, a seleção de um método de secagem é empírica desde que cada amostra biológica pode reagir de forma diferente para cada método de secagem. Para qualquer determinada amostra, todos esses métodos podem ser apropriados, comparar as vantagens e desvantagens de cada um é útil na seleção do método apropriado.

Enquanto o ar de secagem de uma amostra em temperatura ambiente ou em um forno de secagem (60 ° C) é o método mais simples, a maioria das amostras biológicas mostrar danos induzida por secagem como murchar e entrar em colapso, resultando em distorção da amostra. O processo de liofilização também remove a água (ou gelo) de uma amostra, mas requer amostras para ser congelado e colocado sob vácuo para remover o gelo através do processo de sublimação, potencialmente danificar a amostra. Além disso, o usuário deve ter acesso a um liofilizador. O método mais comumente usado para desidratar amostras para SEM é ponto crítico (CPD) de secagem. No CPD, o etanol em uma amostra é substituído com líquido de dióxido de carbono (CO2) e, sob temperatura específica e as condições de pressão, conhecidas como o ponto crítico (31,1 ° C e 1.073 psi), CO2 , vaporiza sem criar tensão de superfície, desse modo efetivamente, mantendo as características morfológicas e estruturais da amostra. Enquanto o CPD é geralmente o método padrão, tem várias desvantagens. Em primeiro lugar, o processo requer acesso a um ponto crítico secador, que não só é caro, mas também exige o uso de líquido de dióxido de carbono. Em segundo lugar, o tamanho da amostra que pode ser secada é limitado ao tamanho da câmara do secador ponto crítico. Em terceiro lugar, a troca de líquidos durante o CPD pode causar turbulência que pode danificar a amostra.

Secagem química oferece muitas vantagens sobre o CPD e serve como uma alternativa adequada que está se tornando amplamente utilizada na preparação da amostra SEM. O uso de produtos químicos dehydrants como TBA e HMDS oferece uma alternativa rápida, barata e simples para outros métodos, mantendo ainda a integridade estrutural da amostra. Recentemente mostramos que não houve diferença na integridade do tecido ou da qualidade da imagem final capturada quando usando CPD ou TBA como método de secagem em adultos Drosophila tecido retinal23. Ao contrário de CPD, TBA e HMDS não necessitam de um instrumento de secagem ou líquido de CO2 e não há nenhuma limitação no tamanho da amostra a ser secada. Além de obterem os produtos químicos, apenas um padrão químico de coifa e equipamento de protecção adequado (luvas, jaleco e óculos de segurança) são necessários para completar o processo de secagem. Enquanto ambos TBA e HMDS são inflamáveis, TBA é menos tóxico e mais barato (aproximadamente 1/3 do custo de HMDS) do que HMDS.

Neste artigo, descrevemos como corrigir, lavar, desidratar, secar, montar, salpicar o casaco e três tipos de organismos de imagem: cianobactérias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. e um desconhecido SP.), dois Ciliophora do género Monomorphina (M. aenigmatica e M. pseudopyrum) e a mosca da fruta (Drosophila melanogaster). Estes organismos representam uma ampla gama de tamanho (0,5 µm a 4 mm) e diversidade celular (unicelular ao multicelular), no entanto, todos são facilmente passíveis de análise SEM com apenas pequenas variações necessárias para a preparação das amostras. Este protocolo descreve os métodos para usar desidratação química e análise SEM examinar detalhes morfológicos dos três tipos de organismos e seria amplamente aplicável para examinar muitos organismos e tipos de tecido.

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Protocol

1. preparação e fixação

  1. Prepare cianobactérias.
    1. Crescem as culturas unialgal em mídia de F/224,25 a uma temperatura de 28 ° C em um 14:10 h luz ciclo escuro. Transferência de cultura suficiente para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL tal que, após permitir 15 min resolver, a pelota bacteriana é cerca de 0,05 mL em tamanho. Remova a mídia e substituir com 1,5 mL de fixador (1,25% glutaraldeído, tampão de fosfato 0,1 M pH 7,0), gentilmente inverter várias vezes e incubar durante a noite a 4 ° C.
    2. Transferi as células fixas com uma pipeta de vidro para um equipamento de filtração de 10 mL (Figura 1) que contém um filtro de 25 mm de policarbonato com 0,8 ou 0,2 µm poros, dependendo do tamanho das células. Selar o lado do braço e funil com rolhas de borracha para conter a cultura no funil. Retire o fixador por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões.
      Nota: Se a densidade celular no filtro de policarbonato não é o ideal, ajuste a quantidade de cultura usada a começar.
  2. Prepare algas unicelulares (Ciliophora).
    1. Cultivar culturas unialgal em AF-6 mídia26 com 150 mL L-1 de meio comercialmente disponíveis do solo-água adicionado para a mídia, a uma temperatura de 22 ° C em um 14:10 h luz ciclo escuro. Transferência de 2 mL de baixa densidade (OD600 < 0.5) cultura com uma pipeta de vidro para um equipamento de filtração de 10 mL (Figura 1) que contém um filtro de 25 mm de policarbonato com 8 µm de poros. Selar o lado do braço e funil com rolhas de borracha para conter a cultura no funil.
      Nota: Se a densidade celular no filtro de policarbonato não é o ideal, ajuste a quantidade de cultura usada a começar.
    2. Adicione três gotas de tetróxido de ósmio de 4% (OsO4) diretamente para a cultura e deixe para incubar por 30 min. Retire o fixador por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões.
      Nota: OsO4 é uma toxina aguda (dérmica, oral e inalação rotas), corrosivo para a pele, prejudiciais para os olhos e um sensibilizador respiratório. OsO4 deve ser tratada em uma coifa química utilizando equipamento de protecção adequado incluindo luvas, jaleco e óculos de proteção.
  3. Prepare a Drosophila melanogaster (mosca de fruta)23.
    1. Anestesia moscas adultas usando 100% de dióxido de carbono. Lugar anestesiados adultos (cerca de 10 a 30 moscas) em um tubo de centrifugação de frasco ou 1,5 mL tampa de rosca de plástico pequena.
    2. Mergulhe as moscas anestesiadas em 1 mL de fixador (1,25% glutaraldeído, 0,1 M de tampão fosfato pH 7,2) para 2 h (ou durante a noite) a 4 ° C. Se as moscas flutuam à superfície do fixador, adicione algumas gotas de éter de tert-octilfenil 2,5% glicol de polietileno para enfraquecer a tensão superficial do fixador permitindo a submersão total do tecido. Retire o fixador usando uma pipeta de vidro.

2. lavar e desidratação

  1. Lave e desidratar cianobactérias.
    1. Lave a amostra fixa três vezes com 5 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0 à temperatura ambiente durante 10 minutos cada. Mantenha o frasco e funil rolhado para segurar a lavagem. Remova cada lavagem por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões.
    2. Desidrate a amostra, mantendo a imersão contínua usando uma série gradual do etanol, por 10 min em um volume de 5 mL no funil. As concentrações de etanol classificados são: 25%, 50%, 75%, 95% e 2 trocas de 100% de etanol. Mantenha o frasco e funil rolhado para conter o etanol no funil, evitando a perda de ambos através da evaporação e passiva através do filtro.
    3. Remova o etanol por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões. Transferi a filtro/amostra para uma cápsula contendo apenas o suficiente etanol 100%, para cobrir a amostra antes da secagem em alumínio descartável.
  2. Lave e desidrata algas unicelulares (Ciliophora).
    1. Lave a amostra fixa três vezes com 5 mL de água desionizada à temperatura ambiente durante 10 minutos cada. Mantenha o frasco e funil rolhado para conter a lavagem no funil. Remova cada lavagem por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões.
    2. Desidrate a amostra, mantendo a imersão contínua usando uma série de etanol classificados por 10 min em um volume de 5 mL no funil. As concentrações de etanol classificados são: 25%, 50%, 75%, 95% e 2 trocas de 100% de etanol. Mantenha o frasco e funil rolhado para conter o etanol no funil, evitando a perda de ambos através da evaporação e passiva através do filtro.
    3. Remova o etanol por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões. Transferi a filtro/amostra para uma cápsula contendo apenas o suficiente etanol 100%, para cobrir a amostra antes da secagem em alumínio descartável.
  3. Lave e desidratar Drosophila melanogaster (mosca de fruta).
    1. Lave a amostra fixa três vezes com 1 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,2 em temperatura ambiente por 10 min em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Remova cada lavagem com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não remover as moscas.
    2. Desidrate a amostra usando uma série gradual do etanol, por 10 min em um volume de 1 mL em um tubo de microcentrífuga. As concentrações de etanol são: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Remova o etanol com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não remover as moscas.
    3. Manter a amostra no tubo de microcentrifuga de 1,5 mL com suficiente etanol 100%, para cobrir a amostra antes da secagem.

3. secagem

  1. Realize a secagem química usando t-butílico álcool (TBA)27.
    1. Substitua a solução de etanol 100% com uma solução de 1:1 da TBA e 100% etanol de 20 min. substituir a solução de 1:1 com 100% de TBA de 20 min. repetir duas vezes. Manter a solução a 37 ° C para que a TBA não congela.
      Nota: 100% TBA tem um ponto de congelação de 25,5 ° C; a solução de 1:1 não irá congelar em temperatura ambiente. TBA é inflamável, causa irritação ocular grave, é prejudicial se inalado e pode causar irritação respiratória, sonolência ou tonturas. TBA deve ser tratada em uma coifa química utilizando equipamento de protecção adequado incluindo luvas, jaleco e óculos de proteção.
    2. Transferi a amostra no TBA, se em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, para um prato de pesagem de alumínio descartável. Uma vez no prato de pesagem de alumínio, remover TBA e substitua apenas bastante frescos TBA 100% para cobrir a amostra. Congele a TBA a 4 ° C por 10 min.
    3. Transferir para um vácuo exsicador (redoma) com pacotes de gel congelada para manter TBA congelado. Evacuar e manter um vácuo com uma bomba rotativa para permitir que a amostra secar por vácuo sublimação da TBA congelado pelo menos 3 h ou durante a noite.
  2. Realize a secagem química usando hexamethyldisilazane (HMDS)20.
    1. Substitua a solução de etanol 100% com uma solução de 1:2 de HMDS e 100% etanol de 20 min. substituir a solução de 1:2 com uma solução de 2:1 de HMDS e 100% etanol de 20 min. a 2:1 solução com 100% HMDS de 20 min. repetir uma vez.
      Nota: HMDS é inflamável e uma toxina aguda (via dérmica). HMDS deve ser tratada em uma coifa química utilizando equipamento de protecção adequado incluindo luvas, jaleco e óculos de proteção.
    2. Transferi a amostra em HMDS, se em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, para um prato de pesagem de alumínio descartável. Uma vez que o alumínio pesando prato, substituir a 100% HMDS com apenas bastante frescos 100% HMDS para cobrir a amostra.
    3. Transferir a amostra para um Dessecador de não-vácuo de plástico ou vidro com dessecante fresco (5-6 cm de profundidade) e coloque em uma capa das emanações químicas. Como alternativa, coloque a amostra diretamente em uma coifa química para secar com uma tampa solta, tais como uma caixa, para evitar que detritos caindo na amostra. Permitir que a amostra secar durante 12 a 24 h.

4. montagem

  1. Montagem de cianobactérias e Ciliophora.
    1. Rotule a parte inferior de qualquer um de alumínio 12 - ou -25mm montagem esboço para indicar o que está sendo colocado no topo. Corte o filtro de policarbonato com as células secas em bairros com uma lâmina de barbear limpa ou bisturi se usando um esboço de 12 mm, ou colocar o filtro inteiro se usando um esboço de 25 mm.
    2. Coloca cada filtro em adesivo ou uma guia de adesivo de carbono fixado ao topo de um esboço.
  2. Montagem de Drosophila melanogaster (mosca de fruta).
    1. Rotule o fundo do esboço de montagem alumínio para indicar o que está sendo colocado no topo.
      Coloque as moscas secas na posição desejada na guia adesivo adesivo ou carbono fixado ao topo de um esboço sob um microscópio de dissecação com pinças de precisão.
    2. Aplique o adesivo condutivo prateado, i.e., prata, pintura, em torno das bordas exteriores dos stubs. Conecte as moscas usando um palito de dente para garantir a condutividade, a tinta prateada. Não permita que a tinta tocar a área de imagem desejada.
    3. Coloque os stubs em uma caixa de titular de esboço e coloque a caixa de titular do esboço aberto num exsicador. Permitir que a tinta prata secar pelo menos durante 3 horas ou durante a noite para obter os melhores resultados.

5. revestimento de salpicar

  1. Prepare o aparelho de revestimento por pulverização catódica através da realização de quatro a cinco liberações de gás argônio. Se a umidade é alta (ou seja, o ar é úmido, geralmente sobre 50% de humidade relativa), realizar liberações de seis a sete. Por pulverização catódica revestir os stubs seguindo as instruções do fabricante.
  2. Amostras de casaco com base na amostra utilizada:
    1. Para filtros com cianobactérias, defina o temporizador a salpicar o casaco para 180 s reto na.
    2. Para filtros com algas eucarióticas, ou seja, Ciliophora, definir o temporizador a salpicar o casaco para 120 s reto em e, em seguida, 20 s em três lados em um ângulo de 45 °.
    3. Para grandes amostras, ou seja, cabeças de mosca, definir o temporizador a salpicar o casaco para 60 s reto em e, em seguida, 30 s de cada lado em um ângulo de 45 °.
      Nota: Depois que o revestimento é completo, esboços sobre deve ser cinza-claro.

6. imaging

  1. Amostras de imagem usando um microscópio eletrônico de varredura que inclui um detector de elétrons secundários (SE).
    1. Para cianobactérias, aplique as seguintes configurações: 3-5 kV tensão de accelerator (AC), sonda de corrente (PC) 20-30 e distância de trabalho de 5 mm (WD). Para Ciliophora, use 3 kV AC, 30 PC e 5 mm WD. Para moscas, use 5 kV AC, 30 PC e 5 a 10 mm WD.
  2. Ajuste a ampliação, dependendo do tamanho do detalhe ou do objeto a ser visualizado. Ajuste o foco, aberturas e stigmators até uma imagem clara é produzida. Capturar a imagem usando as configurações de alta resolução de acordo com as instruções do fabricante da SEM.

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Representative Results

Cianobactérias são um grupo de procariontes de organismos que são críticas para o global de carbono, oxigênio e nitrogênio ciclos28,29. Da cerca de 6000 espécies de cianobactérias30, mais tem uma bainha mucilaginoso que cobrem e conectar as células juntas e com outras estruturas de31, que junto com a forma, pode ser resolvido, microscopicamente,32. Tamanho da célula, forma e pigmentos presentes distinguem espécies individuais e em habitats aquáticos, podem ser visualizados como cianobactérias "blooms"28. A classificação de cianobactérias moderna combina todas as características morfológicas possíveis usando microscopia de luz, temperatura e SEM, bem como dados moleculares33. Semelhante a bainha de mucilagem das cianobactérias, pellicle tiras de euglenoid espécie ajuda na determinação de filogenia. Ciliophora é flagelados aquáticos que possuem uma grande quantidade de diversidade morfológica e comportamental, e análise SEM se provou útil na classificação das espécies distintas. Especificamente, Ciliophora possuem estruturas romance sob sua membrana de plasma que são compostas de tiras paralelas de proteicas e microtúbulos, chamados o pellicle34,35,36. O número, disposição e tamanho das tiras do pellicle são críticos comparadores morfológicas e juntamente com dados filogenéticos moleculares, são usados para construir a filogenia para Euglenozoa37.

O primeiro passo na preparação tanto cianobactérias e Ciliophora requer Filtragem os organismos do seu meio de crescimento e é realizado pela montagem de um equipamento de filtração (figura 1A). Aspiração é usada para puxar o meio através de um filtro de policarbonato, deixando os organismos na superfície do filtro. O tamanho dos poros do filtro de policarbonato deve ser selecionado, tal que os organismos intactos não passarão (compare figura 1B e 1C). A Figura 2 mostra resultados representativos de três diferentes gêneros de cianobactérias. Os dois são de água doce e um é marinho. Detalhes da célula, incluindo a forma e a textura da superfície são visíveis, bem como uma bainha de mucilagem ou projeções das células. A Figura 3 ilustra como SEM é usado para visualizar as tiras de película de duas espécies diferentes euglenoid. O arranjo helicoidal do pellicle tiras que mesclagem na extremidade posterior para formar uma cauda ajuda na determinação de filogenia quando comparando Monomorphina aenigmatica (Figura 3A e 3B) com Monomorphina pseudopyrum ( Figura 3 e 3D).

Além de características morfológicas que identificam a espécie, a morfologia externa dos organismos modelo como Drosophila melanogaster pode ser usada para identificar modificadores genéticos usando os neurônios fotorreceptores que compõem o composto Drosófila 38do olho. Desde que o olho é um tecido não-essenciais em moscas, é possível expressar proteínas tóxicas nas células da retina e use SEM para examinar as mudanças morfológicas que modificação genética tem no olho. Olhos de mosca normais são caracterizados por uma matriz ordenada de cerdas e lentes (Figura 4A), porém a expressão de proteínas associadas com a doença de Alzheimer criar o que é chamado o fenótipo 'olho mau' (Figura 4B). Genes que inibem (Figura 4) ou aumentar (Figura 4), o fenótipo de olho duro podem desempenhar um papel fisiológico na progressão da doença e têm potencial para drogas segmentação39. Também é mostrado na Figura 4 são exemplos de possíveis armadilhas para evitar incluindo um exemplo da estrutura desabou do olho da técnica de secagem inadequada (Figura 4E) e elétron carga de revestimento por pulverização catódica insuficiente que aparece durante a aquisição de imagens (Figura 4F e 4G).

Figure 1
Figura 1 : Representação esquemática do equipamento de filtração e SEM um filtro de policarbonato de. (A) este aparelho é usado para separar pequenos ou simples organismos unicelulares como cianobactérias e Ciliophora longe de seu meio de crescimento. Aplicação de um vácuo para o lado do braço do balão vai puxar o conteúdo do funil através do filtro de policarbonato e na base do recipiente de filtragem, deixando os organismos na superfície do filtro. (B) SEM de um poro de 0,8 µm filtro com nenhuma amostra que a amostra foi perdido por causa do manuseio incorreto. Barra de escala = 20 µm. (C) SEM de um filtro de poro de 0,8 µm com cianobactérias presentes. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : SEM lâmina histológica de cianobactérias. (, B) Toxifilum mysidocida, uma espécie de água doce filamentosa de Colorado com uma bainha visível de mucilagem (M). Escala de barras = 5 µm. (C, D) A água doce Golenkina SP. de Ohio. Indivíduo às vezes células formam colônias mantidas juntas por uma fina camada de mucilagem (M). Saliências de filamento (setas brancas) estendem-se para as células individuais. Barras de escala = 10 µm. (E, F) filamentosas espécies desconhecidas de um estuário de alta salinidade, em águas costeiras de Texas. Célula individual (setas pretas) e divisão de células (setas brancas) são visíveis. Barra de escala no painel E = barra 2 µm. escala no painel F = 1 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : SEM lâmina histológica do pellicle tiras de duas espécies de Ciliophora. (, B) Monomorphina aenigmatica. (A) baixa ampliação de imagens de toda a célula. Barra de escala = 5 µm. (B) alta ampliação da extremidade posterior. Barra de escala = 3 µm. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. (C) baixa ampliação de imagens de toda a célula. Barra de escala = 10 µm. (D) ampliação elevada da extremidade posterior. Barra de escala = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Análise SEM modificação fenotípica do olho drosófila . Em comparação com a aparência externa normal da matriz ordenada de cerdas e lentes do olho mosca (A), expressão de tau a proteína tóxica provoca a morte dos neurônios fotoreceptor, gerando o fenótipo 'olho mau' (B). Expressão de modificadores genéticos que suprimir (C) ou aumentar (D) o olho duro tau fornece evidências de genes que podem desempenhar um papel na neurotoxicidade tau. Técnica imprópria durante as etapas de secagem pode levar a um colapso da estrutura do olho (E), enquanto o revestimento insuficiente da amostra fará com que o carregamento, que aparece como um branco (F) ou preto (G) de banda durante a aquisição de imagens, como indicado pela seta. Barra de escala = 400 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui descrevemos um protocolo usando SEM para obter informações detalhadas sobre características morfológicas externas dos três tipos de organismos que outros podem aplicar para examinar características de muitos tipos de organismos ou de tecidos. Dentro de cada etapa do protocolo, são os pontos potenciais de erro que possa surgir e são discutidas em detalhes abaixo.

Enquanto os volumes de fixador e lavagens dadas aqui são específicos, em geral, o fixador e lavagens devem ser 5-10x o volume da amostra. Todos os momentos de fixação, lavagem e desidratação são baseados em nossa experiência, se tiver problemas, por exemplo, encolhimento da amostra, você pode precisar aumentar os tempos em cada etapa de desidratação ou secagem. Dependendo de sua amostra única célula, você pode precisar fazer tanto uma fixação de glutaraldeído e uma pós-fixação em tetróxido de ósmio. Se um duelo a fixação é necessária após etapa 1.1.2 o procedimento de cianobactérias cubra com uma quantidade igual 2% OsO4 a mesma reserva e prossiga da etapa 1.2.2 do procedimento única célula. Do trabalho não mostrado aqui, encontramos que Drosophila pode ser colocado diretamente no fixador anesthetization seguinte ou pode ser congelados indefinidamente a-20 ° C em um tubo de microcentrífuga e colocados em fixador, em um momento posterior com nenhuma diferença no acabado qualidade de imagem.

Durante as etapas de lavagem e desidratação, é imperativo para mover através da série gradual do etanol, lentamente e sem pular uma concentração notável. Se as amostras são desidratadas muito rapidamente, impacta negativamente os componentes estruturais subjacentes no tecido e espécime vai murchar, murchar ou colapso. Um exemplo de um colapso do tecido é mostrado na Figura 4E. Além disso, para evitar a introdução de artefatos como aglutinação e achatamento das características morfológicas, é fundamental para deixar apenas suficiente etanol para cobrir a amostra entre etapas durante a desidratação e secagem.

Ao usar o equipamento de filtração, uma gota de água na base prenderá o filtro no lugar durante a montagem. Além disso, o filtro deve ser colocado com o lado brilhante para cima... e todos os líquidos devem ser adicionados suavemente, tendo o cuidado de segurar o filtro com cuidado para evitar a lavagem para retirar a amostra. Embora encontramos os resultados de secagem usando HMDS ou TBA de igual qualidade, recomendamos o uso de TBA: enquanto ambos HMDS e TBA são inflamáveis, TBA é cerca de um terço do custo e menos tóxico do que HMDS.

Durante a montagem quando usando adesivo condutivo prateado (também chamado prata pintura), tenha cuidado ao aplicar como sua amostra pode facilmente ser coberta (enterrado) na pintura, desse modo, obscurecendo detalhes finos na morfologia. Vezes de revestimento por pulverização catódica podem variar com base em sua amostra, e valores apresentados aqui são baseados em nossa experiência. Um resultado negativo potencial de revestimento por pulverização catódica insuficiente é um fenômeno chamado de carregamento, que muitas vezes aparece como uma linha branca ou preta (às vezes um flash) na imagem final (ver Figura 4F e G para exemplos). Se a quantidade de carga observada é mínima, pode ser possível mitigar os efeitos ajustando vários parâmetros de microscópio, tais como a redução da tensão de aceleração ou feixe atual, aumentando a força de lente do condensador, e/ou usando um menor abertura de objetiva. SEMs mais utilizados para amostras biológicas têm detectores de elétron secundário, porém alguns SEMs também podem ser equipados com detectores de retrodifusão ou detectores de ambiental elétron secundário, que pode ser ajustada para diminuir ou eliminar os efeitos do mínimo de carregamento. Se os efeitos de carregamento são mais pronunciado, é provável que haja pobre aterramento da amostra ou pouco salpicar revestimento para produzir os elétrons secundários, fazendo com que os elétrons carregados construir na amostra e ser lançado espontaneamente, produzindo distorção na imagem durante a aquisição. Pronuncia-se de carregamento geralmente é resolvido com um revestimento mais espesso ou melhor aterramento com tinta prateada. Porque tanto demasiado e demasiado pouco revestimento por pulverização catódica pode afetar negativamente a qualidade da imagem, é melhor otimizar a quantidade de revestimento aplicado ao ajustar as variáveis de tempo (10 a 180 s) e pressão (70 a 150 mTorr) do aplicador por pulverização catódica para alcançar uma optim revestimento de Al. Como o revestimento não pode ser removido uma vez aplicada à amostra, uma execução de teste é recomendado com uma única amostra antes de todas as amostras do revestimento.

Parâmetros SEM como acelerando a tensão (em kV), sonda de corrente (PC), e distância de trabalho (WD) deve ser ajustada para obter a melhor imagem possível, que as definições dadas aqui são sugeridas a partir de parâmetros com base na nossa experiência. Enquanto a qualidade da amostra é dependente dos cuidados na preparação, a qualidade da imagem final depende da experiência e habilidade do operador SEM. Assim, recomendamos trabalhar com um técnico SEM ou gastar tempo desenvolvendo suas próprias habilidades de SEM. Todos os dados (incluindo a preparação da amostra e a imagem latente) mostrados neste artigo foram gerados por alunos de graduação no programa de biologia microscopia na CMU, com orientação de professores e o nosso técnico de microscopia.

Os protocolos descritos aqui incluem o uso de produtos químicos potencialmente nocivos, e sempre devem observar as medidas de segurança adequadas para proteger os usuários, especialmente os estudantes que podem lidar com esses produtos químicos. Enquanto os protocolos especificar as preocupações de segurança associadas a cada produto químico mediante a primeira utilização, os usuários devem sempre: (1) usar uma coifa químicos, (2) ter acesso a um chuveiro de segurança e lavagem do olho de emergência, (3) o uso de equipamento de protecção adequado incluindo luvas de nitrilo, jaleco e olho de proteção e (4) sabe onde encontrar os procedimentos de segurança escrito inclusive manipular procedimentos, designados utilizar áreas, derrame, procedimentos de descontaminação e procedimentos de descarte de resíduos.

Em conclusão, estes organismos ilustram como obter informações sobre a topografia tridimensional da superfície externa de cada um são útil para análise filogenética de agrupamento ou modificador. Para cianobactérias, determinados a partir do SEM de recursos podem ser usados em combinação com dados adicionais de microscopia de luz, temperatura, e estudos moleculares para identificar, caracterizar e nomear as cianobactérias. Para Ciliophora, o número, largura, arranjo (helicoidal ou em linha reto) e ornamentação, se presente, do pellicle tiras podem ser usadas com outros dados morfológicos, e se necessário dados moleculares, identificar, caracterizam e nomear Ciliophora. Além disso, outros tipos de algas unicelulares e protozoários ou microinvertebrados podem ser preparados e examinados em uma maneira similar para determinar características morfológicas externas tais como flagelos, alimentação, estrutura, ornamentação externa ou detalhes de apêndices no caso de microinvertebrados. Finalmente, SEM tem amplas aplicações para examinar detalhes morfológicos, tais como o olho do sistema modelo Drosophila, caracterizar modificadores genéticos da patologia da doença. Os protocolos descritos aqui utilizam organismos que variam muito em relação a complexidade, no entanto, todos são passíveis de análise SEM recolher informação morfológica útil que é essencial para a descoberta científica, abrangendo muitos diferentes subdisciplinas da Biologia.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por uma concessão para a MLS e um prêmio de estudioso de verão para MAK do escritório de pesquisa e pós-graduação na Universidade de Michigan Central. Cianobactérias foram fornecidas pelo Zimba e laboratório de plâncton, parte do centro de estudos costeiros, Texas A & M University em Corpus Christi. Ciliophora foram fornecidas pelo laboratório de Triemer, Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

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Biologia questão 143 varredura microscopia eletrônica de varredura (MEV) cianobactérias euglenoid mosca da fruta Drosophila ponto crítico secagem (CPD) hexamethyldisilazane (HMDS) álcool t-butílico (TBA)
Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)
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Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

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