Summary
Un protocollo per l'analisi di un concorso di piastra identificare se un compost specifico è probabile contenere batteri e funghi che sopprimono la crescita di Rhizoctonia solaniè presentato.
Abstract
L'obiettivo era quello di sviluppare e ottimizzare analisi biologica un semplice, conveniente ed efficace per rilevare capacità soppressive di malattia di un compost specifico contro terricole fungo Rhizoctonia solani. R. solani è un agente patogeno di una vasta gamma di ospiti della pianta in tutto il mondo. Il fungo sopravvive in terreni come un saprofito e cresce rapidamente su agarizzati di semplice acqua. L'analisi del piatto è un metodo rapido per confrontare il compost per la loro capacità di rallentare la crescita di r. solani. L'analisi inoltre correla bene con soppressione di altri patogeni fungini terricole che sopravvivono come saprofiti nel suolo come primi arruginisce Alternaria, Fusarium, Phytophthora putrefazione di radice e marciume radicale Pythium.
Introduction
Rhizoctonia rappresenta un vasto complesso di funghi, di cui Donk Thanatephorus cucumeris (Frank) (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) è l'agente patogeno che causa marciume radicale e smorzamento-off1. Rhizoctonia solani è un agente patogeno aggressivo e un saprofita che può sopravvivere come sclerozi sotto condizioni ambientali1. Di conseguenza, ha una distribuzione globale e possono causare malattie su vasta gamma di ospiti della pianta tra cui Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae e Brassicaceae causando gravi perdite economiche.
Compost ha la capacità di agenti di biocontrollo per determinati patogeni di pianta2del porto. Tuttavia, non tutti i composti sono uguali né colpiscono tutti gli agenti patogeni allo stesso modo3. Carbonio a base di legno ha lignina superiore ai rapporti di cellulosa di fieno o paglia-carbonio basata compost. R. solani preferisce prontamente disponibile carbonio trovato in paglia. Al contrario, funghi di controllo biologico, come Trichoderma spp., sono più efficaci quando il carbonio è meno prontamente disponibile. Benefici funghi e batteri in compost possono sopprimere la malattia delle piante attraverso la competizione, antagonismo o che regolano la crescita della pianta3. Il dosaggio proposto rileva principalmente antagonismo creato da produzione di antibiotici, ecoenzymes o chelanti che sono dannosi per l'agente patogeno.
Pianta le analisi biologiche sono un gold standard per determinare se il compost favorire o scoraggiare la crescita della pianta4. Tuttavia, le analisi biologiche pianta sono richiede molto tempo (settimane o mesi) per completare che può essere più di quanto desiderato e richiede più lavoro per estrarre piante con radici per quantificare la gravità degli apparati radicali. In modo paragonabile robusto, ma più veloce analisi (giorni) sarebbe l'ideale per i programmi di controllo di qualità. L'obiettivo di questa carta è di dimostrare un test relativamente rapido e accurato per predire soppressivo potenziale di compost. Il metodo è stato modellato dopo Alfano et al. 5 con due eccezioni, compost estratti sono stati diluiti e agar di acqua è stato usato al posto di agar di patata destrosio (PDA). R. solani cresce rapidamente su agarizzati di acqua semplice considerando che PDA promosso la crescita di batteri e altri funghi che hanno contaminato la cultura6.
Questa analisi del piatto serve come un indicatore di soppressione che si applica a una gamma di agenti patogeni della pianta che sopravvivere nel suolo come saprofiti, tra cui r. solani7, primi arruginisce Alternaria, Fusarium, Phytophthora putrefazione di radice e marciume radicale Pythium. L'analisi di concorrenza del piatto è utile per lo screening di una gamma di prodotti di compost per contenente la comunità di microbi che fungono da agenti di controllo biologico degli agenti patogeni del suolo. Il dosaggio è stato uno degli indicatori più coerenti della soppressione della malattia in compost commerciale prodotti6,8. I prodotti sono stati scelti per la loro variazione nella ricetta, la maturità e processo di produzione.
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Protocol
1. preparare in anticipo
- Coltura fungosa Master (microrganismo da testare)
- Ordinare da American Type Culture Collection, collezione di microbiologia9, dal relativo teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) o MYA 4031.
- In alternativa: Raccogliere locali isolati come fatto dagli autori. Piantine di rosso ravanello (Raphanus sativus) funzionano bene come una pianta di esca; raccogliere suolo da una posizione nota per avere una storia di smorzamento-off o radice marciume causato da r. solani. Seminare i semi nel terreno e isolare dalle lesioni della radice quando le piantine hanno 3 o 4 settimane.
- Rimuovere le piantine dal suolo e sciacquare con acqua corrente. Cercare marrone tessuto nella regione ipocotile tra le foglie e la radice (Figura 1).
- Utilizzare una singola lama di rasoio taglio per tagliare segmenti di 1 cm dell'ipocotile o radice che hanno un colore marrone. Utilizzare pinze sterilizzate a fiamma per immergere i segmenti in soluzione al 10% di candeggina per 1 min, seguito da un risciacquo di s 10 in acqua sterile.
Nota: Parte superiore e inferiore di una capsula di Petri sterile sono utili contenitori per questo passaggio. - Pinze uso fiamma-sterilizzato per trasferire la pianta pezzi all'interno di un tovagliolo di carta per asciugare e quindi posizionare sulla superficie di una piastra Petri con agar (15 g in 1 L) di acqua.
- Posizionare la piastra di Petri all'interno di un contenitore di plastica con un coperchio e incubare a temperatura ambiente (circa 20 ° C). Pulire l'interno del contenitore con etanolo 75% o di candeggina al 10% e lasciare asciugare all'aria prima di inserire il piatto.
- Mantenere gli isolati in stoccaggio a lungo termine su una media minima di farina di mais agar slants (17 g in 1 L) (a 5 ° C).
Figura 1: i sintomi della malattia. Terreno contenente r. solani provoca chiazze germinazione e istituzione (a sinistra). Sintomi su semenzali di ravanello si presentano come lesioni marrone presso l'ipocotile (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Utilizzare piastre di patata destrosio agar (39 g in 1 L) per inoculo per questa analisi del piatto.
- Stabilire una cultura figlia della cultura di Rhizoctonia su agar patata destrosio con uno o due giorni prima del saggio, per assicurare è ben consolidata sulla piastra di coltura prima del dosaggio. Avviare la cultura figlia trasferendo un piccolo pezzo (10 mm di diametro) di r. solani dalla cultura master al centro di un piatto fresco di agar di patata destrosio (Figura 2).
Nota: Lavorare in una cappa a flusso laminare o pulire giù un banco di laboratorio con candeggina o 75% etanolo al 10% per minimizzare il rischio di contaminazione.
- Stabilire una cultura figlia della cultura di Rhizoctonia su agar patata destrosio con uno o due giorni prima del saggio, per assicurare è ben consolidata sulla piastra di coltura prima del dosaggio. Avviare la cultura figlia trasferendo un piccolo pezzo (10 mm di diametro) di r. solani dalla cultura master al centro di un piatto fresco di agar di patata destrosio (Figura 2).
- Autoclave 25 mL provette con aliquote di 10 mL di acqua distillata (2 x numero di campioni).
2. preparazione dei campioni per Test
- Aggiungere 10 mL di acqua in autoclave in 25 mL provette due campioni indipendenti 0,5 g per ogni campione di compost. Agitare le provette durante la notte.
- Etichettare le provette con numeri di esemplare unico e ogni membro della coppia come un (riferimento) o B (campione).
- Dopo 24 h, aggiungere 1,5 g di agar pianura a 90 mL di acqua distillata in mLconical due 125 boccette.
- Autoclave entrambi beute con agar e del campione di ogni coppia per 20 min con un'impostazione di scarico lento.
- Dopo l'autoclave, è possibile inserire le beute con agar in bagnomaria a 45 ° C fino a raggiungere equilibrio (circa 30 min). Non mettere qualsiasi fanghi di campione nel bagnomaria fino a quando si sarà raffreddata a 45 ° C.
Figura 2: illustrazione del protocollo. Spine di r. solani sono collocate su piastre di Petri contenente Estratto di acqua di compost. Il diametro della crescita micelia è misurato dopo 1-2 giorni con l'aiuto di un microscopio stereo per migliorare la risoluzione e contrasto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Versare l'impasto di compost A campione (riferimento in autoclave) agar fuso del matraccio agar A. Ricciolo di disperdere compost nell'agar.
- Versare l'impasto di compost B campione (campione vivente) agar fuso del matraccio agar B. Ricciolo di disperdere compost nell'agar.
- Versare il composto di ciascuna beuta in cinque Petri in plastica che sono 100 mm di diametro.
- Lasciare il pernottamento cool piastre così l'agar si indurisce.
3. aggiungere la sfida di Rhizoctonia
- Utilizzando una tecnica asettica, trasferire pezzi di uguali dimensioni di r. solani per ogni coppia di piastre di agar di campione (3-5 mm corkborer funziona bene per stabilire pezzi di dimensioni uguali). Prendete pezzi della Colonia dal margine esterno della Colonia per assicurare micelio attivamente sta crescendo.
Nota: Lavorare in una cappa a flusso laminare o pulire giù un banco di laboratorio con candeggina o 70% etanolo al 10%. - Incubare le piastre a temperatura ambiente per 1-2 giorni fino a quando la crescita di Colonia raggiunge circa a metà strada al bordo delle piastre A.
4. misura r. solani crescita
- Misurare il raggio del micelio in ogni piatto per la più vicina 1 mm con un righello trasparente piatto usando un microscopio stereo con illuminazione trasmessa.
Nota: Illuminazione in campo scuro o obliquo renderà più facile da vedere e misurare le ife trasparente. A questo punto, zone di inibizione sarà visibile intorno ai frammenti di compost nella piastra B se il compost è soppressivo. - Registrare il raggio a tre posti per piastra e calcolare una media dei tre a servire come misura rappresentativa.
- Sottrarre la media delle piastre B dalle piastre A. Se B < un poi ci sono microbi nelle piastre di B che sono soppressive al r. solani patogeno.
- Dividere il raggio medio per il numero di giorni di sfida per esprimere unità della relativa soppressione come un tasso, micelio mm al giorno.
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Representative Results
Composto finito dovrebbe essere stabile e maturo, due termini che vengono spesso utilizzati in modo intercambiabile, quindi può essere confezionato e trasportato in modo sicuro e non causa effetti negativi durante il suo utilizzo finale4. Stabilità è una resistenza alla decomposizione e viene in genere determinato utilizzando gli indici di attività microbica. Misure generali di respirazione microbica possono misurare la stabilità di compost ma non necessariamente malattia soppressione di un agente patogeno aggressivo e saprofiti come r. solani7. Questo studio si è concentrato sulla maturità che deduce il materiale è pronto per un uso particolare e, per scopi ortocolturali, è determinato mediante le analisi di germinazione e la crescita di pianta.
Estratti del compost vivente ha soppresso la crescita di r. solani significativamente più di campioni in autoclave (P ≤ 0,0001). Sterilizzazione in autoclave uccide l'attività microbica, che punta a una soppressione mediata microbica. Questo conferma che la piastra A nel metodo serve come controllo negativo per il controllo biologico microbica mediata (Figura 3).
Figura 3: effetti della sterilizzazione in autoclave il r. solani crescita in vitro, come misurato dalla variazione percentuale in crescita micelia dal controllo. Un materiale di prova è 'soppressivo' al fungo se il raggio di crescita micelia è minore di un controllo in autoclave. Illustrati sono mezzi ± 1 errore standard. La barra di errore per il controllo in autoclave è troppo piccola per vedere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Crescita del micelio di r. solani su compost estratto è stato influenzato dal metodo di compost e materia prima la ricetta del compost ma non la durata di maturazione o stagionatura6,8. Crescita è stata ridotta di vermicompost, Andana processi e ricette che contiene corteccia di legno duro (Figura 4). Suppressiveness rappresenta una riduzione nella crescita di r. solani.
Figura 4: utilizzo di test di competizione mediante piastra per confrontare il suppressiveness di compost prodotto. Significa ± 1 errore standard del cambiamento nella crescita di r. solani su una piastra di riferimento in autoclave. Entrambi i controlli e i confronti del trattamento sono stati inoculati con virulento r. solani. Valori minori di zero rappresentano suppressiveness. Suppressiveness di r. solani è stata colpita da compost A) metodo, B) la durata di stagionatura o maturazione e C) ricetta. Rispetto a processi erano mucchio statico aerato (ASP), andana (W), vermicompost (V) e la digestione anaerobica (AD). Ricetta ingredienti rispetto erano rifiuti alimentari (F), deiezioni avicole (P), rifiuti alimentari e deiezioni avicole (FP), lattiero-caseari letame (M) e corteccia di legno duro (H). Lettere a contrasto sopra barre indicano trattamenti che sono significativamente differenti. Questa figura è stata modificata da Neher et al. 8 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sappiamo da precedenti ricerche, che alcuni composti sono efficaci a sopprimere r. solani e che gli effetti soppressivi sono dovuto i microbi che vivono nel compost, non le proprietà abiotici di compost6,8. L'uso di autoclave come un mezzo per 'uccidere' microbiota è stata criticata perché interessa la chimica del carbonio di media10. Abbiamo confrontato l'uso di autoclave per filtrazione sotto vuoto tramite carta Whatman n. 1. Trattamenti che non erano né filtrata né in autoclave ha mostrato la soppressione più grande di r. solani crescita6. Filtrazione rimosso le particelle più grandi, tinta che erano apparentemente importante alla soppressione di malattia di probabile antibiotico harboring producendo i microbi.
Vantaggi del metodo sono la semplicità e la convenienza. Simili a delle conclusioni e raccomandazioni del Alfano et al. 2, l'analisi di concorrenza del piatto è una rapida valutazione preliminare di soppressione della malattia ma non affidabile come standalone analisi perché solo l'agente patogeno e non la pianta ospite, è presente. Inoltre, la malattia non sarebbe stabilire se l'ambiente era sfavorevole; R. solani malattie sono favoriti da condizioni di caldo e umido1. Nel complesso, c'è più la complessità dell'ecosistema del suolo e il compost, che potrebbe essere imitato interamente da un unico laboratorio analisi4,8. L'analisi del piatto è paragonabile ad altri indicatori, tra cui un indice del nematode della maturità di compost e tre ecoenzymes microbica, fosfatasi, β-1,4-glucosidasi e β-1,4-N-acetylglucosaminidase8. Il ecoenzymes riflette lo stato di decomposizione e il carbonio e dei nutrienti esigenze della comunità microbica. Conferma di suppressiveness può essere realizzato con pianta saggi ma impiegano più tempo per completare. Isolare e mantenere una coltura pura di un fungo si prende cura per evitare la contaminazione. ATCC9 offre suggerimenti e tecniche per la coltura di lieviti e funghi filamentosi.
Il metodo è un potenziale candidato per la certificazione delle imprese di proprietà soppressiva malattia. Il risultato riflette la soppressione in funzione del terreno. Non specifica meccanismi o specifiche specie microbica responsabile della soppressione di malattia. Una futura applicazione potrebbe essere quello di tagliare una parte della zona di inibizione per estrazione del DNA per il sequenziamento e l'identificazione dei membri della Comunità.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il Vermont Agricultural Experiment Station competitivo Hatch programma VT-HO1609 ha finanziato la ricerca. Lynn Fang ha utilizzato il metodo come parte della sua tesi di M.S. presso University of Vermont6.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
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- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
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- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
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