Summary
Sunulan belirli bir kompost bakteri ve mantar büyüme Rhizoctonia solanibastırmak bulunma olasılığı olup olmadığını belirlemek bir plaka rekabet tahlil için bir protokoldür.
Abstract
Geliştirmek ve hastalık süpresif yetenek soilborne mantar Rhizoctonia solanikarşı belirli bir kompost algılamak için bir basit, uygun fiyatlı ve etkili bioassay en iyi duruma getirmek için hedefi oldu. R. solani bitki ana bilgisayarlar dünya çapında geniş bir patojen var. Mantar ve topraklarda bir cimri hayatta basit su agar medyada hızla büyür. Plaka tahlil onların yetenek R. solanibüyümesini yavaşlatmak kompost karşılaştırmak için hızlı bir yöntemdir. Tahlil de Alternaria erken korumalılar, Fusarium solgunluğu, Phytophthora kök çürüklüğü ve Pythium kök çürüklüğü gibi toprakta saprophytes olarak hayatta diğer soilborne fungal patojenlerin bastırılması ile karşılıklı olarak ilişkilendirir.
Introduction
Rhizoctonia temsil eden mantarlar, hangi Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, geniş bir kompleks (Galatasaray Rhizoctonia solani Kühn =) olan kök çürüklüğü ve sönümleme kapalı1neden olan patojen. Rhizoctonia solani agresif bir patojen ve olumsuz çevre koşulları1altında sclerotia olarak yaşayabilir bir cimri olduğunu. Sonuç olarak, bu bir genel dağıtım ve hastalık çeşitli bitki ana Solanaceae, baklagiller, bitki ve ciddi ekonomik kayıplar sonucu turpgiller gibi birine neden olabilir.
Kompost biyolojik maddeler, bazı bitki patojenleri2için liman kapasitesine sahiptir. Ancak, tüm kompost birbirine ne de onlar tüm patojenler etkiler benzer şekilde3. Ahşap tabanlı karbon saman veya saman-karbon kompost tabanlı daha yüksek lignin selüloz oranlarına sahiptir. R. solani hazır karbon saman bulundu tercih ediyor. Buna ek olarak, karbon hazır daha az olduğunda Trichoderma spp. gibi biyolojik mücadele mantarlar daha etkilidir. Faydalı mantar ve bakteri kompost içine bitki hastalık ile rekabet, husumet veya bitki büyüme3düzenleyen gizle. Önerilen tahlil öncelikle üretim antibiyotikler, ecoenzymes veya patojen için zararlıdır şelatörlerin yarattığı husumet algılar.
Bitki biyoanalizler kompost lehine veya bitki büyüme4caydırmak olup olmadığını belirlemek için bir altın standarttır. Ancak, çoğu bitki biyoanalizler ay için zaman alıcı (hafta) hangi-ebilmek var olmak istenen ve bitki kök sistemleri şiddetini ölçmek için kökleri ile ayıklamak için daha fazla emek gerektiren daha uzun tamamlamak için. Nispeten sağlam, ama daha hızlı (gün) deneyleri kalite kontrol programları için ideal olacaktır. Bu kağıt amacı kompost süpresif potansiyel tahmin etmek için nispeten hızlı ve doğru bir test göstermektir. Yöntem Alfano et al. sonra desenli 5 iki istisna dışında kompost özleri seyreltilmiş ve su agar patates dekstroz agar (PDA) yerine kullanılmıştır. PDA bakteri ve kültür6kontamine diğer mantar büyüme terfi ise R. solani basit su agar medyada hızla büyür.
Bu plaka tahlil toprakta R. solani7, Alternaria erken korumalılar, Fusarium solgunluğu, Phytophthora kök çürüklüğü ve Pythium kök çürüklüğü gibi saprophytes hayatta bitki patojenleri bir dizi uygulandığı bastırma bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. Plaka rekabet tahlil bir toprak patojenlerin biyolojik mücadele etmeni hizmet mikroplar toplulukların içeren için kompost ürün yelpazesi ekrana yararlıdır. Tahlil hastalık bastırma ticari kompost ürünler6,8' en tutarlı göstergeleri biriydi. Ürünler kendi varyasyon tarifi, olgunluk ve üretim süreci için seçilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. önceden hazırlamak
- Ana mantar kültürü (test organizma)
- Amerikan tipi kültür Collection, Mikrobiyoloji koleksiyonu9, onun teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) veya MYA 4031 tarafından sipariş.
- Alternatif olarak: yerel yalıtır yazarlar tarafından yapılan olarak toplamak. Kırmızı turp (Raphanus sativus) fidan iyi bir yem bitkisi olarak iş; toprak sönümleme-off veya kök çürüklüğü R. solanitarafından neden olduğu bir geçmişi olduğu bilinen bir konumdan toplamak. Toprak tohumları ekmek ve fidan 3-4 haftalık olduğunda kök lezyon yalıtır.
- Fidan topraktan çıkarmak ve musluk suyuyla durulayın. Yaprak ve kök (Şekil 1) arasında hypocotyl bölgedeki kahverengi doku arayın.
- 1 cm kesimlerde hypocotyl veya kök kahverengi bir renk varsa kesmek için tek ucu keskin jilet kullanın. Alev sterilize forseps % 10 çözüm için 1 dakika, 10 s durulama steril su ardından ev çamaşır suyu segmentlerinde daldırma için kullanın.
Not: Üst ve alt kısımlarında steril Petri kabına yararlı için bu adımı kapsayıcılardır. - Bitki aktarmak için alev sterilize kullanım forseps pat kuru ve Petri kabına su agar (1 L 15 g) ile yüzeyi yerleştirmek için bir kağıt havlu iç parçaları.
- Kapaklı plastik bir kap içinde Petri kabına yerleştirin ve oda sıcaklığında (yaklaşık 20 ° C) kuluçkaya. Kapsayıcı % 10 çamaşır suyu ya da % 75 etanol ile iç silin ve çanak eklemeden önce kuru hava sağlar.
- Yalıtır mısır yemek agar en az bir ortam üzerinde uzun süreli depolama (1 L 17 g) yatık (5 ° C'de) unutmayın.
Şekil 1: hastalık belirtileri. R. solani içeren toprak düzensiz çimlenme ve kuruluş (solda) ile sonuçlanır. Belirtiler turp fidan üzerinde hypocotyl (sağda), kahverengi lezyonlar olarak ortaya çıkar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Patates dekstroz agar tabak (1 L 39 g) inoculum bu plaka tahlil için kullanın.
- Bir kızı kültür Rhizoctonia kültür patates dekstroz agar bir tarih oluşturmak veya iki gün önce tahlil, bu sigorta için de tahlil önce kültür plaka üzerinde kurulmuştur. Kızı kültür küçük bir parça (10 mm çap) R. solani ana kültüründen patates dekstroz agar (Şekil 2) taze bir tabak merkezine transfer ederek başlayın.
Not: bir laminar akış mahallede iş veya bir laboratuvar tezgah bulaşma riskini en aza indirmek için % 10 çamaşır suyu ya da % 75 etanol ile aşağı silin.
- Bir kızı kültür Rhizoctonia kültür patates dekstroz agar bir tarih oluşturmak veya iki gün önce tahlil, bu sigorta için de tahlil önce kültür plaka üzerinde kurulmuştur. Kızı kültür küçük bir parça (10 mm çap) R. solani ana kültüründen patates dekstroz agar (Şekil 2) taze bir tabak merkezine transfer ederek başlayın.
- Otoklav 25 mL test tüpleri ile 10 mL aliquots distile su (2 x sayısı örnekleri).
2. Test için örnek hazırlanması
- İki bağımsız 0.5 g örnek her kompost test örneği 10 mL 25 mL test tüpleri autoclaved su ekleyin. Test tüpleri gecede sallamak.
- Test tüpleri benzersiz örnek numaraları ve her üyesi çifti (başvuru) veya B (örnek) olarak etiketleyin.
- 24 saat sonra 90 mL distile su içinde iki 125 mLconical şişeler için düz agar 1.5 g ekleyin.
- Otoklav agar ve her çifti yavaş egzoz ayarı 20 dk için A örneği ile her iki konik şişeler.
- Denge (yaklaşık 30 dk) ulaşana kadar basınçlı kap sonra konik şişeler agar ile 45 ° C su banyosu yerleştirin. Herhangi bir örnek sprey su banyosunda 45 ° C'ye serin kadar koymak değil
Şekil 2: illüstrasyon Protokolü'nün. R. solani fişler Petri yemekler üzerinde kompost su özü içeren yerleştirilir. Mycelial büyüme çapını çözünürlük ve kontrast geliştirmek için stereo mikroskop yardımıyla 1-2 gün sonra ölçülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- A örnek (autoclaved başvuru) kompost Bulamaç A agar şişeye erimiş agar dökün. Girdap agar kompost dağıtmak için.
- B örnek (canlı örnek) kompost Bulamaç B agar şişeye erimiş agar dökün. Girdap agar kompost dağıtmak için.
- İçine 100 mm çapında olan beş plastik Petri yemekler her şişeyi karışımı dökün.
- Agar sertleşir plakaları serin gecede izin.
3. eklemek Rhizoctonia Challenge
- Aseptik teknik kullanarak, R. solani eşit büyüklükte parçalar örnek ağar kaplamalar her çifti için transfer (3-5 mm corkborer de eşit büyüklükte parçalar oluşturmak için çalışır). Koloni adet miselyum aktif büyüyen sigorta ettirmeleri koloni dış kenar boşluğunda almak.
Not: bir laminar akış mahallede iş veya bir laboratuvar tezgah % 10 çamaşır suyu ya da % 70ini etanol ile aşağı silin. - Plakayı oda sıcaklığında 1-2 koloni büyüme A tabak hakkında yarı yol kenarına ulaşıncaya kadar günlerce kuluçkaya.
4. ölçü R. solani büyüme
- Stereo mikroskop ile iletilen aydınlatma kullanarak açık düz cetvel ile miselyum her plaka yakın 1 mm yarıçapında ölçmek.
Not: Eğik veya koyu alan aydınlatma görmek ve şeffaf hif ölçmek kolaylaştırır. Bu noktada, kompost süpresif ise inhibisyon bölgeleri kompost parçaları B plaka çevresinde görünür hale gelir. - RADIUS plaka başına üç yerde kaydetmek ve temsili bir ölçütü üç ortalaması hesaplamak.
- Demek--dan A tabak B plakaların çıkarma. Eğer B < daha sonra burada R. solani patojen süpresif B plakaları mikroplar vardır.
- Ortalama RADIUS Challenge birimler göreli bastırma bir oranı, mm miselyum günlük olarak ifade etmek için gün sayısı bölün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bitmiş kompost istikrarlı ve Olgun, iki o güvenli bir şekilde paketlenmiş taşınan ve sık sık birbirinin yerine geçebilir, kullanılan terimler ve olumsuz etkilere neden sırasında son kullanım4. İstikrar ayrışma bir direnci ve genellikle mikrobiyal aktivite endeksi kullanılarak belirlenir. Genel önlemler mikrobiyal solunum kompost istikrar şart değil hastalık bastırma bir saldırgan patojen ve cimri R. solani7gibi ama ölçü. Bu çalışmada malzeme belirli bir kullanım için hazır olduğunu ve, Bahçe amaçlar için bitki çimlenmesi ve büyüme deneyleri tarafından belirlenir infers olgunluk üzerinde duruldu.
Yaşam kompost özleri R. solani büyüme önemli ölçüde daha fazla autoclaved örnekleri (P ≤ 0.0001) bastırılır. Isıyla microbially aracılı bir bastırma işaret mikrobiyal aktiviteyi kapalı öldürür. Bu plaka A Yöntem bir negatif kontrol için microbially aracılı biyolojik mücadele (Şekil 3) olarak hizmet vermektedir onaylar.
Şekil 3: R. solani büyüme vitroısıyla etkilerini, denetiminden mycelial büyüme yüzde değişim tarafından ölçülen. RADIUS mycelial büyüme autoclaved bir denetimi küçükse bir test 'mantar için baskılayıcı' malzemedir. Resimli anlamına gelir ± 1 standart hata vardır. Autoclaved denetim için hata çubuğu görmek için çok küçük. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
R. solani miselyum kompost özü üzerinde büyüme kompost yöntemi ve ham madde kompost tarifi ama değil olgunlaşma veya6,8kür süresini tarafından etkilendi. Büyüme vermicompost ve windrow süreçleri ve parke kabuğu (Şekil 4) içeren tarifleri tarafından düşürüldü. Suppressiveness temsil eden bir büyüme azalma R. solani.
Şekil 4: kompost ürünler suppressiveness karşılaştırmak için plaka rekabet tahlil kullanımı. ± 1 standart hata R. solani büyüme bir autoclaved başvuru plaka üzerinde değişimin anlamına gelir. Denetimleri ve tedavi karşılaştırma öldürücü R. solaniile aşılanmış. Değerler sıfırın altında suppressiveness temsil eder. R. solani suppressiveness kompost tarafından etkilenen A) yöntemi, B) süresi kür veya olgunlaşma ve C) tarifi. Karşılaştırıldığında süreçleri gazlı statik kazık (ASP), windrow (W), vermicompost (V) ve anaerobik sindirim (AD) olduğunu. Tarifi Malzemeler göre yemek atıkları (F), kümes hayvanları gübre (P), yemek atıkları ve kümes hayvanları gübre (FP), süt gübre (M) ve ahşap kabuk (H) olduğunu. Barlar yukarıda zıt harf önemli ölçüde farklı tedaviler göstermek. Bu rakam Neher vd değiştirildi 8 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biliyoruz önceki araştırma, belirli kompost R. solani bastırmak etkili ve baskılayıcı etkileri kompost içinde yaşayan mikroplar nedeniyle değil kompost6,8abiyotik özellikleri vardır. Media10karbon kimya etkilediğinden ısıyla kullanımı microbiota ' öldürmeye ' aracı olarak eleştirilmiştir. Isıyla Whatman No 1 kağıt üzerinden vakum filtrasyonu için kullanımı ile karşılaştırıldığında. Ne süzülmüş ne de autoclaved tedaviler R. solani büyüme6büyük bastırılması gösterdi. Filtrasyon Görünüşe göre hastalık bastırma mikroplar üreten büyük olasılıkla barındıran antibiyotik tarafından önemliydi daha büyük, katı parçacıklar kaldırıldı.
Basitlik ve uygun maliyet yönteminin avantajları. Benzer sonuçlar ve öneriler Alfano vd. Sadece patojen ve bitki ana bilgisayar değil mevcut 2, plaka rekabet tahlil bir hızlı ön değerlendirme hastalık bastırma ama tek başına tahlil olarak güvenilir değildir çünkü. Ayrıca, hastalık çevrenin olumsuz kurmak değil; R. solani hastalıkları sıcak ve nemli koşullarda1tarafından tercih. Genel olarak, tamamen bir tek Laboratuvar tahlil4,8tarafından taklit daha toprak ve kompost ekosistem daha fazla karmaşa içeride. Plaka tahlil bir kompost olgunluk ve üç mikrobiyal ecoenzymes, fosfataz nematodunun Dizin, β-1,4-glucosidase ve β-1,4-N-acetylglucosaminidase8de dahil olmak üzere diğer göstergeler için karşılaştırılabilir olduğunu. Ecoenzymes mikrobiyal topluluk ayrışma ve karbon ve besin ihtiyaçlarını durumunu yansıtır. Suppressiveness onayı bitki deneyleri ile elde edilebilir ama onlar tamamlamak için daha uzun sürer. İzole edip bir mantar saf kültürünü koruyarak kirlenmesini önlemek için ilgilenir. ATCC9 ipuçları ve teknikler Mayalar ve ipliksi mantarlar için sunmaktadır.
Hastalık süpresif özellikleri ticari sertifika için potansiyel bir aday yöntemidir. Sonuç bastırma bir toprak fonksiyonu olarak yansıtır. Mekanizmalar veya belirli mikrobiyal türler için hastalık bastırma sorumlu belirtmiyor. Yönelik bir uygulama inhibisyon bölge sıralama için DNA ekstraksiyon ve topluluk üyeleri tanımlaması için bir bölümünü kesmek için olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Vermont tarımsal deney istasyonu rekabetçi Hatch Program VT-HO1609 araştırma finanse. Lynn Fang M.S. tezini Vermont Üniversitesi6parçası olarak kullanılan yöntem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
