Summary
המוצג הוא פרוטוקול עבור assay תחרות הצלחת לזהות אם קומפוסט ספציפי הוא עשוי להכיל חיידקים ופטריות לדיכוי צמיחה של Rhizoctonia solani.
Abstract
המטרה הייתה לפתח, לייעל את פשוט, זול ויעיל bioassay לזהות מחלה היכולת המדכא של קומפוסט ספציפיים כנגד קטילת פטריות Rhizoctonia solani. Solani ר הוא. חיידק של מגוון רחב של צמחים מארחים ברחבי העולם. הפטרייה שרד בקרקעות כמו saprophyte, גדל במהירות במדיה אגר מים פשוטים. צלחת וזמינותו היא שיטה מהירה כדי להשוות composts ליכולתם להאט את הצמיחה של ר' solani. וזמינותו מופיע גם עם דיכוי של פתוגנים אחרים פטרייתי קטילת לשרוד כמו saprophytes בקרקעות כגון Alternaria מוקדם פגע רע, Fusarium ווילט, כימשון root רוט Pythium root רוט.
Introduction
Rhizoctonia מייצג את מתחם רחב של פטריות, של אילו Donk הקוקומריס Thanatephorus (פרנק) (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) היא המחלה גורמת root רוט, המתלים-off1. Rhizoctonia solani הוא של פתוגן אגרסיבי, saprophyte שיכולים לשרוד כמו sclerotia תחת בתנאי סביבה קיצוניים1. כתוצאה מכך, יש פיזור גלובלי והוא יכול לגרום למחלה על מגוון רחב של צמחים מארחים כולל סולניים, קטניות, מורכבים מצליבים וכתוצאה מכך רציני הפסדים כלכליים.
קומפוסט יש את היכולת הנמל סוכנים/מוצרים חדשים עבור מסוימים פתוגנים צמח2. עם זאת, לא כל composts דומים ולא משפיעים על כל הפתוגנים באופן דומה3. עץ מבוססי פחמן יש ליגנין גבוה יותר כדי תאית יחסי מאשר חציר או קש-פחמן המבוסס composts. רבי solani מעדיף זמינים פחמן נמצא קש. לעומת זאת, פטריות הדברה ביולוגית, כגון Trichoderma spp., יעילים יותר אם פחמן זמין פחות בקלות. מועיל פטריות וחיידקים לדשן יכול לדכא במחלות צמחים באמצעות תחרות, אנטגוניזם או ויסות גדילה הצמח3. הבדיקה המוצעת מזהה בעיקר אנטגוניזם שנוצרו על-ידי ייצור של אנטיביוטיקה, ecoenzymes או chelators הפוגעים בזכויות הפתוגן.
צמח bioassays הם תקן הזהב כדי לקבוע אם composts טובה או להרתיע גידול הצמח4. עם זאת, צמח bioassays הן זמן רב (שבועות עד חודשים) כדי להשלים את אשר עשוי להיות יותר זמן ממה הרצוי והוא דורש עוד עבודה כדי לחלץ צמחים בעלי שורשים כדי לכמת את החומרה של מערכות השורשים. וזהובה חזקים, אך מהיר יותר (ימים) מבחני יהיה אידיאלי עבור תוכניות בקרת איכות. המטרה של המאמר היא להפגין בדיקה מדויקת ומהירה יחסית כדי לנבא פוטנציאל המדכא של קומפוסט. השיטה הייתה בדוגמת אחרי אלפאנו. et al. 5 עם שתי חריגות, תמציות קומפוסט היו מדולל, אגר מים שימש במקום תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA). Solani ר גדל במהירות במדיה אגר מים פשוט ואילו PDA קידום התפתחותם של חיידקים ופטריות אחרים מזוהמים תרבות6.
זה וזמינותו צלחת מגישה כמחוון של דיכוי שחל על מגוון של פתוגנים צמח לשרוד בקרקע כמו saprophytes כולל solani ר7, Alternaria מוקדם פגע רע, Fusarium ווילט, כימשון root רוט Pythium root רוט. הצלחת התחרות וזמינותו שימושי למסך מגוון של מוצרים דשן המכיל קהילות של חיידקים זה לשמש הדברה ביולוגית סוכנים של פתוגנים בקרקע. וזמינותו היה אחד האינדיקטורים הכי עקבי של דיכוי המחלה ב קומפוסט מסחרי-מוצרים-6,-8. המוצרים נבחרו שלהם וריאציה מתכון, בגרות, ואת תהליך הייצור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכינים מראש
- תרבות פטרייתי מאסטר (מבחן האורגניזם)
- סדר מן האוסף סוג התרבות האמריקאית, מיקרוביולוגיה אוסף9, לפי teleomorph Thanatephorus הקוקומריס (פרנק) (בקרת האוויר 10154) או מאיה 4031.
- לחלופין: לאסוף מבודד מקומיים כפי שנעשה על ידי המחברים. אחרים-שתילים, צנון אדום (צנון sativus) עובד טוב כמו צמח פיתיון; לאסוף את אדמת ממיקום ידוע יש היסטוריה של המתלים-off או שורש ריקבון הנגרם על ידי רבי solani. לזרוע זרעים בקרקע ולבודד מן השורש נגעים כאשר השתילים הם בני 3-4 שבועות.
- להסיר את השתילים האדמה ולשטוף עם מים מהברז. חפשו רקמות חום באזור hypocotyl בין העלים השורש (איור 1).
- השימוש סכין גילוח יחיד, להב לחתוך קטעים 1 ס מ של hypocotyl או שורש יש צבע חום. להשתמש מלקחיים מחוטא-להבה לטבול את מקטעי בריכוז 10% של מלבין ביתי 1 דקות, ואחריו 10 s שטיפה במים סטריליים.
הערה: החלק העליון והחלק התחתון של צלחת פטרי סטריליות הם מיכלים שימושי עבור שלב זה. - שימוש מחוטא-להבה מלקחיים כדי להעביר את הצמח חתיכות הפנימי של מגבת נייר כדי פאט יבש ולאחר מכן מקם על פני צלחת פטרי עם אגר מים (15 גרם ב 1 ליטר).
- מניחים על צלחת פטרי בתוך מיכל פלסטיק עם מכסה, דגירה בטמפרטורת החדר (כ 20 ° C). לנגב את הפנים של המכולה עם 10% באקונומיקה או 75% אתנול, לתת לו אוויר יבש לפני הוספת המנה.
- שמור מבודד אחסון לטווח ארוך על מדיה מינימלי של אגר כשהתירס מלוכסנים (17 גרם ב 1 ליטר) (ב 5 ° C).
איור 1: תסמיני המחלה. קרקע המכילה solani רבי התוצאה אחידה נביטה הממסד (משמאל). הסימפטומים על צנון שתילים להופיע נגעים חום-hypocotyl (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- השתמש פלטות אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (39 גרם ב 1 ליטר) עבור inoculum עבור זה וזמינותו צלחת.
- ימסדו תרבות הבת של תרבות Rhizoctonia על אגר דקסטרוז תפוח אדמה אחד או יומיים לפני וזמינותו, כדי להבטיח זה מבוסס על הצלחת תרבות לפני וזמינותו. התחל את התרבות הבת העברת חלק קטן (קוטר 10 מ מ) solani ר מהתרבות מאסטר במרכז צלחת טריים של תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (איור 2).
הערה: תא למינארי או לנקות ספסל מעבדה עם אתנול באקונומיקה או 75% 10% כדי למזער את הסיכון של זיהום.
- ימסדו תרבות הבת של תרבות Rhizoctonia על אגר דקסטרוז תפוח אדמה אחד או יומיים לפני וזמינותו, כדי להבטיח זה מבוסס על הצלחת תרבות לפני וזמינותו. התחל את התרבות הבת העברת חלק קטן (קוטר 10 מ מ) solani ר מהתרבות מאסטר במרכז צלחת טריים של תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (איור 2).
- אוטוקלב תאים 25 מ ל מבחנות עם aliquots 10 מ"ל של מים מזוקקים (2 x מספר דוגמאות).
2. הכנת דוגמאות למבחן
- להוסיף שתי דגימות 0.5 ג'י עצמאית של כל מדגם מבחן קומפוסט 10 מ"ל מים בלוק במבחנות 25 מ. לנער את המבחנות בן לילה.
- תווית צינורות הבדיקה עם מספרים ייחודי, כל חבר של הזוג (הפניה) או B (דוגמה).
- לאחר 24 שעות, להוסיף 1.5 גר' אגר רגיל 90 מ ל מים מזוקקים ב mLconical 125 שתי מבחנות.
- אוטוקלב בשתי מבחנות חרוט עם אגר, המדגם A של כל זוג למשך 20 דקות עם סביבה הפליטה איטי.
- לאחר החיטוי, מקם את המבחנות חרוט עם אגר לתוך אמבט מים 45 ° C עד שיגיעו שיווי משקל (כ- 30 דקות). אל תשים שום slurries מדגם באמבט מים עד זה יש מקורר עד 45 מעלות צלזיוס.
איור 2: איור של פרוטוקול. פקקים של רבי solani ממוקמים על בצלחות פטרי המכילות תמצית מים קומפוסט. הקוטר של צמיחה mycelial נמדד לאחר 1-2 ימים בעזרת מיקרוסקופ סטריאו לשיפור רזולוציה וניגודיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- שופכים את slurry קומפוסט (הפניה בלוק) מדגם A לתוך אגר מותכת בקבוקי שתייה צידניות אגר A. מערבולת כדי לפזר קומפוסט לתוך אגר.
- שופכים את slurry קומפוסט (דוגמה חיה) מדגם B לתוך אגר מותכת בקבוקי שתייה צידניות אגר B. מערבולת כדי לפזר קומפוסט לתוך אגר.
- שופכים את התערובת של כל הבקבוק לתוך חמש צלחות פטרי פלסטיק שאינן 100 מ מ קוטר.
- תן הלילה קריר הצלחות אז אגר מתקשה.
3. מוסיפים את האתגר Rhizoctonia
- באמצעות הטכניקה aseptic, להעביר כל זוג של פלטות אגר מדגם בגודל שווה חתיכות של רבי solani (3-5 מ"מ corkborer עובד טוב להקים חתיכות בגודל שוות). סעו חתיכות של המושבה השוליים החיצוניים של המושבה כדי להבטיח תפטיר הוא גדל באופן פעיל.
הערה: תא למינארי או לנקות ספסל מעבדה עם אתנול באקונומיקה או 70%-10%. - תקופת דגירה הלוחות בטמפרטורת החדר של 1-2 ימים עד הגידול המושבה מגיע בערך בחצי הדרך לקצה של הלוחות A.
4. למדוד רבי solani צמיחה
- למדוד הרדיוס של תפטיר כל צלחת על 1 מ מ הקרובה עם סרגל ברור שטוח באמצעות מיקרוסקופ סטריאו עם תאורה המשודרת.
הערה: תאורה עקיפה או כהה בשדה זה מקל לראות ולמדוד את hyphae שקוף. בשלב זה, אזורי של דיכוי יהיה גלוי סביב קומפוסט שברי בצלחת B אם הקומפוסט הוא מדכאים. - להקליט את הרדיוס ב-3 מקומות לכל צלחת, לחשב ממוצע של שלושת לשמש כאמצעי נציג.
- הפחת הממוצע של הלוחות B מן הלוחות A. אם B < ואז יש חיידקים לוחית B כי הם מדכאים את המחלה solani ר .
- לחלק את רדיוס רשע לפי מספר ימי אתגר לבטא יחידות של דיכוי יחסית כמו קצב, תפטיר מ מ ליום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קומפוסט סיים צריך להיות יציב, בוגר, שני התנאים אשר משמשים לסירוגין, כך שזה יכול להיות בבטחה הארוזים מועברים, ואת לא לגרום תופעות לוואי במהלך שלו יסתיים השתמש4. יציבות היא התנגדות הפירוק, בדרך כלל נקבע באמצעות מדדי פעילות מיקרוביאלית. מידות כלליות של נשימה מיקרובית יכול למדוד קומפוסט יציבות אך לא בהכרח מחלה דיכוי של פתוגן אגרסיבי ושל saprophyte כגון רבי solani7. מחקר זה התמקד בגרות אשר יסיק החומר מוכן לשימוש מסוים, ואת, למטרות גינון, נקבע לפי מבחני נביטה וצמיחה של הצמח.
תמציות של composts חי דיכאו solani רבי צמיחה משמעותית יותר דוגמאות בלוק (P ≤ 0.0001). Autoclaving הורג את פעילות מיקרוביאלית, הצבעה על דיכוי microbially בתיווך. זה מאשר כי הצלחת א בשיטה משמש פקד שלילי עבור הדברה ביולוגית microbially בתיווך (איור 3)...
איור 3: השפעת autoclaving על solani רבי צמיחה במבחנה, כפי שהיא נמדדת אחוז השינוי mycelial הצמיחה של פקד. חומר המבחן הוא "מדכאים" את הפטריה אם הרדיוס של צמיחה mycelial הוא פחות מפקד בלוק. מאויר הם אמצעי ± 1 שגיאה סטנדרטית. הבר שגיאה עבור הפקד בלוק הוא קטן מדי כדי לראות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הצמיחה של תפטיר solani רבי על תמצית קומפוסט הושפע שיטת קומפוסט וחומרי הגלם את המתכון של קומפוסט, אבל לא משך ההבשלה או ריפוי6,8. צמיחה צומצם על ידי vermicompost, תהליכי windrow, מתכונים המכילים קליפת עץ (איור 4). Suppressiveness מייצג צמצום הצמיחה של solani ר.
איור 4: שימוש assay תחרות צלחת כדי להשוות את suppressiveness של מוצרים קומפוסט. פירושו ± 1 לשגיאה הסטנדרטית של שינוי solani רבי צמיחה בצלחת הפניה בלוק. פקדים והשוואות טיפול חוסנו עם ארסית solani ר. ערכים מתחת לאפס מייצגים suppressiveness. Suppressiveness של רבי solani הושפע קומפוסט א) שיטה, ב) משך ריפוי או התבגרות, ואת המתכון ג). תהליכים בהשוואה היו ערימת סטטי קצף (ASP), windrow (W), vermicompost (V), עיכול אנאירובי (AD). מתכון מרכיבים בהשוואה היו מזון פסולת (נ), זבל עופות (P), פסולת מזון זבל עופות (FP), חלב זבל (ז) ואת קליפת עץ (H). אותיות מנוגדים מעל ברים מציינות טיפולים שונים באופן משמעותי. דמות זו שונתה מ Neher. et al. 8 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו יודעים ממחקרים קודמים, כי composts מסוימים יעילים דיכוי solani רבי , כי ההשפעות מדכאים הם עקב חיידקים חיים של קומפוסט, לא את המאפיינים והאביוטיים של קומפוסט6,8. השימוש autoclaving כאמצעי ' להרוג ' microbiota ביקורת כי זה משפיע הפחמן הכימיה של מדיה10. השווינו את השימוש autoclaving כדי סינון ואקום באמצעות נייר וטמן מס ' 1. טיפולים שלא היו לא מסונן ולא בלוק הראה הדיכוי הגדול של רבי solani הצמיחה6. סינון להסיר את החלקיקים גדולה יותר, מוצק שהיו כנראה חשובה דיכוי מחלות על ידי אנטיביוטיקה מחסה סביר בהפקת חיידקים.
יתרונות השיטה הן הפשטות סבירים במיוחד. דומה המסקנות וההמלצות של אלפאנו. et al. 2, הצלחת התחרות וזמינותו היא הערכה ראשונית מהירה לדיכוי המחלה אבל לא אמין כמו assay עצמאי כי רק את הפתוגן, ואת לא הצמח הפונדקאי, קיים. חוץ מזה, המחלה לא להקים אם הסביבה היה שלילי; רבי solani מחלות הן המועדף על ידי תנאים חמה ולחה1. בסך הכל, יש מורכבות רבה יותר המערכת האקולוגית קרקע, קומפוסט ממה יכול להיות חיקה לחלוטין על-ידי מעבדה בודדת assay4,8. צלחת וזמינותו משולה סממנים אחרים כולל של נמטודות אינדקס של קומפוסט בגרות ו שלושה חיידקים ecoenzymes, פוספטאז, β-1, 4-glucosidase ו β-1, 4-N-acetylglucosaminidase8. Ecoenzymes משקף את מצב הפירוק לבין פחמן מזין צרכי הקהילה מיקרוביאלי. ניתן להשיג אישור של suppressiveness עם מבחני הצמח אך זמן רב כדי להשלים. בידוד ושמירה על תרבות טהור של פטריה מטפל כדי למנוע זיהום. בקרת האוויר9 מציע עצות ושיטות culturing שמרים ופטריות filamentous.
השיטה היא מועמד פוטנציאלי עבור אישורים מסחרית של המחלה מאפיינים מדכאים. התוצאה משקפת דיכוי כפונקציה קרקע. זה אינו מציין מנגנונים או מינים מיקרוביאלי ספציפי האחראי על דיכוי מחלות. יישום בעתיד יכול להיות כדי לגזור חלק של האזור עיכוב עבור החילוץ של ה-DNA של רצף וזיהוי של חברי הקהילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ורמונט החקלאי ניסוי תחנת תחרותי הפתח תוכנית VT-HO1609 מימנה את המחקר. פאנג לין השתמש בשיטת במסגרת עבודת הדוקטורט שלה טרשת נפוצה ב אוניברסיטת ורמונט6.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
