Summary
提示する特定の合成物が含まれる細菌やカビイネ紋枯病菌の増殖を抑制する可能性があるかどうかを識別するためにプレートの競争の試金のためのプロトコルです。
Abstract
目標は、開発し、苗立ち枯れ病菌イネ紋枯病菌に対する特定堆肥の病抑制能力を検出する単純な手頃な価格、かつ効果的なバイオアッセイを最適化することでした。R. solaniは、植物のホストの世界の広い範囲の病原体です。菌は土壌、腐生植物として存続し、簡単な水寒天に急速に成長します。版の試金は、堆肥 R. solaniの成長を遅らせる能力を比較する迅速な方法です。アッセイも Pythium 根腐疫病菌根腐病、萎ナシ早い虫害など土壌中における腐生植物として生き残る他の土壌伝染性の病原菌の抑制とよく相関します。
Introduction
赤色菌核病菌を表しますどのあざ(フランク) のウイスキーの菌類の広い複合体 (アナモルフ枯kühn-=) 根腐病や立枯1の原因病原体は。イネ紋枯病菌は積極的な病原体、不利な環境条件1の下で菌核として生き残ることができる腐生植物です。その結果、グローバルな販売・ ナス科、マメ科、キク科、アブラナ科の深刻な経済的損失の結果を含む植物のホストの広い範囲で病気を引き起こすことができます。
堆肥は、ハーバーの特定植物病原体2の生物防除剤能力を持っています。ただし、すべての堆肥は似ているも、すべての病原体にも影響同様に3。木質炭素は干し草またはわら炭素ベースの堆肥よりも高いリグニン セルロース比率を。R. solaniわらは、容易に利用可能な炭素を好みます。対照的に、生物的防除菌、トリコデルマ属菌などは炭素がより容易に利用できるときに効果的です。有益なカビや細菌堆肥には、競争、対立または植物成長3の調整による病害を抑制できます。提案法は、主に抗生物質、ecoenzymes または病原体に有害であるキレート剤の生産によって作成された対立を検出します。
植物の生物検定は、堆肥を支持または植物成長4を抑止するかどうかを決定するためのゴールド スタンダードです。ただし、植物生物検定は時間がかかる (数ヶ月に週間) 以上必要し、根系の厳しさを定量化する根を持つ植物を抽出するより多くの労働を必要とする可能性がありますを完了します。比較的堅牢なより速く (日) 試金は品質管理プログラムに最適でしょう。このホワイト ペーパーの目標は、堆肥の抑制の可能性を予測する比較的迅速かつ正確なテストを示すことです。メソッドはアルファーノらにならってください。2 つの例外を除いて、堆肥エキス5が希釈し、寒天培地は、ポテト ・ デキスト ロース寒天培地 (PDA) の代わりに使用されました。PDA 昇格細菌や汚染文化6他のカビの増殖に対し、 R. solaniは簡単な水寒天に急速に育ちます。
この版の試金は土壌腐生植物の褐色根腐病や疫病菌根腐病、萎ナシ早い虫害R. solani7として生き残る植物病原体の範囲に適用される抑制のインジケーターとして機能します。版の競争の試金は、土壌病原体の生物的制御因子としての微生物のコミュニティを含むため堆肥製品の範囲を画面に便利です。アッセイ商業堆肥製品6,8疾患抑制の最も一貫した指標の一つであった。レシピ、成熟、および製造プロセスで彼らの変化の製品を選択しました。
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Protocol
1. 事前に準備します。
- マスター真菌培養 (テスト有機物)
- アメリカのタイプ文化コレクション微生物コレクション9、teleomorphあざ(フランク) (ATCC 10154)、ミャー 4031 から注文します。
- また: 者が行うローカル菌株を収集します。紅芯大根 (ダイコン) の苗が餌工場としても働くR. solaniによる減衰をオフまたはルートの腐敗の歴史があると知られている場所から土壌を収集します。土に種をまくし、苗が 3 〜 4 週間の古いルートの病変から分離します。
- 土壌から苗を外し、水道水ですすいでください。葉と根 (図 1) の胚軸部の茶色の組織形態を探します。
- シングル エッジかみそりの刃を使用すると、茶色の色を持つ胚軸、またはルートの 1 cm セグメントをカットします。1 分、滅菌水で 10 秒すすぎ後の世帯の漂白剤の 10% の解決でセグメントをディップするのに火炎滅菌鉗子を使用します。
注: 滅菌シャーレの上下は、このステップの便利なコンテナーです。 - 工場を移転する火炎滅菌使用鉗子のパットを乾燥させると水寒天 (1 L で 15 g) ペトリ皿のサーフェスに配置し、ペーパー タオルの内側に作品します。
- ふた付きプラスチック容器の中のシャーレを置き、室温 (約 20 ° C) で孵化させなさい。10% 漂白剤または 75% エタノールとコンテナーの内部を拭くし、皿を挿入する前に乾燥空気を入れます。
- (5 ° C) で (1 L で 17 g) 傾斜コーンミール寒天培地の最小媒体の長期貯蔵の菌株を維持します。
図 1: 病の症状です。R. solaniを含む土は、斑状の発芽と設立 (左) の結果します。ダイコン幼苗での現象は、胚軸 (右) で茶色の病変として発生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- この版の試金のための接種材料のジャガイモ デキスト ロース寒天 (1 L で 39 g) を使用します。
- ジャガイモ デキスト ロース寒天培地の 1 つで赤色菌核病菌文化の娘文化を確立またはアッセイの前に 2 日間それを保証する、定着してアッセイの前に、培養プレート上。新鮮なポテト ・ デキスト ロース寒天培地 (図 2) のプレートの中心にマスターの文化から R. solaniの小片 (直径 10 mm) を転送することによって娘文化を開始します。
注: 層流フードや汚染のリスクを最小限に抑えるため 10% 漂白剤または 75% エタノールの実験室ベンチを拭いてください。
- ジャガイモ デキスト ロース寒天培地の 1 つで赤色菌核病菌文化の娘文化を確立またはアッセイの前に 2 日間それを保証する、定着してアッセイの前に、培養プレート上。新鮮なポテト ・ デキスト ロース寒天培地 (図 2) のプレートの中心にマスターの文化から R. solaniの小片 (直径 10 mm) を転送することによって娘文化を開始します。
- オートクレーブ 25 mL 試験管 10 mL の蒸留水 (2 x サンプル数) の因数を持つ。
2. テスト用試料の調製
- オートクレーブ水 25 mL 試験管 10 mL に各堆肥のテスト サンプルの 2 つの独立した 0.5 g サンプルを追加します。一晩、試験管を振る。
- ユニークなサンプル数と各メンバー (参照) または B (サンプル) としてペアの試験管のラベルします。
- 24 h 後 2 125 mLconical フラスコに蒸留水 90 mL にプレーン寒天 1.5 g を追加します。
- オートクレーブ、寒天と低速排気設定と 20 分のため各組の A サンプルの両方の三角フラスコ。
- オートクレーブ後平衡 (約 30 分) に達するまでに、寒天と三角フラスコを 45 ° C の水浴に配置します。それが 45 ° C に冷却するまで任意のサンプルのスラリーを風呂の水に入れないでください。
図 2: プロトコルのイラスト。R. solaniのプラグは、堆肥水抽出培養シャーレに配置されます。解像度とコントラストを改善するために実体顕微鏡を用いて 1-2 日後菌糸増殖の直径を測定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- A 寒天培地フラスコの溶融の寒天に A サンプル (オートクレーブ参照) 合成物スラリーを注ぐ。寒天に堆肥を分散させるために旋回。
- B 寒天培地フラスコの溶融の寒天に B サンプル (サンプル生活) 合成物スラリーを注ぐ。寒天に堆肥を分散させるために旋回。
- 直径 100 mm は、5 つのプラスチック シャーレに各フラスコの混合物を注ぐ。
- 寒天が固まるので、一晩冷却プレートをしましょう。
3.赤色菌核病菌挑戦を追加します。
- サンプル寒天の各ペアに R. solaniの等しいサイズの部分の無菌技術を使用して、転送 (3 ~ 5 mm corkborer は等しい大きさで分類された部分によく動作します)。菌糸体は積極的に成長している保証するためにコロニーの外側の余白からコロニーの部分を取る。
注: 層流フードや実験室ベンチ 10% 漂白剤または 70% エタノールで拭きます。 - コロニーの成長は板の端に約半分の方法に到達するまで 1-2 日の室温でプレートを孵化させなさい。
4. R. solani の成長の測定します。
- 透過照明を用いたステレオ顕微鏡クリア フラット定規で最も近い 1 mm 各プレートで菌糸体の半径を測定します。
注: 斜めまたは暗いフィールド照明やすくなりますし透明な菌糸を測定します。この時点で、抑制のゾーン表示される B プレートで堆肥フラグメント周り堆肥は抑制です。 - プレートごとの 3 つの場所の半径を記録し、代表的な測定として機能する 3 つの平均を計算します。
- B プレート、プレートからの平均値を減算します。場合 B <イネ紋枯病菌を抑制、B プレートの微生物がありますし。
- 平均半径の相対的な抑制率、1 日あたり mm 菌糸体としての単位を表すへの挑戦の日数で割ります。
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Representative Results
終了する合成物は安定で、2 つの頻繁に使用される交換できるように、安全にパッケージ化して輸送できるので条件とない原因副作用その最終用途4の間に成熟しました。安定性分解への抵抗であり、通常微生物活性の指標を使用して決定されます。微生物の呼吸の一般的な措置の積極的な病原体とR. solani7などの腐生植物病抑制は必ずしも堆肥安定を測定します。本研究は、材料は特定の使用の準備ができているし、園芸用植物の発芽と成長の試金によって決定されます推測成熟度に焦点を当てた。
生活堆肥の抽出物抑制R. solani成長大幅オートクレーブ サンプル (P ≤ 0.0001) より。オートクレーブは、微生物、微生物を介した抑制を指すを殺します。これは、メソッドでプレート A が媒介微生物の生物的防除 (図 3) のネガティブ コントロールとして使用されることを確認します。
図 3: R. solani成長培養に及ぼすオートクレーブ、コントロールから菌糸の生育の変化率によって測定されます。菌糸成長半径がオートクレーブのコントロールよりも小さい場合、試験材料は '' 菌を抑制です。示すように、平均 ± 1 標準誤差です。オートクレーブのコントロールのエラー バーが小さすぎますを参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
堆肥エキスのr. イネ紋枯病菌菌糸の成長は堆肥方法と堆肥のレシピが、成熟または6、8を硬化のない期間の原料を受けます。成長は、ミミズ堆肥とウィンドロウ プロセスおよび広葉樹樹皮 (図 4) を含むレシピによって減った。発病は成長の減速を表すR. solani 。
図 4: 版の競争の試金の堆肥製品の発病を比較しています。± 1 標準誤差オートクレーブ参照プレートでR. solaniの成長の変化を意味します。コントロールと試験治療の比較の両方は、病原性R. solaniを接種しました。ゼロ以下の値は、発病を表します。R. solaniの発病は、堆肥の影響を受けた A), B) 硬化や成熟、C) レシピの期間。曝気処理した静的杭 (ASP)、ウィンドロウ (W)、ミミズ (V) 嫌気性消化 (AD) され、プロセスに比べると。レシピ食材と比較していた食品廃棄物 (F)、鶏糞 (P)、食品廃棄物と鶏糞 (FP)、牛ふん (M)、および広葉樹樹皮 (H)。バーの上の対照的な文字を示す治療法が大きく異なる。この図は、Neherらから変更されています。8この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
以前の研究から知っている特定の堆肥はR. solaniの抑制に効果的な抑制効果がコンポストに住む微生物堆肥6,8の非生物的プロパティではなくのためであります。'' 細菌を殺すためにオートクレーブの使用は、メディア10の炭素化学に影響を与えるために批判されています。ワットマン第 1 稿による真空ろ過するオートクレーブの使用を比較しました。フィルターもオートクレーブもなく治療は、 R. solani成長6の最大の抑制を示した。ろ過には、どうやら微生物の生産可能性が高い遺伝子抗生物質による病抑制に重要だったより大きい、固体粒子が削除されます。
メソッドの利点は、シンプルさと手頃な価格です。結論と推奨事項アルファーノらのよう2、板競争の試金は発病抑制がないスタンドアロンの試金として信頼性の高い迅速な予備的評価、病原体のみと植物ホストではなくが存在するためです。また、疾患では環境は有利な; なかったかどうかは確立しないでしょうイネ紋枯病は、暖かく、湿った条件1によって支持されています。全体的にみて、完全単一研究室アッセイ4,8によって模倣されることができるよりも土壌や堆肥の生態系の複雑さです。版の試金は堆肥の腐熟度と 3 つの微生物 ecoenzymes、ホスファターゼの線虫のインデックス、β-1, 4-グルコシダーゼと β-1, 4-β-n-アセチルグルコサミニダーゼの8を含むその他の指標に匹敵します。Ecoenzymes には、微生物の分解と炭素・栄養ニーズの状態が反映されます。発病の確認は、植物の試金で実現できますが、完了に時間がかかります。分離して菌の純粋培養を維持する世話を汚染を避けるために。ATCC9では、酵母や糸状菌を培養のヒントやテクニックを提供しています。
メソッドは、病気抑制プロパティの商業の認定のための潜在的な候補です。結果として土壌機能抑制に反映されます。メカニズムや病抑制に関与する特定微生物種は指定しません。将来のアプリケーションは、コミュニティのメンバーのシーケンスのための DNA の抽出と同定用抑制帯の部分をカットすることです。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
調査の資金をバーモント州農業試験場競争力のあるハッチング プログラム VT-HO1609。リン牙はバーモント大学6で彼女の修士の学位論文の一部としてメソッドを使用します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
