Summary
제시는 특정 퇴 비 포함 박테리아와 균 류 Rhizoctonia solani의 성장을 억제 하는 것 인지를 식별 하는 접시 경쟁 분석 결과 대 한 프로토콜.
Abstract
목표는 개발 하 고 최적화 solani Rhizoctoniasoilborne 균에 대 한 특정 퇴 비의 병 진압 능력을 감지 하는 간단 하 고, 저렴 하 고 효과적인 검정 이었다. R. solani 다양 한 식물 호스트 전세계의 병원 체 이다. 곰 팡이 saprophyte로 토양에서 살아 난다 그리고 간단한 물 한 천 매체에 급속 하 게 성장. 플레이트 분석 결과 R. solani의 성장을 느리게 하는 그들의 기능에 대 한 퇴 비를 비교 하는 빠른 방법입니다. 분석 결과 또한 강했다 초기 blights, Fusarium 윌 트, Phytophthora 뿌리 썩 음, 등 Pythium 루트 썩 어 토양에서 무기물으로 살아 나는 다른 soilborne 곰 팡이 병원 균의 억제와 잘 상관 한다.
Introduction
Rhizoctonia 나타냅니다는 Thanatephorus cucumeris (프랭크) Donk의 버섯의 광범위 한 복잡 한 (anamorph Rhizoctonia solani Kühn =) 루트 썩 음 및 감쇠 떨어져1을 일으키는 병원 체 이다. Rhizoctonia solani 적극적인 병원 체 이며 sclerotia 불리 한 환경 조건1로 살아남을 수 있는 saprophyte. 그 결과, 글로벌 유통 있으며 Solanaceae, 등 Fabaceae, 국화과, 심각한 경제적 손실을 인 십자화과 식물 호스트의 넓은 범위에 질병을 일으킬 수 있습니다.
퇴 비는 특정 식물 병원 체2biocontrol 대리인 항구 용량이. 그러나, 모든 퇴 비는 모두도 할 그들은 모든 병원 균을 영향을 마찬가지로3. 나무 기반 탄소는 건초 또는 밀 짚-탄소 근거한 퇴 비 보다는 셀 루 로스 비율에 더 높은 리그 닌. R. solani 밀 짚에서 쉽게 사용할 수 있는 탄소를 좋아한다. 반면, Trichoderma 종 등 생물 학적 제어 버섯 탄소 덜 쉽게 사용할 수 있을 때 더 효과적입니다. 유익한 균 류 및 박테리아 퇴 비로 경쟁, 적개심 또는 식물 성장3규제를 통해 식물 질병을 억제 수 있습니다. 제안 된 분석 결과 주로 항생제, ecoenzymes 또는 병원 체에 해로운 chelators의 생산에 의해 만들어진 적개심을 감지 합니다.
식물 생물 검정 composts 부탁 또는 식물 성장4억제 여부를 결정 하는 황금 표준입니다. 그러나, 식물 생물 검정 개월 소요 (주)는 보다 더 많은 노동 루트 시스템의 척도를 뿌리로 식물을 추출 하며 원하는 수 있는 완료. 대 등 하 게 강력 하 고, 그러나 빨리 (일) 분석 품질 관리 프로그램에 대 한 이상적인 것입니다. 이 문서의 목표는 퇴 비의 진압 가능성을 예측 하는 상대적으로 신속 하 고 정확한 테스트를 보여 줍니다. 메서드가는 Alfano 외. 후에 모방 되었다 두 개의 예외, 퇴 비 추출 물 5 희석 했다 그리고 물 천 감자 포도 당 한 천 (PDA) 대신 사용 되었다. R. solani PDA 승진 박테리아와 오염 문화6다른 곰 팡이의 성장을 하는 반면 간단한 물 한 미디어에 급속 하 게 성장.
이 플레이트 분석 결과 무기물 R. solani7, 강했다 초기 blights, Fusarium 윌 트, Phytophthora 뿌리 썩 음, Pythium 루트 부패 등으로 토양에서 생존 하는 식물 병원 균의 범위에 적용 되는 억제의 지표 역할을 합니다. 격판덮개 경쟁 분석 결과 토양 병원 균의 생물학 통제 대리인으로 봉사 하는 미생물의 포함을 위해 퇴 비 제품의 범위에 유용 합니다. 분석 결과 상업 퇴 비 제품6,8에서 질병 억제의 가장 일관 된 지표 중 하나 였다. 제품은 조리법, 성숙, 그리고 생산 과정에서 그들의 변이 대 한 선정 됐다.
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Protocol
1. 사전에 준비
- 마스터 곰 팡이 문화 (시험 체)
- 미국 유형 문화 수집, 미생물학 컬렉션9, teleomorph Thanatephorus cucumeris (프랭크) (ATCC 10154) 또는 MYA 4031에서에서 주문.
- 또는: 저자에 의해 수행으로 지역 격리를 수집 합니다. 빨간 무 (Raphanus sativus)의 모 종 잘 작동 미끼 식물; R. solani에 의해 발생 하는 댐핑-오프 또는 루트 썩 어의 역사를가지고 알려진 위치에서 토양을 수집 합니다. 묘는 3 ~ 4 주 오래 될 때 루트 병 변에서 분리와 토양에 씨앗을 뿌리 다.
- 모 종 토양에서 제거 하 고 수돗물으로 씻어. 나뭇잎과 루트 (그림 1) 사이 hypocotyl 지역에서 갈색 조직 찾습니다.
- 단일 날카로운된 면도칼 블레이드를 사용 하 여 hypocotyl 또는 루트의 1 cm 세그먼트를 갈색 색상을. 화 염 소독 집게를 사용 하 여 가정용 표 백제 살 균 물에 10 s 씻어 다음 1 분 동안 10% 해결책에서 세그먼트를 찍어.
참고: 위쪽 및 멸 균 페 트리 접시의 아래쪽은이 단계에 대 한 유용한 컨테이너입니다. - 공장을 전송 사용 화 염 소독 집게 팻 건조 후 물 한 천 (1 리터에 15 g)와 페 트리 접시의 표면에 배치 하는 종이 타월의 안쪽에 조각.
- 뚜껑을 가진 플라스틱 용기 안에 페 트리 접시를 놓고 실내 온도 (대략 20 ° C)에서 품 어. 10% 표 백제 또는 75% 에탄올과 컨테이너의 내부를 닦아 하 고 그것은 접시를 삽입 하기 전에 건조 한 공기 보자.
- 유지는 격리 옥수수 식사 agar의 최소한의 미디어에 장기 보관 (17 g 1 L에) 글씨의 기울기 (5 ° C)에서.
그림 1: 질병 증상. 토양을 포함 하는 R. solani 결과 누 덕 누 덕 발 아와 설립 (왼쪽). 무 묘 종에 증상 (오른쪽) hypocotyl에서 갈색 병 변으로 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 감자 포도 당 한 천 배지 (39 g L 1에서)를 사용 하 여 inoculum이 플레이트 분석 결과 대 한 대 한.
- 감자 포도 당 한 천 하나에 Rhizoctonia 문화의 딸 문화 확립 또는 이틀 전에 분석 결과, 그것을 확실히 하기 위하여 잘 설립 분석 결과 전에 문화 접시에. 신선한 감자 포도 당 한 천 (그림 2) 접시의 중앙에 마스터 문화에서 R. solani 의 작은 조각 (직경 10 m m)를 전송 하 여 딸 문화를 시작 합니다.
참고: 층 류 후드에서 나 오염 위험을 최소화 하기 위해 10% 표 백제 또는 75% 에탄올과 실험실 벤치 아래 닦으십시오.
- 감자 포도 당 한 천 하나에 Rhizoctonia 문화의 딸 문화 확립 또는 이틀 전에 분석 결과, 그것을 확실히 하기 위하여 잘 설립 분석 결과 전에 문화 접시에. 신선한 감자 포도 당 한 천 (그림 2) 접시의 중앙에 마스터 문화에서 R. solani 의 작은 조각 (직경 10 m m)를 전송 하 여 딸 문화를 시작 합니다.
- 10 mL 증류수 (샘플 2 x 수)의 aliquots와 압력솥 25 mL 테스트 튜브.
2입니다. 테스트 샘플의 준비
- 25 mL 테스트 튜브에 압력가 물 10 mL를 각 퇴 비 테스트 샘플의 두 개의 독립적인 0.5 g 샘플 추가 합니다. 밤새 테스트 튜브를 흔들어.
- 테스트 튜브 독특한 샘플 숫자와 (참조) 또는 B (샘플) 쌍의 각 구성원 레이블을.
- 24 시간 후 일반 agar의 1.5 g 2 125 mLconical 플라스 크에 증류수 90 mL을 추가 합니다.
- 압력솥, agar와 느린 배기 설정 20 분에 대 한 각 쌍의 A 샘플 모두 원뿔 플라스 크.
- 평형 (약 30 분)를 도달할 때까지 오토 클레이 브, 후 45 ° C 물 목욕으로 agar와 원뿔 플라스 크를 놓습니다. 그것은 45 ° c.에 냉각 될 때까지 물 목욕에 모든 샘플 슬러리를 넣지 마십시오
그림 2: 프로토콜의 그림. R. solani 의 플러그는 퇴 비 물 추출 물을 포함 하는 배양 접시에 배치 됩니다. 해상도 및 대비 향상 스테레오 현미경의 도움으로 1-2 일 후 바로 성장의 직경 측정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- A 한 플라스 크의 녹은 한 천에 A 샘플 (압력가 참조) 퇴 비 슬러리를 붓으십시오. 퇴 비는 agar에 분산 소용돌이 친다.
- B 한 플라스 크의 녹은 한 천에 B 샘플 (생활 샘플) 퇴 비 슬러리를 붓으십시오. 퇴 비는 agar에 분산 소용돌이 친다.
- 5 플라스틱 접시를 직경에서 100 m m으로 각 플라스 크의 혼합물을 붓는 다.
- 그래서는 agar 견고 접시 멋진 하룻밤을 하자.
3. 추가 Rhizoctonia 도전
- 샘플 한 천 격판덮개의 각 쌍에 동등한 크기의 조각 R. solani 의 전송 무 균 기술을 사용 하 여, (3 ~ 5 mm corkborer 동등한 크기의 조각을 설치 하는 게 작동). 균 사체는 적극적으로 성장 하 고 보장 하기 위하여 식민지의 외부 여백에서 식민지의 조각 가져가 라.
참고: 층 류 두건에 나 10% 표 백제 또는 70% 에탄올과 실험실 벤치 아래 닦으십시오. - 식민지 성장 A 접시의 가장자리에 약 절반 방법에 도달할 때까지 1-2 일 동안 실내 온도에 번호판을 품 어.
4. R. solani 성장 측정
- 스테레오 현미경을 사용 하 여 전송 된 조명으로 명확한 플랫 통치자와 가까운 1 mm 각 접시에 균 사체의 반지름을 측정 합니다.
참고: 경사 또는 어두운 조명이 하게된다 쉽게 보고 투명 균 측정. 퇴 비는 진압 하는 경우이 시점에서, 억제의 영역 B 플레이트에 퇴 비 조각 주위 표시 됩니다. - 접시 당 3 개의 장소에서 반지름을 기록 하 고 대표적인 측정으로 3의 평균을 계산.
- A 접시에서 B 플레이트의 평균을 뺍니다. 경우 B < 다음 거기는 R. solani 병원 체를 진압는 B 플레이트에 미생물.
- 속도, 하루 mm 사체로 상대 억제의 단위를 표현 하는 도전 일 수로 평균 반지름을 나눕니다.
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Representative Results
완성 된 퇴 비 안정 되 고 성숙, 두 용어는 종종 혼용 하는, 그래서 수 있습니다 안전 하 게 포장, 수송 그리고 하지 원인 불리 한 효과는 최종 사용4동안 해야 합니다. 안정성 분해 저항 이며 일반적으로 미생물 활동의 인덱스를 사용 하 여 결정 됩니다. 미생물 호흡의 일반 조치는 적극적인 병원 체 및 saprophyte R. solani7등의 반드시 질병 억제 하지만 퇴 비 안정성을 측정할 수 있습니다. 이 연구 자료를 사용 하는 특정에 대 한 준비 이며, 목적을 위해 원 예, 식물 발 아 및 성장 분석 실험에 의해 결정 됩니다 유추 성숙 에 집중 했다.
생활 퇴 비 추출 물 억제 R. solani 성장을 크게 압력가 샘플 (P ≤ 0.0001) 보다 더 많은. 압력가 마로 소독은 미생물 활동, microbially 중재 억제를 가리키는 죽인다. 이 메서드에서 플레이트 A microbially 중재 생물 학적 컨트롤 (그림 3)에 대 한 부정적인 제어 역할을 확인 합니다.
그림 3: R. solani 성장에서 체 외에에 압력가 마로 소독의 효과, 컨트롤에서 바로 성장에 비율 변화에 의해 측정 된. 테스트 소재는 바로 성장 반경 압력가 컨트롤 보다 작으면 '진압' 곰 팡이. 일러스트는 수단 ± 1 표준 오차입니다. 압력가 컨트롤에 대 한 오차 막대 보고 너무 작습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
퇴 비 추출에 R. solani 의 균 사체의 성장은 퇴 비 방법 및 원료 퇴 비의 제조 법은 하지만 성숙 또는6,8치료 하지 기간에 의해 영향을 받았다. 성장은 vermicompost와 windrow 프로세스와 나무 껍질 (그림 4)를 포함 하는 조리법에 의해 감소 되었다. Suppressiveness의 성장에 있는 감소를 나타내는 R. solani.
그림 4: 격판덮개 경쟁 분석 결과의 퇴 비 제품의 suppressiveness 비교 사용. 압력가 참조 접시에 R. solani 성장에 변경의 ± 1 표준 오차를 의미합니다. 컨트롤 및 치료 비교 악성 R. solani함께 주사 했다. 0 값은 suppressiveness를 나타냅니다. R. solani 의 suppressiveness 퇴 비에 의해 영향을 받았다 A) 메서드, B) 경화 또는 성숙, 및 C) 제조 법의 기간. 비교 프로세스 화난된 정적 더미 (ASP), windrow (W), vermicompost (V) 및 혐 기성 소화 (광고) 했다. 레시피 재료 비교 했다 음식 쓰레기 (F)가 금 두 엄 (P), 음식 쓰레기 및가 금 두 엄 (FP), 낙농 비료 (M), 그리고 나무 껍질 (H). 바 위에 대조 편지는 크게 다른 치료를 나타냅니다. 이 그림에서 정치학자 외 수정 되었습니다. 8 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리 알고 이전 연구에서 특정 퇴 비는 R. solani 억제에 효과적 진압 효과 퇴 비에 살고 있는 미생물 퇴 비6,8의 비 생물 적인 속성이 아닌 때문입니다. ' 죽 일 ' microbiota 수단으로 압력가 마로 소독의 사용 미디어10의 탄소 화학에 영향을 받아왔다. 우리는 압력가 마로 소독 Whatman No. 1 종이 통해 진공 여과를 사용 비교. 필터링도 압력가 되었다 트리 트 먼 트 R. solani 성장6의 가장 큰 억제를 보였다. 여과 분명히 가능성이 은닉 항생제를 생산 하는 미생물에 의해 질병 억제에 중요 한 더 큰, 고체 입자를 제거.
방법의 장점은 단순 하 고 저렴 한입니다. 결론 및 권고 Alfano 외 의 비슷한 2, 격판덮개 경쟁 분석 결과 분석 결과 독립 실행형으로 신뢰할 수 없습니다 하지만 질병 억제의 빠른 예비 평가 병원 체, 그리고 공장 호스트 하지는 때문입니다. 게다가, 질병 하지 확립 환경 있었다면 유리한; R. solani 질병 따뜻하고 습 한 조건1에 의해 선호 됩니다. 전반적으로, 토양 및 퇴 비 생태계 보다 단일 실험실 분석 결과4,8에 의해 전적으로 유사 수에 복잡성이 더 있다. 플레이트 분석 결과 다른 지표를 포함 하 여 퇴 비 성숙 3 미생물 ecoenzymes, 인산 가수분해 효소의 선 충 인덱스, β-1, 4-glucosidase 및 β-1, 4-N-acetylglucosaminidase8비교입니다. ecoenzymes 미생물 커뮤니티의 분해 및 탄소와 영양소 요구의 상태를 반영합니다. Suppressiveness의 확인 공장 분석 실험 달성 될 수 있다 하지만 그들은 완료 하는 데 걸리는. 오염을 피하기 위하여 분리 하 고 유지 하는 곰 팡이의 순수한 문화를 다룬다. ATCC9 팁 및 효 모와 filamentous 곰 팡이 배양에 대 한 기술을 제공 합니다.
방법은 질병 진압 속성의 상업용 인증에 대 한 잠재적인 후보입니다. 결과 반영 토양 기능으로 억제 합니다. 그것은 메커니즘 또는 특정 미생물 종 질병 억제에 대 한 책임을 지정 하지 않습니다. 미래의 응용 프로그램 시퀀싱에 대 한 DNA의 추출 및 지역 사회 구성원의 식별 금지 영역의 일부를 잘라 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
버몬트 농업 실험 역 경쟁 해치 프로그램 VT-HO1609 연구 자금. 린 팡 버몬트 대학6에서 그녀의 석사 학위 논문의 일환으로 방법을 사용.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
