Summary
قدم هو بروتوكول مقايسة منافسة لوحة تحديد ما إذا كان سماد محددة من المحتمل أن تحتوي على البكتيريا والفطريات التي تقمع نمو سولاني مرضى.
Abstract
والهدف هو تطوير وتحسين بسيط، بأسعار معقولة وفعالة الاختبار الأحيائي للكشف عن المرض القدرة القمعية السماد محددة ضد الفطريات soilborne سولاني مرضى. سولاني ر رض طائفة واسعة من مضيفي النباتات في جميع أنحاء العالم. تعيش في التربة سابروفيتي الفطر وينمو بسرعة في المياه بسيطة أجار وسائط الإعلام. فحص لوحة طريقة سريعة لمقارنة كومبوستس لقدرتها على إبطاء نمو سولاني ر.. كما يرتبط المقايسة جيدا مع قمع لمسببات الأمراض الفطرية الأخرى soilborne البقاء على قيد الحياة سابروفيتيس في التربة مثل الآفات المبكرة م وذبول الفوزاريوم وتعفن جذور لفحة وتعفن جذور بيثيوم.
Introduction
مرضى يمثل مجموعة معقدة واسعة من الفطريات، من دونك كوكوميريس ثاناتيفوروس (فرانك) الذي (anamorph = Kühn سولاني مرضى ) هو الممرض تسبب تعفن جذور والتثبيط قبالة1. سولاني مرضى هو ممرض عدوانية وسابروفيتي التي يمكن البقاء على قيد الحياة ك sclerotia تحت الظروف البيئية السلبية1. نتيجة لذلك فإنه توزيع عالمي ويمكن أن يسبب المرض على طائفة واسعة من مضيفي النباتات بما في ذلك الباذنجانية وقرنيات و Asteraceae والفصيلة الكرنبيه أسفر عن خسائر اقتصادية جسيمة.
السماد لديه القدرة على إيواء لذالك وكلاء لبعض مسببات الأمراض النباتية2. لكن ليس كل كومبوستس على حد سواء كما أنها تؤثر على جميع مسببات الأمراض وكذلك3. وقد الكربون الخشبية اللجنين أعلى نسب السليلوز من التبن أو القش من الكربون على أساس كومبوستس. سولاني ر. يفضل الكربون متاحة بسهولة في القش. وفي المقابل، فطريات المكافحة البيولوجية، مثل الترايكوديرما spp.، تكون أكثر فعالية عندما الكربون أقل متاحة بسهولة. الفطريات المفيدة والبكتيريا في السماد يمكن منع الأمراض النباتية من خلال المنافسة أو الخصومة أو تنظيم نمو النبات3. يكشف التحليل المقترح أساسا العداء التي تم إنشاؤها بواسطة إنتاج المضادات الحيوية، أو اكوينزيميس، أو تشيلاتورس التي تضر بمسببات المرض.
مصنع المقايسة معيار الذهبي لتحديد ما إذا كان كومبوستس صالح أو ردع نمو النبات4. بيد أن المقايسة النباتية مضيعة للوقت (أسابيع إلى أشهر) لإكمال التي قد تكون أطول من المطلوب، ويتطلب العمل أكثر لاستخراج النباتات ذات الجذور لقياس شدة نظم جذور. قوية نسبيا، ولكن أسرع فحوصات (الأيام) سيكون أمرا مثاليا لبرامج مراقبة الجودة. والهدف من هذه الورقة لإثبات اختبار نسبيا سريعة ودقيقة للتنبؤ بإمكانات القمعية من السماد العضوي. وكان نمط الأسلوب بعد الفانو et al. كانت تضعف 5 مع استثناءين، مقتطفات السماد واستخدمت أجار المياه بدلاً من البطاطا الدكستروز أجار (PDA). سولاني ر ينمو بسرعة في المياه بسيطة أجار وسائل الإعلام حين المساعد الشخصي الرقمي تشجع نمو البكتيريا والفطريات الأخرى الملوثة الثقافة6.
هذا التحليل لوحة يخدم كمؤشر لقمع التي تنطبق على مجموعة من مسببات الأمراض النباتية التي تعيش في التربة سابروفيتيس بما في ذلك سولاني ر7م الآفات المبكرة والذبول مغزلاويه، تعفن جذور لفحة، وتعفن جذور بيثيوم. تحليل المنافسة لوحة مفيد على الشاشة مجموعة من منتجات السماد العضوي لتحتوي على المجتمعات المحلية للميكروبات التي تكون بمثابة عوامل المكافحة البيولوجية للتربة المسببة للأمراض. وكان المقايسة أحد المؤشرات الأكثر اتساقا لقمع المرض في6،منتجات السماد التجاري8. تم اختيار المنتجات على التغيير في وصفه، والنضج، وعملية الإنتاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد مقدما
- الثقافة الفطرية الرئيسية (اختبار الكائن الحي)
- طلب من "جمع نوع الثقافة الأمريكية"، "جمع علم الأحياء الدقيقة"9، تيليومورف كوكوميريس ثاناتيفوروس (فرانك) (ATCC 10154) أو 4031 ميا.
- وبدلاً من ذلك: جمع يعزل المحلية كما فعل صاحبا. شتلة فجل الأحمر (الزعفران فجل) يعمل أيضا كمحطة لطعم؛ جمع التربة من مكان يعرف أن لها تاريخاً تعفن التخميد حالاً أو الجذر الناجم عن سولاني ر. بذر البذور في التربة وعزل من آفات الجذر عند شتلة من 3 إلى 4 أسابيع من العمر.
- إزالة الشتلات من التربة والشطف بماء الصنبور. ابحث عن البنى الأنسجة في منطقة هيبوكوتيل بين الأوراق والجذر (الشكل 1).
- استخدام شفرة حلاقة المدببة واحدة لقطع شرائح 1 سم هيبوكوتيل أو الجذر باللون بني. استخدام الملقط تعقيم الشعلة إلى تراجع في الجزء المتعلق بحل 10% للتبييض المنزلية ل 1 دقيقة، يليه 10 ق شطف في الماء المعقم.
ملاحظة: أعلى وأسفل صحن بتري معقمة حاويات مفيدة لهذه الخطوة. - قطع استخدام لهب تعقيم الملقط لنقل المصنع إلى داخل منشفة ورقية بات الجافة ومن ثم ضع على سطح طبق بيتري مع المياه أجار (15 غم في 1 لتر).
- ضع طبق بيتري داخل وعاء من بلاستيك بغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية). مسح داخل الحاوية مع الإيثانول التبييض أو 75% 10% وأتركها في الهواء الجاف قبل إدراج الطبق.
- يبقى يعزل في التخزين طويل الأجل على وسائط الحد أدنى من أجار وجبة الذرة الميول (ز 17 في 1 لتر) (في 5 درجة مئوية).
رقم 1: أعراض المرض. التربة المحتوية على سولاني ر النتائج في الإنبات غير مكتمل وإنشاء (إلى اليسار). تحدث الأعراض على شتلة الفجل آفات البنى في هيبوكوتيل (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- استخدام البطاطا الدكستروز أجار لوحات (39 ز في 1 لتر) للعدوى لهذا الفحص اللوحة.
- إرساء ثقافة ابنه الثقافة مرضى في البطاطا الدكستروز أجار واحد أو يومين قبل الفحص، ضمان ذلك هي راسخة في لوحة الثقافة قبل المقايسة. بدء ثقافة ابنه بنقل قطعة صغيرة (10 مم) R. سولاني من الثقافة الرئيسية إلى مركز لوحة جديدة من البطاطا الدكستروز أجار (الشكل 2).
ملاحظة: يعمل في غطاء الاندفاق الصفحي أو مسح أسفل منضدة مختبر مع 10% إيثانول التبييض أو 75% للتقليل من خطر التلوث.
- إرساء ثقافة ابنه الثقافة مرضى في البطاطا الدكستروز أجار واحد أو يومين قبل الفحص، ضمان ذلك هي راسخة في لوحة الثقافة قبل المقايسة. بدء ثقافة ابنه بنقل قطعة صغيرة (10 مم) R. سولاني من الثقافة الرئيسية إلى مركز لوحة جديدة من البطاطا الدكستروز أجار (الشكل 2).
- اﻷوتوكﻻف 25 مل أنابيب الاختبار مع مختبرين 10 مل من الماء المقطر (2 x عدد العينات).
2-إعداد العينات للاختبار
- إضافة عينتين مستقلة ز 0.5 لكل عينة اختبار السماد إلى 10 مل يعقم المياه في أنابيب الاختبار 25 مل. هزة في أنابيب الاختبار بين عشية وضحاها.
- قم بتسمية أنابيب الاختبار مع أرقام عينة فريدة من نوعها، وكل عضو من الزوج (مرجع) أو ب (عينة).
- بعد 24 ساعة، إضافة 1.5 غرام أجار عادي إلى 90 مل ماء المقطر في قوارير ملكونيكال 125 اثنين.
- اﻷوتوكﻻف كلا قوارير المخروطية مع أجار، ونموذج أ لكل زوج لمدة 20 دقيقة مع إعداد عادم بطيئة.
- بعد اﻷوتوكﻻف، وضع قوارير المخروطية مع أجار في حمام مائي 45 درجة مئوية حتى تصل إلى التوازن (حوالي 30 دقيقة). لا تضع أي عجائن العينة في حمام المياه حتى أنها قد بردت إلى 45 درجة مئوية.
رقم 2: رسم توضيحي للبروتوكول. المقابس سولاني R. توضع على أطباق بتري تحتوي على استخراج المياه السماد. يتم قياس قطر النمو mycelial بعد 1-2 أيام مع المعونة من المجهر ستيريو لتحسين القرار والتباين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- صب ملاط السماد (يعقم مرجع) عينة أ في أجار المنصهر من قارورة أجار A. دوامة لتفريق السماد إلى أجار.
- صب ملاط السماد (العينة الحية) عينة ب في أجار المنصهر من قارورة أجار ب. دوامة لتفريق السماد إلى أجار.
- صب الخليط من كل قارورة في خمسة صحون بتري البلاستيك التي 100 ملم في القطر.
- اسمحوا بين عشية وضحاها لوحات باردة حتى يصلب أجار.
3-إضافة مرضى والتحدي
- باستخدام تقنية معقمة، نقل قطع متساوية في الحجم من سولاني ر لكل زوج من عينة أجار لوحات (3 إلى 5 مم كوركبورير يعمل جيدا لإنشاء أجزاء متساوية الحجم). تأخذ قطعة من المستعمرة من الهامش خارج مستعمرة لضمان نشاط ينمو الميسليوم.
ملاحظة: يعمل في غطاء الاندفاق الصفحي أو مسح أسفل منضدة مختبر مع الإيثانول التبييض أو 70% 10%. - احتضان اللوحات في درجة حرارة الغرفة 1-2 أيام حتى نمو مستعمرة يبلغ حوالي نصف الطريق إلى الحافة اللوحات ألف.
4-قياس سولاني ر النمو
- قياس نصف قطر الميسليوم في كل لوحة إلى 1 ملم أقرب مع مسطرة واضحة مسطحة باستخدام مجهر ستيريو مع الإضاءة المنقولة.
ملاحظة: الحقل منحرف أو داكنة الإضاءة سوف يسهل رؤية وقياس خيوط فطرية شفافة. عند هذه النقطة، مناطق لتثبيط ستكون مرئية حول أجزاء السماد في لوحة ب إذا كان السماد القمعية. - تسجيل في دائرة نصف قطرها في ثلاثة أماكن للوحة الواحدة وحساب متوسط الثلاث بمثابة تدبير تمثيلية.
- قم بطرح متوسط لوحات ب من لوحات A. إذا ب < هناك ثم الميكروبات في لوحات ب التي القمعية الممرض سولاني ر .
- القسمة في دائرة نصف قطرها متوسط عدد أيام تحدي للتعبير عن وحدات لقمع النسبي كمعدل، الميسليوم ملم في اليوم الواحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وينبغي الانتهاء من السماد مستقرة وناضجة، هما المصطلحات التي كثيرا ما تستخدم بالتبادل، حيث يمكن تعبئتها ونقلها بشكل أمن، ولا تسبب آثار ضارة أثناء الاستخدام النهائي في4. الاستقرار هو مقاومة للتحلل، وعادة ما تحدد باستخدام الأرقام القياسية للنشاط الميكروبي. التدابير العامة للتنفس الميكروبية يمكن قياس الاستقرار السماد ولكن ليس بالضرورة المرض في قمع الممرض العدوانية وسابروفيتي مثل سولاني ر7. ركزت هذه الدراسة على النضج الذي يعين المواد جاهزة لاستخدام معين، وتحددها فحوصات الإنبات ونمو النبات لأغراض البستنة،.
مقتطفات كومبوستس الحية قمعت النمو سولاني ر إلى حد كبير أكثر من عينات يعقم (P ≤ 0.0001). التعقيم يقتل إيقاف نشاط الميكروبات، مشيراً إلى قمع وساطة ميكروبيالي. وهذا يؤكد أن طبق أ في الأسلوب بمثابة عنصر تحكم سلبية للمكافحة البيولوجية وساطة ميكروبيالي (الشكل 3).
الشكل 3: آثار التعقيم على سولاني ر النمو في المختبر، مقيسا بالنسبة المئوية للتغير في النمو mycelial من عنصر التحكم. مادة اختبار 'القمعية' للفطريات إذا كان شعاع النمو mycelial أقل من عنصر تحكم يعقم. يتضح من وسائل ± 1 الخطأ القياسي. شريط خطأ لعنصر التحكم يعقم صغير جداً لمشاهدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تأثر نمو الميسليوم سولاني ر على استخراج السماد الأسلوب السماد والمواد الخام في وصفه للسماد ولكن ليس مدة النضج أو علاج6،8. تم تخفيض نمو عمليات ويندروو وفيرميكومبوست والوصفات التي تحتوي على لحاء الخشب الصلب (الشكل 4). سوبريسيفينيس ويمثل انخفاضا في نمو سولاني ر.
الشكل 4: استخدام لوحة المنافسة المقايسة لمقارنة سوبريسيفينيس منتجات السماد. يعني ± 1 الخطأ القياسي للتغير في النمو سولاني ر على صفيحة مرجع يعقم. تم تلقيح كل من عناصر التحكم ومقارنات العلاج بضراوة سولاني ر. تمثل القيم الموجودة تحت الصفر سوبريسيفينيس. سوبريسيفينيس R. سولاني تأثر بالسماد A) الأسلوب، ب) مدة علاج أو النضج، ووصفه ج). وكانت عمليات مقارنة كومة ثابت الخلوية (ASP)، ويندروو (W)، فيرميكومبوست (V)، والهضم اللاهوائي (AD). وكانت مكونات الوصفة مقارنة فضلات الطعام (و) وروث الدواجن (P) وفضلات الطعام وروث الدواجن (FP)، السماد الألبان (M) واللحاء خشبية (ح). الرسائل المتناقضة أعلاه أشرطة تدل على العلاجات التي تختلف اختلافاً كبيرا. وقد تم تعديل هذا الرقم من نيهر et al. 8 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ونعلم من البحوث السابقة، أن بعض كومبوستس فعالة في قمع سولاني ر. وآثار القمعية بسبب الميكروبات الحية في السماد العضوي، لا الخصائص الأحيائية واللااحيائيه السماد6،8. وقد انتقد استخدام التعقيم كوسيلة 'قتل' الحجمية لأنه يؤثر على كيمياء الكربون وسائل الإعلام10. أننا بالمقارنة مع استخدام التعقيم للترشيح الفراغ من خلال ورقة واتمان رقم 1. وأظهرت العلاجات التي لم تكن تمت تصفيتها لا يعقم قمع أكبر من النمو سولاني ر 6. الترشيح إزالة الجسيمات الصلبة الكبيرة، والتي كانت على ما يبدو مهمة لقمع المرض بالمضادات الحيوية إيواء المحتمل المنتجة للميكروبات.
مزايا أسلوب هي البساطة والقدرة على تحمل التكاليف. مماثل للاستنتاجات والتوصيات من الفانو et al. 2، تحليل المنافسة لوحة تقييم أولى سريعة لمكافحة المرض ولكن لا يمكن الاعتماد عليها كفحص مستقل لمسببات المرض فقط، ولا الدولة المضيفة النبات موجود. وعلاوة على ذلك، لن تقيم المرض إذا كانت البيئة غير المواتية؛ هي المفضلة للأمراض سولاني ر ظروف دافئة ورطبة1. وعموما، هناك تعقيد أكثر في النظام الإيكولوجي التربة والسماد العضوي مما يمكن أن يحاكي تماما بمختبر واحد مقايسة4،8. فحص لوحة قابل للمقارنة إلى مؤشرات أخرى بما في ذلك مؤشر السلكية نضج السماد وثلاثة اكونزيميس الميكروبية، الفوسفاتيز، β-1، 4-جلوكوسيداسي، وبيتا-1، 4-N-أسيتيلجلوكوسامينيداسي8. ويعكس اكونزيميس الدولة لتلبية احتياجات المجتمع الميكروبي التحلل والكربون والمغذيات. تأكيد سوبريسيفينيس يمكن أن يتحقق مع فحوصات النبات إلا أنها تأخذ وقتاً أطول لإتمام. عزل، والحفاظ على ثقافة نقية من الفطريات يعتني لتجنب التلوث. ATCC9 يقدم نصائح وتقنيات لاستزراع الخمائر والفطريات الخيطية.
الأسلوب مرشح محتمل للتصديق التجاري لخصائص المرض القمعية. وتعكس النتيجة قمع كدالة تربة. لا تحدد آليات أو الأنواع الميكروبية الخاصة المسؤولة عن قمع المرض. ويمكن تطبيقها في مستقبل لقطع جزء من منطقة تثبيط لاستخراج الحمض النووي لتسلسل وتحديد هوية أفراد المجتمع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ولاية فيرمونت الزراعية محطة التجربة التنافسية هاتش البرنامج فاتو-HO1609 تمويل البحوث. لين فانغ استخدمت الأسلوب كجزء من بلدها أطروحة ماجستير في جامعة فيرمونت6.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
