Summary
प्रस्तुत एक प्लेट प्रतियोगिता परख के लिए एक प्रोटोकॉल की पहचान है कि क्या एक विशिष्ट खाद बैक्टीरिया और कवक है कि Rhizoctonia सोलानीके विकास को रोकने की संभावना है ।
Abstract
लक्ष्य को विकसित करने और एक सरल, सस्ती, और प्रभावी परख soilborne कवक Rhizoctonia सोलानीके खिलाफ एक विशिष्ट खाद की बीमारी दमन क्षमता का पता लगाने के लिए किया गया था । आर सोलानी संयंत्र दुनिया भर में मेजबान की एक विस्तृत श्रृंखला का एक रोगज़नक़ है । कवक एक saprophyte के रूप में मिट्टी में जीवित रहता है और सरल जल आगर मीडिया पर तेजी से बढ़ता है । थाली परख एक तीव्र विधि के लिए उनकी क्षमता आर सोलानीके विकास को धीमा करने के लिए खाद की तुलना है । परख भी अंय soilborne कवक रोगजनकों के दमन के साथ अच्छी तरह से संबद्ध है कि मिट्टी में saprophytes जैसे ओल्टेर्नेरिया जल्दी तुषार के रूप में जीवित है, फ़्यूज़ेरियम टूटेगी, फाईटोप्थोरा जड़ सड़ांध, और Pythium जड़ सड़ांध ।
Introduction
Rhizoctonia कवक का एक व्यापक परिसर का प्रतिनिधित्व करता है, जिनमें से Thanatephorus cucumeris (फ्रैंक) Donk (anamorph = Rhizoctonia सोलानी Kühn) जड़ सड़ांध और भिगोने के कारण रोगज़नक़ है-बंद1। Rhizoctonia सोलानी एक आक्रामक रोगज़नक़ और एक saprophyte है कि प्रतिकूल पर्यावरण की स्थिति के तहत sclerotia के रूप में जीवित रह सकते है1। नतीजतन, यह एक वैश्विक वितरण किया है और Solanaceae, फैबेसी, झाड़ सहित संयंत्र मेजबान की व्यापक रेंज पर रोग पैदा कर सकता है, और गंभीर आर्थिक नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप Brassicaceae ।
खाद कुछ संयंत्र के लिए नियंत्रण एजेंटों बंदरगाह की क्षमता है2रोगजनकों । हालांकि, नहीं सभी खाद एक जैसे है और न ही वे सभी रोगजनकों को प्रभावित इसी तरह3। लकड़ी आधारित कार्बन उच्च lignin घास या पुआल कार्बन आधारित खाद से अनुपात फाइबर है । आर सोलानी आसानी से उपलब्ध भूसे में पाया कार्बन पसंद करते हैं । इसके विपरीत, जैविक नियंत्रण कवक, जैसे ट्राइकोडर्मा एसपीपी., अधिक प्रभावी रहे है जब कार्बन कम आसानी से उपलब्ध है । लाभकारी कवक और खाद में बैक्टीरिया प्रतियोगिता के माध्यम से संयंत्र रोग को दबा सकते हैं, विरोध या संयंत्र विकास को विनियमित3. प्रस्तावित परख मुख्यतः एंटीबायोटिक दवाओं, ecoenzymes या chelators है कि रोगज़नक़ के लिए हानिकारक है के उत्पादन के द्वारा बनाई गई विरोध का पता लगाता है ।
संयंत्र परख एक सोने के मानक निर्धारित करने के लिए कि क्या खाद एहसान या संयंत्र विकास रोकते4हैं । हालांकि, संयंत्र परख समय लेने वाले है (सप्ताह के महीने) को पूरा करने के लिए जो अब से वांछित हो सकता है और अधिक परिश्रम की आवश्यकता के लिए जड़ों के साथ पौधों को निकालने के लिए रूट सिस्टम की गंभीरता को बढ़ाता है । तुलना मजबूत है, लेकिन जल्दी (दिन) परख गुणवत्ता नियंत्रण कार्यक्रमों के लिए आदर्श होगा । इस कागज के लक्ष्य के लिए एक अपेक्षाकृत जल्दी और सही परीक्षण के लिए खाद की दमन क्षमता की भविष्यवाणी है । विधि Alfano एट अल के बाद नमूनों था । 5 दो अपवादों के साथ, खाद का अर्क पतला किया गया और पानी आगर आलू डेक्सट्रोज आगर (पीडीए) के स्थान पर इस्तेमाल हुआ । आर. सोलानी सरल जल आगर मीडिया पर तेजी से बढ़ता है, जबकि पीडीए बैक्टीरिया और अंय कवक है कि संस्कृति6प्रदूषित के विकास को बढ़ावा दिया ।
इस प्लेट परख दमन का एक संकेतक है कि संयंत्र रोगजनकों कि आर सोलानी7, ओल्टेर्नेरिया जल्दी तुषार, फ़्यूज़ेरियम टूटेगी, फाईटोप्थोरा जड़ सड़ांध, और Pythium जड़ सड़ांध सहित saprophytes के रूप में मिट्टी में जीवित रहने की एक सीमा पर लागू होता है के रूप में कार्य करता है । थाली प्रतियोगिता परख रोगाणुओं के समुदायों कि मिट्टी रोगजनकों के जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में सेवा के लिए खाद उत्पादों की एक सीमा स्क्रीन उपयोगी है । परख वाणिज्यिक खाद6,8उत्पादों में रोग दमन के सबसे सुसंगत संकेतकों में से एक था । उत्पाद नुस्खा, परिपक्वता, और उत्पादन की प्रक्रिया में उनकी भिन्नता के लिए चुना गया था.
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Protocol
1. पहले से तैयार करें
- मास्टर कवक संस्कृति (परीक्षण जीव)
- अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह से आदेश, माइक्रोबायोलॉजी संग्रह9, अपने teleomorph Thanatephorus cucumeris (फ्रैंक) द्वारा (ATCC १०१५४) या म्या ४०३१.
- वैकल्पिक रूप से: स्थानीय अलग इकट्ठा के रूप में लेखकों द्वारा किया । लाल मूली के अंकुर (Raphanus कुंकुम) एक चारा संयंत्र के रूप में अच्छी तरह से काम करते हैं; एक स्थान से मिट्टी ले लीजिए भिगोना बंद या जड़ सड़ांध के कारण आर सोलानीके एक इतिहास है । मिट्टी में बीज बोना और जड़ घावों से अलग जब अंकुर 3 से 4 सप्ताह पुराना है ।
- मिट्टी से अंकुर निकालें और नल के पानी के साथ कुल्ला । पत्तियों और जड़ (चित्रा 1) के बीच hypocotyl क्षेत्र में भूरे रंग के ऊतकों के लिए देखो ।
- hypocotyl या जड़ है कि एक भूरे रंग का है के 1 सेमी क्षेत्रों में कटौती करने के लिए एक एकल उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें । उपयोग लौ-निष्फल संदंश 1 मिनट, एक 10 एस बाँझ पानी में कुल्ला के बाद के लिए 10% घरेलू ब्लीच के समाधान में खंडों डुबकी ।
नोट: एक बाँझ पेट्री पकवान के ऊपर और नीचे इस कदम के लिए उपयोगी कंटेनर हैं । - लौ निष्फल संदंश का प्रयोग करने के लिए एक कागज तौलिया के अंदर के लिए संयंत्र के टुकड़ों को पॅट सूखी और फिर पानी (1 एल में 15 ग्राम) आगर के साथ एक पेट्री पकवान की सतह पर जगह स्थानांतरण ।
- एक ढक्कन और कमरे के तापमान (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) पर गर्मी के साथ एक प्लास्टिक कंटेनर के अंदर पेट्री पकवान प्लेस । 10% ब्लीच या ७५% इथेनॉल के साथ कंटेनर के इंटीरियर पोंछ और यह पकवान डालने से पहले शुष्क हवा ।
- मकई भोजन आगर (1 एल में 17 ग्राम) तिरछा (5 डिग्री सेल्सियस) के एक न्यूनतम मीडिया पर लंबी अवधि के भंडारण में अलग रखें ।
चित्रा 1: रोग लक्षण । मृदा युक्त R. सोलानी परिणाम बद अंकुरण और स्थापना (बाएं) में । मूली अंकुर पर लक्षण hypocotyl (दाएं) में भूरे रंग के घावों के रूप में होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
- इस प्लेट की परख के लिए इनोक्युलम के लिए आलू डेक्सट्रोज आगार प्लेट्स (३९ g 1 L) का उपयोग करें ।
- आलू डेक्सट्रोज आगर पर Rhizoctonia संस्कृति की एक बेटी संस्कृति की स्थापना एक या दो दिन पहले परख करने के लिए, यह अच्छी तरह से परख से पहले संस्कृति की थाली पर स्थापित है बीमा करने के लिए । मास्टर कल्चर से आर. के. सोलानी का छोटा टुकड़ा (10 एमएम व्यास) स्थानांतरित करके बेटी संस्कृति को आलू डेक्सट्रोज आगर (चित्रा 2) की ताजी प्लेट के केंद्र में शुरू करें ।
नोट: एक लामिना प्रवाह हूड में काम या नीचे 10% ब्लीच या ७५% इथेनॉल के साथ एक प्रयोगशाला पीठ पोंछने के लिए संदूषण के जोखिम को कम ।
- आलू डेक्सट्रोज आगर पर Rhizoctonia संस्कृति की एक बेटी संस्कृति की स्थापना एक या दो दिन पहले परख करने के लिए, यह अच्छी तरह से परख से पहले संस्कृति की थाली पर स्थापित है बीमा करने के लिए । मास्टर कल्चर से आर. के. सोलानी का छोटा टुकड़ा (10 एमएम व्यास) स्थानांतरित करके बेटी संस्कृति को आलू डेक्सट्रोज आगर (चित्रा 2) की ताजी प्लेट के केंद्र में शुरू करें ।
- आसुत जल के 10 मिलीलीटर aliquots के साथ आटोक्लेव 25 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब (2 नमूनों की संख्या x) ।
2. नमूनों की जांच की तैयारी
- प्रत्येक खाद परीक्षण के नमूने के दो स्वतंत्र ०.५ ग्राम नमूना जोड़ें 25 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूबों में autoclaved पानी की 10 मिलीलीटर । शेक परीक्षण ट्यूब रातोंरात ।
- लेबल परीक्षण ट्यूबों अनंय नमूना संख्याओं के साथ, और एक (संदर्भ) या B (नमूना) के रूप में जोड़ी के प्रत्येक सदस्य ।
- 24 घंटे के बाद, सादे आगार के १.५ ग्राम जोड़ें २ १२५ mLconical कुप्पी में आसुत पानी की ९० मिलीलीटर ।
- आटोक्लेव दोनों शंकु कुप्पी, और एक धीमी निकास सेटिंग के साथ 20 मिनट के लिए प्रत्येक जोड़ी का एक नमूना है ।
- आटोक्लेव के बाद, एक ४५ ° c पानी के स्नान में आगर के साथ शंकु कुप्पी जगह जब तक वे संतुलन (लगभग 30 मिनट) तक पहुंचने । जब तक यह ४५ डिग्री सेल्सियस ठंडा है पानी के स्नान में किसी भी नमूना slurries मत डालो ।
चित्र 2: प्रोटोकॉल का चित्रण । आर सोलानी के प्लग को खाद पानी निकालने वाले पेट्री व्यंजन पर रखा गया है । mycelial विकास का व्यास एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप की सहायता से संकल्प और इसके विपरीत में सुधार के साथ 1-2 दिनों के बाद मापा जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
- एक नमूना (autoclaved संदर्भ) एक आगर कुप्पी के पिघला हुआ आगर में खाद घोल डालो । आगर में खाद फैलाने के लिए घूमता रहा.
- बी आगर कुप्पी के पिघले हुए आगर में बी सैंपल (लिविंग सैंपल) खाद घोल डालो । आगर में खाद फैलाने के लिए घूमता रहा.
- पांच प्लास्टिक पेट्री व्यंजन है कि व्यास में १०० मिमी है में प्रत्येक कुप्पी के मिश्रण डालो ।
- प्लेटें रात भर शांत तो आगर सख्त कर देते हैं ।
3. Rhizoctonia चैलेंज जोड़ें
- अपूतित तकनीक का प्रयोग, आर सोलानी के बराबर आकार के टुकड़ों का नमूना आगर प्लेट्स के प्रत्येक जोड़ी के हस्तांतरण (3 से 5 मिमी corkborer अच्छी तरह से समान आकार के टुकड़ों को स्थापित करने के लिए काम करता है) । कालोनी के बाहर मार्जिन से कालोनी के टुकड़े ले गइ mycelium का बीमा करने के लिए सक्रिय रूप से बढ़ रहा है ।
नोट: एक लामिना प्रवाह हूड में काम या नीचे 10% ब्लीच या ७०% इथेनॉल के साथ एक प्रयोगशाला पीठ पोंछ । - 1-2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें जब तक कॉलोनी विकास के बारे में एक प्लेटों के किनारे करने के लिए आधे रास्ते तक पहुंचता है ।
4. उपाय आर सोलानी विकास
- संचारित रोशनी के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक स्पष्ट फ्लैट शासक के साथ निकटतम 1 मिमी करने के लिए प्रत्येक थाली में mycelium की त्रिज्या को मापने.
नोट: परोक्ष या अंधेरे क्षेत्र रोशनी यह आसान देखने के लिए और पारदर्शी hyphae को मापने के लिए कर देगा । इस बिंदु पर, अवरोध के क्षेत्रों बी थाली में खाद टुकड़े के आसपास दिखाई देगा अगर खाद दबा है । - प्रति प्लेट तीन स्थानों पर त्रिज्या रिकॉर्ड और तीन के एक मतलब की गणना के लिए एक प्रतिनिधि उपाय के रूप में सेवा करते हैं ।
- एक प्लेट से बी प्लेटों के माध्य घटाना । यदि b < A तो वहां रोगाणुओं बी प्लेटों में है कि आर सोलानी रोगज़नक़ को दबा रहे हैं ।
- एक दर के रूप में रिश्तेदार दमन की एक्सप्रेस इकाइयों के लिए चुनौती के दिनों की संख्या से मतलब त्रिज्या विभाजित, प्रति दिन मिमी mycelium ।
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Representative Results
समाप्त खाद स्थिर और परिपक्व होना चाहिए, दो शब्दों है कि अक्सर interchangeably उपयोग किया जाता है, तो यह सुरक्षित रूप से पैक किया और पहुंचाया जा सकता है, और इसके अंत का उपयोग4के दौरान प्रतिकूल प्रभाव का कारण नहीं है । स्थिरता अपघटन के लिए एक प्रतिरोध है और आमतौर पर माइक्रोबियल गतिविधि के सूचकांक का उपयोग कर निर्धारित है । माइक्रोबियल श्वसन के सामान्य उपाय खाद स्थिरता का उपाय हो सकता है, लेकिन जरूरी नहीं कि एक आक्रामक रोगज़नक़ के रोग दमन और saprophyte जैसे आर सोलानी7। परिपक्वता जो सामग्री का अनुमान एक विशेष उपयोग के लिए तैयार है पर ध्यान केंद्रित अध्ययन, और, बागवानी प्रयोजनों के लिए, संयंत्र अंकुरण और विकास की परख द्वारा निर्धारित किया जाता है ।
जीवित खाद के अर्क आर सोलानी विकास काफी autoclaved नमूनों (पी ≤ ०.०००१) से अधिक दबा । Autoclaving एक माइक्रोबियल मध्यस्थता दमन की ओर इशारा करते हुए, माइक्रोबियल गतिविधि को मारता है । इस विधि में है कि एक थाली की पुष्टि माइक्रोबियल मध्यस्थता जैविक नियंत्रण (चित्रा 3) के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है ।
चित्रा 3: नियंत्रण से mycelial वृद्धि में प्रतिशत परिवर्तन द्वारा मापा के रूप में इन विट्रो में आर सोलानी विकास पर autoclaving के प्रभाव। एक परीक्षण सामग्री कवक के लिए ' दमन ' है अगर mycelial विकास की त्रिज्या एक autoclaved नियंत्रण से कम है । सचित्र अर्थ है ± 1 मानक त्रुटि । autoclaved नियंत्रण के लिए त्रुटि पट्टी देखने के लिए बहुत छोटी है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
खाद निकालने पर आर. सोलानी mycelium की वृद्धि खाद विधि और खाद की नुस्खा में कच्चे माल से प्रभावित था लेकिन परिपक्वता या6,8इलाज की अवधि नहीं । वृद्धि vermicompost और windrow प्रक्रियाओं और दृढ़ लकड़ी छाल (चित्रा 4) युक्त व्यंजनों द्वारा कम किया गया था । Suppressiveness आर सोलानी के विकास में कमी का प्रतिनिधित्व करता है ।
चित्रा 4: थाली प्रतियोगिता परख का उपयोग करने के लिए खाद उत्पादों की suppressiveness तुलना करें । एक autoclaved संदर्भ प्लेट पर आर सोलानी विकास में परिवर्तन की ± 1 मानक त्रुटि का अर्थ है । नियंत्रण और उपचार दोनों तुलना विषमय आर सोलानीके साथ inoculated थे । शून्य से नीचे के मान suppressiveness का प्रतिनिधित्व करते हैं. आर सोलानी का Suppressiveness खाद से प्रभावित था एक) विधि, ख) इलाज या परिपक्वता की अवधि, और सी) नुस्खा । प्रक्रियाओं की तुलना में वातित स्थिर ढेर (ASP), windrow (W), vermicompost (V) और anaerobic पाचन (AD) थे । नुस्खा सामग्री की तुलना में खाद्य अपशिष्ट (एफ) थे, पोल्ट्री खाद (पी), खाद्य अपशिष्ट और पोल्ट्री खाद (FP), डेयरी खाद (एम), और दृढ़ लकड़ी छाल (एच) । सलाखों के ऊपर विषम पत्र उपचार है कि काफी अलग है निरूपित । यह आंकड़ा Neher एट अल से संशोधित किया गया है । 8 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
हम पिछले अनुसंधान से पता है, कि कुछ खाद आर सोलानी को दबाने में प्रभावी रहे है और है कि दमन प्रभाव खाद में रहने वाले रोगाणुओं के कारण कर रहे हैं, नहीं खाद6,8के अजैव गुण । microbiota को ' किल ' करने के साधन के रूप में autoclaving के इस्तेमाल की आलोचना की गई है क्योंकि यह मीडिया10के कार्बन केमिस्ट्री को प्रभावित करता है । हम Whatman No .1 पेपर के माध्यम से वैक्यूम छानने का autoclaving के उपयोग की तुलना में । उपचार है कि न तो फ़िल्टर किया गया और न ही autoclaved आर सोलानी विकास6का सबसे बड़ा दमन दिखाया । निस्पंदन बड़े, ठोस कणों कि संभावना जाहिरा तौर पर एंटीबायोटिक उत्पादन रोगाणुओं बंदरगाह द्वारा रोग दमन के लिए महत्वपूर्ण थे हटा दिया ।
विधि के लाभ सादगी और सामर्थ्य हैं । Alfano एट अल के निष्कर्ष और सिफारिशों के समान । 2, थाली प्रतियोगिता परख रोग दमन के एक त्वरित प्रारंभिक मूल्यांकन लेकिन एक स्वसंपूर्ण परख के रूप में विश्वसनीय नहीं है, क्योंकि केवल रोगज़नक़, और नहीं संयंत्र मेजबान, मौजूद है । इसके अलावा, रोग अगर पर्यावरण प्रतिकूल था स्थापित नहीं होता; आर सोलानी रोगों गर्म और नम शर्तों1द्वारा इष्ट हैं । कुल मिलाकर, वहां मिट्टी और खाद पारिस्थितिकी तंत्र में अधिक जटिलता है एक एकल प्रयोगशाला परख4,8द्वारा पूरी तरह से नकल उतारा जा सकता है । प्लेट परख खाद परिपक्वता और तीन माइक्रोबियल ecoenzymes, फॉस्फेट, β-1, 4-ग्लुकोसिडेस निरोधक और β-1, 4-N-acetylglucosaminidase8के एक निमेटोड सूचकांक सहित अन्य संकेतकों के लिए तुलनीय है । ecoenzymes अपघटन के राज्य और सूक्ष्म जीवाणु समुदाय के कार्बन और पोषक तत्वों की जरूरत को दर्शाता है । suppressiveness की पुष्टि संयंत्र परख के साथ प्राप्त किया जा सकता है लेकिन वे अब लेने के लिए पूरा करें । एक कवक की एक शुद्ध संस्कृति को अलग और बनाए रखने के लिए संदूषण से बचने का ख्याल रखता है । ATCC9 संवर्धन खमीर और रेशा कवक के लिए सुझाव और तकनीक प्रदान करता है ।
विधि रोग दमन संपत्तियों के वाणिज्यिक प्रमाणीकरण के लिए एक संभावित उंमीदवार है । परिणाम एक मिट्टी समारोह के रूप में दमन को दर्शाता है । यह तंत्र या विशिष्ट माइक्रोबियल प्रजातियों रोग दमन के लिए जिंमेदार निर्दिष्ट नहीं करता है । एक भविष्य के आवेदन के लिए बाहर sequencing और समुदाय के सदस्यों की पहचान के लिए डीएनए के निष्कर्षण के लिए अवरोध क्षेत्र के एक हिस्से में कटौती हो सकती है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
वरमोंट कृषि प्रयोग स्टेशन प्रतिस्पर्धी हैच कार्यक्रम VT-HO1609 अनुसंधान वित्त पोषित । लिन फेंग6वरमोंट विश्वविद्यालय में उसे M.S. थीसिस के भाग के रूप में विधि का इस्तेमाल किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
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- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
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- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
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