Summary
Presentert er en protokoll for en plate konkurranse analysen til å finne ut om en bestemt kompost er sannsynlig å inneholde bakterier og sopp som hemmer veksten av Rhizoctonia solani.
Abstract
Målet var å utvikle og optimalisere en enkel, rimelig og effektiv bioassay for å oppdage sykdommen undertrykkende evne til en bestemt kompost mot soilborne sopp Rhizoctonia solani. R. solani er en patogen av et bredt spekter plante verter over hele verden. Soppen overlever i jord som en saprophyte og vokser raskt på enkle vann agar medier. Plate analysen er en rask metode for å sammenligne composts for deres evne til å bremse veksten av R. solani. Analysen samsvarer også med undertrykkelse av andre soilborne sopp patogener som overlever som saprophytes i jord som Alternaria tidlig blysenes Fader, Fusarium wilt, Phytophthora rot råtne og Pythium rot råtne.
Introduction
Rhizoctonia representerer en bred rekke sopp, av hvilke Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) er patogen forårsaker rot råtne og demping av1. Rhizoctonia solani er en aggressiv patogen og en saprophyte som kan overleve som sclerotia under ugunstige miljøforhold1. Resultatet det har en global fordeling og kan forårsake sykdom på bredt spekter plante verter inkludert Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae og Korsblomstfamilien resulterer i alvorlige økonomiske tap.
Kompost har kapasitet til havn biocontrol agenter for enkelte anlegg patogener2. Imidlertid ikke alle composts er like eller påvirker disse alle patogener tilsvarende3. Tre-basert co har høyere lignin til cellulose prosenter enn høy eller halm-karbon basert composts. R. solani foretrekker tilgjengelige karbon i strå. Derimot er biologisk kontroll sopp, som Trichoderma spp., mer effektive når carbon er så lett tilgjengelig. Fordelaktig sopp og bakterier i kompost kan undertrykke plante sykdom gjennom konkurranse, motstand eller regulere anlegget vekst3. Foreslåtte analysen oppdager primært antagonisme opprettet av produksjon av antibiotika, ecoenzymes eller chelater som er skadelig patogen.
Anlegget bioassay er en gull-standard for å avgjøre om composts favorisere eller avskrekke anlegget vekst4. Men anlegget bioassay er tidkrevende (uker til måneder) å fullføre som kan være lengre enn ønsket og krever mer arbeid å pakke planter med røtter å kvantifisere alvorlighetsgraden av rotsystem. Sammenlignbare robust, men raskere (dager) analyser ville være ideelt for kvalitetskontroll programmer. Målet med denne utredningen er å demonstrere en relativt rask og nøyaktig test for å forutsi undertrykkende potensialet av kompost. Metoden ble mønstret etter Alfano et al. 5 med to unntak, kompost ekstrakter ble utvannet og vann agar ble brukt i stedet for potet druesukker agar (PDA). R. solani vokser raskt på enkle vann agar medier mens PDA fremmet veksten av bakterier og andre sopp som forurenset kultur6.
Denne platen analysen fungerer som en indikator på undertrykkelse som gjelder for en rekke plante-patogener som overlever i jord som saprophytes inkludert R. solani7, Alternaria tidlig blysenes Fader, Fusarium wilt, Phytophthora rot råtne og Pythium rot råtne. Plate konkurranse analysen er nyttig å skjermen en rekke kompost produkter som inneholder samfunn av mikrober som tjener i biologisk kontroll av jord patogener. Analysen var en av de mest konsekvente indikatorene for sykdom undertrykkelse i kommersielle kompost produkter6,8. Produkter ble valgt for deres variasjon i oppskriften, forfallsdato og produksjonsprosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør på forhånd
- Master fungal kultur (test organisme)
- Bestill fra amerikansk Type kultur samlingen, mikrobiologi samling9, etter teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) eller MYA 4031.
- Alternativt: Samle lokale isolerer som gjort av forfatterne. Planter av røde reddik (Raphanus sativus) fungerer godt som et agn anlegg; samle jord fra en kjent for å ha en historie av demping-off eller root råte forårsaket av R. solani. Så frø i jord og isolere fra roten lesjoner når seedlings er 3 til 4 uker gammel.
- Fjerne seedlings fra jord og skyll med vann fra springen. Se etter brune vev i hypocotyl regionen mellom bladene og roten (figur 1).
- Bruk en enkelt kant razor blad for å klippe 1 cm segmenter av hypocotyl eller root som en brun farge. Bruk flamme-steriliseres tang for å dyppe segmentene i 10% løsning av husholdningenes blekemiddel for 1 min, etterfulgt av en 10 s skylling i sterilt vann.
Merk: Toppen og bunnen av et sterilt Petriskål er nyttig beholdere for dette trinnet. - Bruk flamme-steriliseres tang overføre anlegget biter på innsiden av et papirhåndkle klapp tørr og plasser på overflaten av en Petriskål med vann agar (15 g 1 l).
- Plasser Petriskål inni en plast beholderen med lokk og ruge ved romtemperatur (ca 20 ° C). Tørk interiøret i beholderen med 10% bleke eller 75% etanol og la luften tørr før du setter inn parabolen.
- Hold isolert langvarig lagring på en minimal media av korn måltid agar (17 g 1 l) slants (på 5 ° C).
Figur 1: sykdomssymptomer. Jord som inneholder R. solani gir usammenhengende spiring og etablering (til venstre). Symptomer på reddik seedlings oppstå som brun lesjoner på hypocotyl (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruk potet druesukker agar plater (39 g 1 l) for inoculum for denne platen analysen.
- Etablere en datter kultur for Rhizoctonia kultur på potet druesukker agar en eller to dager før analysen, å sikre det er godt etablert på kultur plate før analysen. Starte datter kulturen ved å overføre et lite stykke (10 mm diameter) R. solani fra master kulturen til midten av en frisk plate av potet druesukker agar (figur 2).
Merk: Arbeid laminær strømning hette eller tørke ned en laboratoriebenk med 10% bleke eller 75% etanol å minimere risiko for kontaminering.
- Etablere en datter kultur for Rhizoctonia kultur på potet druesukker agar en eller to dager før analysen, å sikre det er godt etablert på kultur plate før analysen. Starte datter kulturen ved å overføre et lite stykke (10 mm diameter) R. solani fra master kulturen til midten av en frisk plate av potet druesukker agar (figur 2).
- Autoclave 25 mL reagensglass med 10 mL dele destillert vann (2 x antall eksempler).
2. forberedelse å Test
- Legg til to uavhengige 0,5 g eksempler på hver kompost testprøven 10 mL autoklaveres vann i 25 mL reagensglass. Riste reagensglass over natten.
- Etiketten reagensglass med unike eksempel tall og hvert medlem av paret som en (referanse) eller B (eksempel).
- Etter 24 timer, legge til 1,5 g vanlig agar 90 mL destillert vann i to 125 mLconical flasker.
- Autoclave både konisk flasker med agar og A prøven i hvert for 20 min treg eksos omgivelser.
- Etter autoclave, plass de koniske flasker med agar i et vannbad 45 ° C før de når likevekt (ca 30 min). Ikke Legg noen eksempel slam i vannbad til den er avkjølt til 45 ° C.
Figur 2: illustrasjon av protokollen. Pluggene til R. solani plasseres på Petri retter som inneholder kompost vann ekstrakt. Diameteren på mycelial vekst måles etter 1-2 dager ved hjelp av en stereo mikroskop for å forbedre oppløsning og kontrast. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Hell A sample (autoklaveres referanse) kompost gjødsel agar smeltet av A agar kolbe. Virvel å spre kompost agar.
- Hell B utvalg (levende eksempel) kompost gjødsel agar smeltet av B agar kolbe. Virvel å spre kompost agar.
- Hell blandingen av hver kolbe i fem plast Petri retter som er 100 mm i diameter.
- La platene kule overnatting så agar stivner.
3. Legg Rhizoctonia utfordringen
- Bruke steril teknikk, overføre jevnstore stykker av R. solani for hvert eksempel agar plater (3 til 5 mm corkborer fungerer bra for å etablere like store stykker). Ta biter av kolonien fra den ytre margen av kolonien å sikre mycel aktivt vokser.
Merk: Arbeid laminær strømning hette eller tørke ned en laboratoriebenk med 10% blekemiddel eller 70% etanol. - Inkuber platene ved romtemperatur for 1-2 dager til koloni veksten når omtrent halvveis til kanten av A platene.
4. måle R. solani vekst
- Måle radius mycel i hver plate til nærmeste 1 mm med en klar flat linjal stereo mikroskop med overført belysning.
Merk: Skrå eller mørk belysning vil gjøre det lettere å se og måle de gjennomsiktige hyfer. På dette punktet, vises soner av hemming rundt kompost fragmenter i B platen hvis kompost undertrykkende. - Registrere radius på tre steder per plate og beregne et gjennomsnitt av de tre å tjene som en representant.
- Trekk gjennomsnittet av B plater fra A platene. Hvis B < deretter er mikrober i B platene som undertrykkende til R. solani patogen.
- Dele mener radius av antall dager utfordring å uttrykke enheter av relativ undertrykkelse som en rate, mm mycel per dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ferdig kompost bør være stabile og modne, to begrepene som brukes ofte om hverandre, så det kan trygt pakket og transportert og ikke forårsake bivirkninger under dens sluttbruk4. Stabilitet er en motstand mot nedbryting og bestemmes vanligvis bruker indekser av mikrobiell aktivitet. Generelle tiltak av mikrobielle åndedrett kan måle kompost stabilitet, men ikke nødvendigvis sykdom undertrykkelse av en aggressiv patogen og saprophyte som R. solani7. Denne studien fokusert på modenhet som utleder materialet er klar for en bestemt bruker, og, for hagebruk formål, bestemmes av anlegget spiring og vekst analyser.
Ekstrakter av levende composts undertrykt R. solani vekst betydelig mer enn autoklaveres prøver (P ≤ 0,0001). Autoklavering dreper av mikrobiell aktivitet, peker til en microbially mediert undertrykkelse. Dette bekrefter at friksjonsskiven A i metoden fungerer som en negativ kontroll for microbially mediert biologisk kontroll (Figur 3).
Figur 3: effekter av autoklavering på R. solani vekst i vitro, målt ved Prosentvis endring i mycelial vekst fra kontrollen. En test materiale er undertrykkende til sopp hvis radius mycelial vekst er mindre enn en autoklaveres kontroll. Illustrert er betyr ± 1 standardfeil. Feilfelt for autoklaveres kontroll er for liten til å se. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Veksten av R. solani mycel på kompost ekstrakt var påvirket av kompost metoden og råvarer i oppskriften av kompost men ikke varigheten av modning eller herding6,8. Vekst ble redusert med vermicompost og windrow prosesser og oppskrifter som inneholder løvtre bark (Figur 4). Suppressiveness representerer en reduksjon i veksten av R. solani.
Figur 4: bruk av platen konkurranse analysen sammenligne suppressiveness av kompost. Betyr ± 1 standardfeil for endringen i R. solani vekst på en autoklaveres referanse plate. Både kontroller og behandling sammenligninger ble inokulert med virulente R. solani. Verdier under null representerer suppressiveness. Suppressiveness av R. solani var påvirket av kompost A) metoden, B) varigheten av herding eller modning, og C) oppskrift. Prosesser forhold var karbonisert statiske hoper (ASP), windrow (W), vermicompost (V) og anaerob fordøyelsen (AD). Oppskrift Ingredienser forhold var matavfall (F), fjørfe gjødsel (P), matavfall og fjørfe gjødsel (FP), meieri gjødsel (M) og løvtre bark (H). Kontrasterende bokstaver over barer betegne behandlinger som signifikant forskjellig. Dette tallet har blitt endret fra Neher et al. 8 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi vet fra tidligere forskning, som enkelte composts er effektiv på å undertrykke R. solani og at undertrykkende effektene er på grunn av mikrober som lever i kompost, ikke abiotiske egenskapene til kompost6,8. Bruk av autoklavering å "kill" bakterieflora har blitt kritisert fordi det påvirker karbon kjemien i media10. Vi sammenlignet bruken av autoklavering til vakuum filtrering gjennom Whatman nr. 1 papir. Behandlinger som var verken filtrert eller autoklaveres viste største undertrykkelse av R. solani vekst6. Filtrering fjernet de større, solid partiklene som var tilsynelatende sykdom undertrykkelse av sannsynlig harboring antibiotika produsere mikrober.
Fordelene med metoden er enkelhet og rimelig. Tilsvarende konklusjoner og anbefalinger av Alfano et al. 2, plate konkurranse analysen er en rask foreløpig vurdering av sykdom undertrykkelse men ikke pålitelig som en frittstående analysen fordi bare patogen, og ikke plante verten, er tilstede. Dessuten ville sykdom ikke opprette hvis miljøet var ugunstige; R. solani sykdommer er foretrukket av varme og fuktige forhold1. Total, det er mer kompleksitet i jord og kompost økosystemet enn kan bli etterlignet ved et enkelt laboratoriet analysen4,8. Plate analysen kan sammenlignes med andre indikatorer som Rundormer indeks av kompost modenhet og tre mikrobiell ecoenzymes, fosfatase, β-1,4-glucosidase og β-1,4-N-acetylglucosaminidase8. Ecoenzymes tilsvarer den nedbryting og karbon og næringsinnhold behov av mikrobielle samfunnet. Bekreftelse av suppressiveness kan oppnås med anlegget analyser, men de tar lenger tid. Isolere og opprettholde en ren kultur av en sopp som seg tar for å unngå forurensning. ATCC9 tilbyr tips og teknikker for dyrking gjær og trådformede sopp.
Metoden er en potensiell kandidat kommersielle sertifisering av sykdom undertrykkende egenskaper. Resultatet viser undertrykkelse som jord funksjon. Det angir ikke mekanismer eller bestemte mikrobielle arter ansvarlig for sykdommen undertrykkelse. Et fremtidig program kan være å kutte ut en del av sonen hemming for utvinning av DNA for sekvensering og identifikasjon av medlemmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Den Vermont landbruket eksperiment stasjon konkurransedyktig Luke programmet VT-HO1609 finansiert forskning. Lynn Fang brukte metoden som en del av hennes M.S. avhandling ved University of Vermont6.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
