Summary
Præsenteret er en protokol til en plade konkurrence analyse til at identificere, om en bestemt kompost er tilbøjelige til at indeholde bakterier og svampe, der undertrykker væksten af Rhizoctonia solani.
Abstract
Målet var at udvikle og optimere en enkel, billig og effektiv bioassay for at opdage sygdommen smittespredningshæmmende evne af en specifik kompost mod soilborne svampen Rhizoctonia solani. R. solani er et patogen for en bred vifte af plante værter på verdensplan. Svampen overlever i jorden som en saprophyte og vokser hurtigt på simple vand agar medier. Plade assay er en hurtig metode til at sammenligne kompost for deres evne til at bremse væksten af R. solani. Analysen også korrelerer med undertrykkelse af andre soilborne svampe patogener, der overlever som blødrådsbakterierne i jord såsom Alternaria tidlige blysenes, Fusarium visnesyge, Phytophthora root rot og Pythium root rot.
Introduction
Rhizoctonia repræsenterer en bred kompleks af svampe, af hvilke Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) er patogen forårsager root rot og dæmpning off-1. Rhizoctonia solani er en aggressiv patogen og en saprophyte, der kan overleve som sklerotier under ugunstige miljøforhold1. Som et resultat, det har en global distribution og kan forårsage sygdom på lang række plante værter herunder Solanaceae, Ærteblomstfamilien, Asteraceae og Brassicaceae resulterer i alvorlige økonomiske tab.
Kompost har kapacitet til at havnen biocontrol agenter for visse anlæg patogener2. Dog ikke alle kompost er ens heller ikke påvirker de alle patogener ligeledes3. Træ-baserede kulstof har højere lignin til cellulose nøgletal end hø eller halm-carbon baseret kompost. R. solani foretrækker let tilgængelige kulstof findes i halm. Derimod er biologisk bekæmpelse svampe, såsom Trichoderma spp., mere effektiv, når carbon er mindre let tilgængelige. Gavnlige svampe og bakterier i kompost kan undertrykke plantesygdomme gennem konkurrence, antagonisme eller regulere planten vækst3. Den foreslåede assay registrerer primært antagonisme lavet af produktionen af antibiotika, ecoenzymes eller chelatorer, der er skadelige for patogenet.
Plante bioassays er en guldstandarden til at afgøre, om kompost fordel eller afskrække plante vækst4. Men planten bioassays er tidskrævende (uger til måneder) til at fuldføre, som kan være længere end ønsket, og kræver mere arbejdskraft til at udtrække planter med rødder at kvantificere graden af rodsystemer. Forholdsvis robust, men hurtigere (dage) assays ville være ideelt for kvalitetskontrol programmer. Målet med dette papir er at påvise en forholdsvis hurtig og præcis test for at forudsige smittespredningshæmmende potentiale af kompost. Metoden var mønstret efter Alfano et al. 5 med to undtagelser, kompost ekstrakter blev fortyndet og vand agar blev brugt i stedet for kartofler dextrose agar (PDA). R. solani vokser hurtigt på simple vand agar media PDA promoveret vækst af bakterier og andre svampe, der forurenede kultur6.
Denne plade assay fungerer som en indikator for undertrykkelse, der gælder for en række anlæg patogener, som overlever i jorden som blødrådsbakterierne herunder R. solani7, Alternaria tidlige blysenes, Fusarium visnesyge, Phytophthora root rot og Pythium root rot. Plade konkurrence assay er nyttigt at screene en række kompost produkter for indeholdende Fællesskaber af mikrober, der tjener som biologisk kontrol agenser af jord patogener. Analysen var en af de mest konsekvente indikatorer for sygdom undertrykkelse i kommercielle kompost produkter6,8. Produkter blev valgt for deres variation i opskrift, modenhed og produktionsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered dig på forhånd
- Master svampe kultur (testorganismen)
- Bestiller fra amerikansk kultur Typesamlingen, mikrobiologi Collection9, af dens teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) eller MYA 4031.
- Alternativt: Indsamle lokale isolater som gjort af forfatterne. Stiklinger af rød radise (Raphanus sativus) fungerer godt som en agn plante; indsamle jord fra en placering, der er kendt for at have en historie af dæmpning-off eller root rot, forårsaget af R. solani. Så frøene i jorden og isolere fra roden læsioner, når planter er 3-4 uger gamle.
- Fjern stiklinger fra jord og skyl med vand fra hanen. Kigge efter brune væv i regionen hypocotyl mellem bladene og roden (figur 1).
- Brug et enkelt skarpt barberblad til at skære 1 cm segmenter af hypocotyl eller rod, der har en brun farve. Bruge flamme-steriliseret pincet til at dyppe segmenter i en 10% opløsning af husholdningernes blegemiddel for 1 min, efterfulgt af en 10 s skylning i sterilt vand.
Bemærk: Top og bund af en steril petriskål er nyttige beholdere til dette trin. - Brug flamme-steriliseret pincet til at overføre anlægget stykker til indersiden af en køkkenrulle til at klappe tør og derefter placere på overfladen af en petriskål med vand agar (15 g i 1 L).
- Placer petriskål inde i en plast beholder med låg og inkuberes ved stuetemperatur (ca. 20 ° C). Aftør indre beholder med 10% blegemiddel eller 75% ethanol og lad det lufttørre, før du indsætter fadet.
- Holde isolaterne i langtidsopbevaring på en minimal medier af majsmel agar (17 g i 1 L) slants (ved 5 ° C).
Figur 1: sygdomssymptomer. Jord, der indeholder R. solani resulterer i Pletvist spiring og etablering (til venstre). Symptomer på radise frøplanter forekomme som brun læsioner på hypocotyl (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Bruge kartoffel dextrose agar plader (39 g i 1 L) til inokulum til denne plade assay.
- Etablere en datter kultur af Rhizoctonia kultur på kartoffel dextrose agar, en eller to dage før analysen, at forsikre det er veletableret på kultur pladen før analysen. Start datter kultur ved at overføre et lille stykke (10 mm i diameter) af R. solani fra den master kultur til midten af en frisk plade af kartoffel dextrose agar (figur 2).
Bemærk: Arbejde i en laminar flow hætte eller tørre ned et laboratoriebænk med 10% blegemiddel eller 75% ethanol til at minimere risikoen for kontaminering.
- Etablere en datter kultur af Rhizoctonia kultur på kartoffel dextrose agar, en eller to dage før analysen, at forsikre det er veletableret på kultur pladen før analysen. Start datter kultur ved at overføre et lille stykke (10 mm i diameter) af R. solani fra den master kultur til midten af en frisk plade af kartoffel dextrose agar (figur 2).
- Autoklave 25 mL reagensglas med 10 mL alikvoter destilleret vand (2 x antallet af prøver).
2. forberedelse af prøver til testen
- Tilføje to uafhængige 0,5 g prøver af hver kompost prøve til 10 mL autoklaveres vand i 25 mL reagensglas. Ryst reagensglassene natten over.
- Label Reagensglassene med unik prøve tal, og hvert medlem af parret som en (reference) eller B (eksempel).
- Efter 24 timer, skal du tilføje 1,5 g af plain agar til 90 mL destilleret vand i to 125 mLconical kolber.
- Autoklave både koniske kolber med agar og A prøve af hver par i 20 min. med en langsom udstødning indstilling.
- Efter autoklave, skal du placere de koniske kolber med agar i en 45 ° C vandbad, indtil de når ligevægt (ca. 30 min). Læg ikke nogen prøve gylle i vandbad, indtil den er afkølet til 45 ° C.
Figur 2: Illustration af protokollen. Stik af R. solani er placeret på petriskåle, der indeholder kompost vand ekstrakt. Diameteren af mycelial vækst er målt efter 1-2 dage ved hjælp af et stereo mikroskop for at forbedre opløsning og kontrast. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Hæld den smeltede agar af A agar kolbe A prøve (autoklaveres reference) kompost gylle. Swirl spredes kompost i agaren.
- Hæld den smeltede agar B agar kolbens B prøve (levende eksempel) kompost gylle. Swirl spredes kompost i agaren.
- Hæld blandingen i hver kolbe i fem plast petriskåle, der er 100 mm i diameter.
- Lad plader cool overnatning, så agaren hærder.
3. Tilføj Rhizoctonia udfordring
- Overføre ved hjælp af aseptisk teknik, lige store stykker af R. solani til hvert par af prøven agar plader (3-5 mm corkborer fungerer godt for at etablere lige mellemstore stykker). Tage stykker af kolonien fra koloni til at forsikre mycelium aktivt voksende udvendige margen.
Bemærk: Arbejde i en laminar flow hætte eller tørre ned et laboratoriebænk med 10% blegemiddel eller 70% ethanol. - Inkuber plader ved stuetemperatur i 1-2 dage indtil koloni vækst når omkring halvvejs til kanten af A plader.
4. foranstaltningen R. solani vækst
- Mål radius af mycelium i hver plade til den nærmeste 1 mm med en klar flad hersker ved hjælp af et stereo mikroskop med overførte belysning.
Bemærk: Skrå eller mørke felt belysning vil gøre det nemmere at se og måle de gennemsigtige hyfer. På dette tidspunkt kan zoner af hæmning ses omkring kompost fragmenter i B plade hvis komposten er undertrykkende. - Optage radius på tre steder pr. plade og beregne et gennemsnit af de tre til at tjene som en repræsentativ foranstaltning.
- Subtrahere middelværdien af B plader fra A plader. Hvis B < en derefter der er mikrober i B-plader, der er smittespredningshæmmende til R. solani patogenet.
- Opdele den gennemsnitlige radius af antallet af dage af udfordring at udtrykke enheder af relative undertrykkelse som et sats, mm mycelium pr. dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Færdige kompost bør være stabile og modne, to termer, der bruges ofte synonymt, så det kan være sikkert emballeret og transporteret og ikke forårsage bivirkninger under dets endelige anvendelsesformål4. Stabilitet er en modstand mod nedbrydning og er normalt bestemmes ved hjælp af indeks af mikrobielle aktivitet. Generelle foranstaltninger af mikrobielle åndedræt kan måle kompost stabilitet, men ikke nødvendigvis sygdom undertrykkelse af en aggressiv patogen og saprophyte som R. solani7. Denne undersøgelse fokuserer på modenhed som udleder materialet er klar til en bestemt anvendelse, og til gartneri formål, bestemmes af plante spiring og vækst assays.
Uddrag af levende kompost undertrykt R. solani vækst betydeligt mere end autoklaveres prøver (P ≤ 0,0001). Autoklavering dræber mikrobielle aktivitet, peger på en microbially medieret undertrykkelse. Dette bekræfter, at pladen A i metoden fungerer som en negativ kontrol for microbially medieret biologisk bekæmpelse (figur 3).
Figur 3: virkningerne af autoklavering på R. solani vækst i vitro, målt ved procentuelle ændringer i mycelial vækst fra kontrol. Et prøvemateriale er 'undertrykkende' for svampen, hvis radius af mycelial vækst er mindre end en autoklaveres kontrol. Illustreret er middel ± 1 standardafvigelse. Fejllinje for kontrolelementet autoklaveres er for små til at se. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Vækst af R. solani mycelium på kompost ekstrakt blev påvirket af kompost metode og råmateriale i opskrift af kompost, men ikke varighed af modning eller hærdning6,8. Væksten blev reduceret ved vermicompost og windrow processer og opskrifter der indeholder hårdttræ bark (figur 4). Suppressiveness repræsenterer en reduktion i væksten af R. solani.
Figur 4: brug af plade konkurrence analyse at sammenligne suppressiveness af kompost produkter. Betyder ± 1 standardafvigelse af ændringen i R. solani vækst på en autoklaveres reference plade. Kontrol og behandling sammenligninger blev podet med virulente R. solani. Værdier under nul repræsenterer suppressiveness. Suppressiveness af R. solani var påvirket af kompost A) metode, B) varigheden af hærdning eller modning, og C) opskrift. Processer i forhold blev tilsat kulsyre statisk bunke (ASP), skår (W), vermicompost (V) og anaerob nedbrydning (AD). Opskrift ingredienser i forhold var madaffald (F), fjerkrægylle (P), madaffald og fjerkrægylle (FP), mejeri gylle (M) og hårdttræ bark (H). Kontrasterende bogstaver over barer betegne behandlinger, der er væsentligt anderledes. Dette tal er blevet ændret fra Neher et al. 8 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi ved fra tidligere forskning, at visse kompost er effektiv til at undertrykke R. solani og at de smittespredningshæmmende virkninger skyldes mikrober bor i kompost, ikke de abiotiske egenskaber af kompost6,8. Brugen af autoklavering som et middel til at «dræbe «mikrobiota er blevet kritiseret, fordi det påvirker CO2 kemien i media10. Vi sammenlignede brugen af autoklavering til vakuum filtrering gennem Whatman nr. 1 papir. Behandlinger, der var hverken filtrerede eller autoklaveres viste den største undertrykkelse af R. solani vækst6. Filtrering fjernet de større, faste partikler, der var tilsyneladende vigtigt at sygdommen undertrykkelse af sandsynlige husly antibiotikum producerer mikrober.
Fordelene ved metoden er enkelhed og prisoverkommelighed. Lignende konklusioner og anbefalinger af Alfano et al. 2, plade konkurrence analyse er en hurtig foreløbig vurdering af sygdom undertrykkelse men ikke pålidelig som en standalone assay, fordi kun patogenet og ikke plante vært, er til stede. Derudover ville sygdom ikke etablere hvis miljøet var ugunstige; R. solani sygdomme er begunstiget af varme og fugtige forhold1. Generelt er der mere kompleksitet i jord og kompost økosystem end kunne efterlignes udelukkende af en enkelt laboratorium analysen4,8. Plade assay er sammenlignelig med andre indikatorer, herunder en ødelægge indeks af kompost modenhed og tre mikrobielle ecoenzymes, fosfatase, β-1,4-glucosidase og β-1,4-N-acetylglucosaminidase8. Ecoenzymes afspejler tilstanden af nedbrydning og kulstof og næringsstof behov af den mikrobielle samfund. Bekræftelse af suppressiveness kan opnås med plante assays, men de tager længere tid at fuldføre. Isolere og opretholde en ren kultur af en svamp sørger for at undgå kontaminering. ATCC9 tilbyder tips og teknikker til dyrkning af gær og filamentøs svampe.
Metoden er en potentiel kandidat til kommercielle certificering af sygdom smittespredningshæmmende egenskaber. Resultatet afspejler undertrykkelse som jord funktion. Det angiver ikke mekanismer eller specifikke mikrobielle arter ansvarlig for sygdommen undertrykkelse. En fremtidig anvendelse kunne være at skære en del af zonen hæmning for udvinding af DNA til sekvensering og identifikation af community-medlemmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vermont landbrugs eksperiment Station konkurrencedygtige Hatch Program VT-HO1609 finansieret forskning. Lynn Fang brugte metoden som en del af sit M.S. speciale på University of Vermont6.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
