Summary
Gepresenteerd is een protocol voor een plaat competitie test om te bepalen of een specifieke compost is waarschijnlijk bevatten bacteriën en schimmels die onderdrukken van de groei van Rhizoctonia solani.
Abstract
Het doel was om te ontwikkelen en optimaliseren van een eenvoudige, betaalbare en effectieve bioassay op te sporen ziekte onderdrukkende capaciteit van een specifieke compost tegen soilborne schimmel Rhizoctonia solani. R. solani is een ziekteverwekker van een breed scala van plant hosts wereldwijd. De schimmel in de bodem als een saprophyte overleeft en groeit snel op eenvoudige water agarmedia. De bepaling van de plaat is een snelle methode om te vergelijken compost voor hun vermogen om te vertragen de groei van R. solani. De assay correleert ook goed met onderdrukking van andere soilborne schimmel ziekteverwekkers die als saprofyten in de bodem zoals Alternaria vroege vergalt, verwelken Fusarium, Phytophthora wortelrot en Pythium wortelrot overleven.
Introduction
Rhizoctonia vertegenwoordigt een brede complex van schimmels, van welke Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) is de verwekker veroorzaken wortelrot en demping-off1. Rhizoctonia solani is een agressieve pathogenen en een saprophyte dat als sclerotia onder ongunstige milieu omstandigheden1 overleven kan. Dientengevolge, het heeft een wereldwijde distributie en ziekte kan veroorzaken op breed scala van plant gastheren met inbegrip van Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae en Brassicaceae tot ernstige economische verliezen.
Compost heeft de capaciteit om de haven biocontrol agenten voor bepaalde fabriek ziekteverwekkers2. Echter niet alle compost zijn gelijk, noch zijn zij van invloed op alle ziekteverwekkers op dezelfde manier3. Hout gebaseerde koolstof heeft hogere lignine cellulose verhouding dan hooi of stro-koolstof compost gebaseerde. R. solani verkiest beschikbaar koolstof gevonden in stro. Biologische bestrijding schimmels, zoals Trichoderma spp., zijn daarentegen effectiever wanneer koolstof minder gemakkelijk beschikbaar is. Heilzaam schimmels en bacteriën tot compost kunnen onderdrukken plantenziekten door middel van competitie, antagonisme of het reguleren van de plant groei3. De voorgestelde bepaling detecteert voornamelijk antagonisme gemaakt door productie van antibiotica, ecoenzymes of chelatoren die schadelijk voor het pathogene agens oplevert zijn.
Plant bioassays zijn een goudstandaard te bepalen of de compost gunst of plant groei4afschrikken. Plant bioassays zijn echter tijdrovend (weken tot maanden) om uit te voeren die mogelijk langer dan gewenst en meer arbeid vereist te uittreksel van planten met wortels te kwantificeren van de ernst van het wortelstelsel. Relatief robuust, maar sneller (dagen) testen zou ideaal zijn voor kwaliteitscontrole-programma's. Het doel van deze paper is om aan te tonen van een relatief snelle en nauwkeurige test om te voorspellen onderdrukkende potentieel van compost. De methode was patroon na Alfano et al. 5 twee uitzonderingen na, compost extracten werden verdund en water agar werd gebruikt in plaats van aardappel dextrose agar (PDA). R. solani groeit snel op eenvoudige water agarmedia overwegende dat PDA bevorderd de groei van bacteriën en andere schimmels die de cultuur6besmet.
Deze test van de plaat dient als indicator voor onderdrukking die geldt voor een aantal plant ziekteverwekkers die overleven in de bodem als saprofyten met inbegrip van R. solani7, Alternaria vroege vergalt verwelken Fusarium, Phytophthora wortelrot en Pythium wortelrot. De plaat concurrentie bepaling is nuttig om een aantal van de compost producten bevatten gemeenschappen van microben die als biologische bestrijders van ziekteverwekkers van de bodem dienen van het scherm. De test was een van de meest consistente indicatoren van ziekte onderdrukking in commerciële compost producten6,8. Producten werden gekozen voor hun variatie in recept, vervaldatum en productieproces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiden op voorhand
- Master schimmel cultuur (testorganisme)
- Bestellen bij de American Type Culture Collection, microbiologie collectie9, door zijn teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) of MYA 4031.
- Alternatief: Verzamelen lokale isolaten, zoals gedaan door de auteurs. Zaailingen van rode radijs (Raphanus sativus) goed werken als een aas plant; bodem van een locatie die bekend is dat hebben een geschiedenis van demping-off of wortel rot veroorzaakt door R. solaniverzamelen. Zaaien van zaden in de bodem en isoleren van wortel laesies wanneer zaailingen 3 tot 4 weken oud zijn.
- Verwijderen van zaailingen uit bodem en spoel met leidingwater. Kijk voor bruine weefsel in het gebied van de hypocotyl tussen de bladeren en de wortel (Figuur 1).
- Gebruik een enkele scherpe scheermesje te snijden 1 cm segmenten van de hypocotyl of de hoofdmap die een bruine kleur hebben. Het gebruik van vlam-gesteriliseerde pincet dip van de segmenten in de 10%-oplossing van huishoudelijk bleekmiddel voor 1 min, gevolgd door een 10 s spoeling in steriel water.
Opmerking: De boven- en onderkant van een steriele petrischaal zijn bruikbaar recipiënten voor deze stap. - Gebruik vlam-gesteriliseerde pincet te dragen van de plant stukken aan de binnenkant van een keukenrol om pat droog en plaats op het oppervlak van een petrischaal met water agar (15 g in 1 L).
- Plaats de petrischaal in een plastic container met een deksel en Incubeer bij kamertemperatuur (ongeveer 20 ° C). Veeg de binnenkant van de container met 10% bleekwater of 75% ethanol en laat het droge lucht voordat u de schotel.
- Houd de isolaten in langdurige opslag op een minimale media maïsmeel agar (17 g in 1 L) schuin (bij 5 ° C).
Figuur 1: ziekte symptomen. Bodem met R. solani resulteert in fragmentarisch kieming en vestiging (links). Symptomen op radijs zaailingen optreden als bruine laesies op de hypocotyl (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Aardappel dextrose agar platen (39 g in 1 L) voor entmateriaal voor deze plaat assay gebruiken.
- Stellen van een cultuur van de dochter van Rhizoctonia cultuur op aardappel dextrose agar een of twee dagen voor de bepaling, om te verzekeren het is reeds lang gevestigd op de plaat van de cultuur voor de bepaling. Start de dochter cultuur door overdracht van een klein stukje R. solani (10 mm doorsnede) van de master cultuur naar het midden van een verse plaat aardappel dextrose agar (Figuur 2).
Opmerking: Werken in een laminaire flow-kap of veeg naar beneden een laboratorium bankje met 10% bleekwater of 75% ethanol om risico van besmetting te minimaliseren.
- Stellen van een cultuur van de dochter van Rhizoctonia cultuur op aardappel dextrose agar een of twee dagen voor de bepaling, om te verzekeren het is reeds lang gevestigd op de plaat van de cultuur voor de bepaling. Start de dochter cultuur door overdracht van een klein stukje R. solani (10 mm doorsnede) van de master cultuur naar het midden van een verse plaat aardappel dextrose agar (Figuur 2).
- Autoclaaf 25 mL reageerbuisjes met 10 mL aliquots gedestilleerd water (2 x aantal monsters).
2. bereiding van de monsters op proef
- Twee onafhankelijke 0,5 g monsters van elk monster compost aan 10 mL gesteriliseerde met autoclaaf water in proefbuizen 25 mL toevoegen. Schud de reageerbuisjes 's nachts.
- Label de reageerbuisjes met unieke sample nummers, en elk lid van het paar als een (verwijzing) of B (voorbeeld).
- Toevoegen na 24 h, 1.5 g van gewone agar aan 90 mL gedestilleerd water in twee 125 mLconical kolven.
- Autoclaaf beide erlenmeyers met agar en het A monster van elk paar voor 20 min met de instelling van een langzame uitlaat.
- Na de autoclaaf, plaatst u de erlenmeyers met agar in een waterbad van 45 ° C totdat ze evenwicht (ongeveer 30 min bereiken). Zet elke steekproef slurries niet in het waterbad, totdat het is afgekoeld tot 45 ° C.
Figuur 2: illustratie van protocol. Stekkers van R. solani worden geplaatst op de petrischaaltjes met compost water extract. De diameter van de mycelial groei wordt gemeten na 1-2 dagen met de hulp van een stereo microscoop aan de resolutie en het contrast verbeteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Giet de A monster (gesteriliseerde met autoclaaf referentie) compost drijfmest in de gesmolten agar van de A agar kolf. Swirl het verspreiden van compost in de agar.
- Giet de B monster (levende voorbeeld) compost drijfmest in de gesmolten agar van de B agar kolf. Swirl het verspreiden van compost in de agar.
- Giet het mengsel van elke kolf in vijf plastic petrischaaltjes die 100 mm diameter.
- Laat de platen koel 's nachts zodat de agar verhardt.
3. Voeg de Rhizoctonia -uitdaging
- Stukken van gelijke grootte van R. solani overbrengen met behulp van aseptische techniek in elk paar monster agar platen (3 tot 5 mm corkborer werkt goed om gelijke grootte stukken). Neem stukjes van de kolonie van de buitenmarge van de kolonie te verzekeren mycelium groeit actief.
Opmerking: Werken in een laminaire flow-kap of veeg naar beneden een laboratorium bankje met 10% bleekwater of 70% ethanol. - Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 1-2 dagen totdat de kolonie groei ongeveer halverwege aan de rand van de A-platen bereikt.
4. meten van R. solani groei
- Het meten van de straal van het mycelium in elke plaat tot de dichtstbijzijnde 1 mm met een duidelijk platte liniaal met behulp van een stereo microscoop met doorvallend verlichting.
Opmerking: Schuine of donker veld verlichting zal gemakkelijker te zien en te meten van de transparante schimmeldraden. Zones van remming zijn op dit moment zichtbaar rond compost fragmenten in de B-plaat als de compost onderdrukkende is. - Opnemen van de straal op drie plaatsen per plaat en berekenen van een gemiddelde van de drie om te dienen als een representatieve maatregel.
- Het gemiddelde van de B-platen aan de platen A aftrekken. Als B < A dan er zijn microben in de B-platen die onderdrukkende aan de R. solani pathogeen zijn.
- Verdeel de gemiddelde straal door het aantal dagen van de uitdaging om de maateenheden van relatieve onderdrukking als een percentage, mm mycelium per dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resulterende compost moet stabiel en volwassen, twee termen die vaak uitwisselbaar zijn, dus het kan veilig worden verpakt en vervoerd, en niet oorzaak bijwerkingen tijdens haar eindgebruik4. Stabiliteit is een weerstand tegen afbraak en wordt meestal bepaald met behulp van indexcijfers van de microbiële activiteit. Algemene maatregelen van microbiële ademhaling kunnen compost stabiliteit maar niet noodzakelijkerwijs ziekte onderdrukking van een agressieve pathogenen en saprophyte zoals R. solani7meten. Deze studie concentreerde zich op de vervaldatum die afleidt van het materiaal is klaar voor een bepaald gebruik en, voor tuinbouw doeleinden, wordt bepaald door de plant ontkieming en groei testen.
Extracten van de levende compost onderdrukt R. solani groei aanzienlijk meer dan gesteriliseerde met autoclaaf monsters (P ≤ 0.0001). Autoclaaf doodt uit microbiële activiteit, wijzend naar een microbially gemedieerde onderdrukking. Dit bevestigt dat de plaat A in de methode als een negatieve controle voor microbially gemedieerde biologische bestrijding (Figuur 3 fungeert).
Figuur 3: effecten van autoclaaf op R. solani groei in vitro, zoals afgemeten aan de procentuele verandering in de groei van de mycelial van het besturingselement. Een testmateriaal is 'onderdrukkende' aan de schimmel als de straal van de mycelial groei minder dan een gesteriliseerde met autoclaaf besturingselement is. Geïllustreerd zijn middelen ± 1 standaardfout. De foutbalken voor de gesteriliseerde met autoclaaf controle is te klein om te zien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Groei van R. solani mycelium op compost extract werd beïnvloed door de methode van de compost en grondstoffen in het recept van compost, maar niet de duur van de rijping of genezen van6,8. Groei werd verminderd met Wormenbak en windrow processen en recepten met hardhout schors (Figuur 4). Suppressiveness vertegenwoordigt een afname van de groei van R. solani.
Figuur 4: gebruik van de plate competitie assay te vergelijken van de suppressiveness van de compost producten. Betekent de standaardfout ± 1 van de verandering in R. solani groei op een gesteriliseerde met autoclaaf referentie-plaat. Zowel de controles en de behandeling vergelijkingen waren geënt met virulente R. solani. Waarden onder nul vertegenwoordigen suppressiveness. Suppressiveness van R. solani werd beïnvloed door compost A) methode, B) de duur van de genezing of rijping, en C) recept. Processen in vergelijking waren belucht statische stapel (ASP), windrow (W), Wormenbak (V) en anaerobe vergisting (AD). Recept ingrediënten ten opzichte van waren voedselafval (F), mest van pluimvee (P), etensresten en mest van pluimvee (FP), zuivel mest (M) en hardhout schors (H). Contrasterende brieven boven balken duiden behandelingen die aanzienlijk verschillen. Dit cijfer is gewijzigd van Neher et al. 8 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We weten uit eerder onderzoek, dat bepaalde compost zijn effectief in het onderdrukken van R. solani en dat de onderdrukkende effecten zijn te wijten aan de microben leven in de compost, niet de abiotische eigenschappen van compost6,8. Het gebruik van autoclaaf als een middel om te 'doden' microbiota is bekritiseerd, omdat het van invloed is op de koolstof-chemie van de media-10. Wij vergeleken het gebruik van de autoclaaf te vacuüm filtratie door Whatman nr. 1 papier. Behandelingen die niet gefilterde of gesteriliseerde met autoclaaf waren bleek de grootste onderdrukking van R. solani groei6. Filtratie verwijderd de grotere, solide deeltjes die waren blijkbaar belangrijk voor de bestrijding van de ziekte door waarschijnlijk herbergen antibioticum microben produceren.
Voordelen van de methode zijn de eenvoud en de betaalbaarheid. Vergelijkbaar met de conclusies en aanbevelingen van de Alfano et al. 2, de bepaling van de competitie plaat is een snelle voorlopige beoordeling van de onderdrukking van de ziekte maar niet betrouwbaar als een standalone assay omdat alleen het pathogene agens oplevert, en niet de plant host, is aanwezig. Bovendien, ziekte niet zou stellen als het milieu ongunstig was; R. solani ziekten worden begunstigd door de warme en vochtige omstandigheden1. Over het geheel genomen is er meer complexiteit in de bodem en compost ecosysteem dan kan worden geïmiteerd volledig door een één laboratorium assay4,8. De bepaling van de plaat is vergelijkbaar met andere indicatoren, met inbegrip van een nematode index van compost volwassenheid en drie microbiële ecoenzymes, fosfatase, β-1,4-glucosidase en β-1,4-N-acetylglucosaminidase8. De ecoenzymes geeft de status van de ontleding en de koolstof en voedingsstoffen behoeften van de microbiële Gemeenschap. Bevestiging van suppressiveness kan worden bereikt met plant testen maar ze nemen meer tijd in beslag. Isoleren en onderhouden van een reincultuur van een schimmel zorgt om verontreiniging te voorkomen. ATCC9 biedt tips en technieken voor het kweken van gisten en filamenteuze schimmels.
De methode is een potentiële kandidaat voor commerciële certificering van ziekte-onderdrukkende eigenschappen. Het resultaat weerspiegelt onderdrukking als een functie van de bodem. Het geeft niet aan mechanismen of specifieke microbiële soorten verantwoordelijk voor ziekte onderdrukking. Een toekomstige toepassing zou kunnen zijn te snijden uit een gedeelte van de remming zone voor extractie van DNA voor het rangschikken en identificatie van de leden van de Gemeenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De Vermont landbouw Experiment Station concurrerende Hatch programma VT-HO1609 gefinancierde onderzoek. Lynn Fang gebruikt de methode als onderdeel van haar M.S. proefschrift aan de Universiteit van Vermont6.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
