Summary
Presenteras är ett protokoll för en tallrik konkurrens analys identifiera om en specifik kompost sannolikt innehåller bakterier och svampar som hämmar tillväxten av Rhizoctonia solani.
Abstract
Målet var att utveckla och optimera en enkel, prisvärd och effektiv bioassay för att upptäcka sjukdom suppressiv förmågan hos en specifik kompost mot soilborne svampen Rhizoctonia solani. R. solani är en patogen av ett brett utbud av växten varar värd över hela världen. Svampen överlever i jordar som en saprophyte och växer snabbt på enkelt vatten agar media. Plattan analysen är en snabb metod att jämföra komposter för deras förmåga att bromsa tillväxten av R. solani. Analysen också korrelerar väl med dämpning av andra soilborne svamp patogener som överlever som saprofyter i jordar som Alternaria tidiga blights, Fusarium vissnesjuka, Phytophthora rotröta och Pythium rotröta.
Introduction
Rhizoctonia representerar ett brett komplex av svampar, av vilka Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) är den patogen som orsakar rotröta och dämpning-off1. Rhizoctonia solani är en aggressiv patogen och en saprophyte som kan överleva som sklerotier under ogynnsamma miljöförhållanden1. Som ett resultat, den har en global distribution och kan orsaka sjukdom på brett utbud av växten varar värd inklusive Solanaceae, ärtväxter, Asteraceae och korsblommiga växter som medför allvarliga ekonomiska förluster.
Komposten har kapacitet att hysa Agrilus agenter för vissa växt patogener2. Dock inte alla komposter är likadana, inte heller påverkar de alla patogener likaså3. Trä-baserade kol har högre lignin till cellulosa nyckeltal än hö eller halm-kol baserade komposter. R. solani föredrar lättillgängliga kol Funna i halm. Däremot är biologisk bekämpning svampar, såsom Trichoderma spp., mer effektiva när kol är mindre lättillgängliga. Nyttiga svampar och bakterier till kompost kan undertrycka växtsjukdomar genom konkurrens, antagonism eller reglera växt tillväxt3. Föreslagna analysen identifierar primärt antagonism skapad av produktion av antibiotika, ecoenzymes eller kelater som är skadliga för patogen.
Växter bioassays är en guld-standard för att avgöra om komposter gynna eller avskräcka växt tillväxt4. Växter bioassays är dock tidskrävande (veckor till månader) att slutföra som kan vara längre än önskat och kräver mer arbete att extrahera växter med rötter att kvantifiera graden av rotsystem. Comparably robust men snabbare (dagar) analyser skulle vara perfekt för kvalitetskontroll program. Syftet med denna uppsats är att visa en relativt snabb och noggrann test för att förutsäga suppressiv potential av kompost. Metoden var mönstrad efter Alfano o.a. 5 med två undantag, kompost extrakt späddes och vatten agar användes i stället för potatis dextros agar (PDA). R. solani växer snabbt på enkelt vatten agar media PDA främjat tillväxt av bakterier och andra svampar som förorenat den kultur6.
Denna plattan analys fungerar som en indikator av förtryck som gäller för en rad växt patogener som överlever i jord som saprofyter inklusive R. solani7, Alternaria tidiga blights, Fusarium vissnesjuka, Phytophthora rotröta och Pythium rotröta. Plattan konkurrens analysen är användbar till skärmen en rad kompost produkter för innehåller samhällen av mikrober som tjänar som biologiska kontrollagenter jord patogener. Analysen var en av de mest konsekventa indikatorerna av sjukdom bekämpande i kommersiella kompost produkter6,8. Produkter valdes för sin variation i recept, mognad och produktionsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered i förväg
- Master svamp kultur (testorganismen)
- Beställ från amerikanska typ kultur insamling, mikrobiologi samling9, genom dess teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) eller MYA 4031.
- Alternativt: Samla lokala isolat som görs av författarna. Plantor av röda rädisa (Raphanus sativus) fungerar bra som en bete växt; samla in jord från en plats känd för att ha en historia av dämpning-off eller Rota rötan orsakas av R. solani. Så frön i marken och isolera från roten lesioner när plantorna är 3 till 4 veckor gamla.
- Ta bort plantor från mark och skölj i rinnande vatten. Leta efter brun vävnad i regionen hypocotyl mellan bladen och roten (figur 1).
- Använd ett enda vassa rakblad för att skära 1 cm segment av hypocotyl eller rot som har en brun färg. Använda flame-steriliserad pincett för att doppa segmenten i 10% lösning av hushållsblekmedel för 1 min, följt av en 10 s sköljning i sterilt vatten.
Obs: Upptill och nedtill av en steril petriskål är användbar behållare för detta steg. - Användning flame-steriliserad pincett att överföra växten bitar på insidan av en pappershandduk att klappa torrt och sedan placera på ytan av en petriskål med vatten-agar (15 g i 1 L).
- Placera Petri skålen inuti en plastbehållare med lock och inkubera vid rumstemperatur (cirka 20 ° C). Torka insidan av behållaren med 10% blekmedel eller 75% etanol och låt det lufttorka innan du sätter in skålen.
- Hålla isolat i långsiktig lagring på en minimal media av majsmjöl agar (17 g i 1 L) vinklingar (5 ° C).
Figur 1: sjukdomssymtomen. Jord som innehåller R. solani resulterar i ojämn grobarhet och etablering (vänster). Symtom på rättika plantor förekommer som brun lesioner vid hypocotyl (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Använda potatis dextros agarplattor (39 g i 1 L) för inokulum för denna plattan analys.
- Upprätta en dotter kultur av Rhizoctonia kultur på potatis dextros agar en eller två dagar innan analysen, att försäkra det är väl etablerat på kultur plattan innan analysen. Starta dotter kulturen genom att överföra en liten bit (10 mm diameter) av R. solani från master kulturen till mitten av en färsk platta av potatis dextros agar (figur 2).
Obs: Fungerar i en LAF eller torka en arbetsbänk med 10% blekmedel eller 75% etanol att minimera risken för kontaminering.
- Upprätta en dotter kultur av Rhizoctonia kultur på potatis dextros agar en eller två dagar innan analysen, att försäkra det är väl etablerat på kultur plattan innan analysen. Starta dotter kulturen genom att överföra en liten bit (10 mm diameter) av R. solani från master kulturen till mitten av en färsk platta av potatis dextros agar (figur 2).
- Autoklav 25 mL provrör med 10 mL alikvoter av destillerat vatten (2 x antal prover).
2. beredning av prover för Test
- Lägga till två oberoende 0,5 g prover av varje kompost prov 10 mL Ånghärdad vatten i 25 mL provrör. Skaka provrören över natten.
- Märk rören med unika prov nummer, och varje medlem i paret som en (referens) eller B (prov).
- Efter 24 h, tillsätt 1,5 g vanlig agar till 90 mL destillerat vatten i två 125 mLconical kolvar.
- Autoklav både koniska kolvar med agar och A provet av varje par för 20 min med en långsam avgaser inställning.
- Efter autoklav, placera de koniska kolvarna med agar i en 45 ° C-vattenbad tills de når jämvikt (ca 30 min). Placera inte något prov slam i vattenbad tills den har svalnat till 45 ° C.
Figur 2: Illustration av protokollet. Pluggar av R. solani placeras på petriskålar som innehåller komposten vattenextrakt. Diametern på mycelial tillväxt mäts efter 1-2 dagar med hjälp av en stereo Mikroskop för att förbättra upplösning och kontrast. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Häll den smälta agar agar kolvens A A prov (Ånghärdad referens) kompost suspensionen. Virvel att skingra kompost i ägarn.
- Häll den smälta agar agar kolvens B B prov (levande prov) kompost suspensionen. Virvel att skingra kompost i ägarn.
- Häll blandningen av varje kolv i fem petriskålar av plast som är 100 mm i diameter.
- Låt plattorna cool övernattnings så ägarn hårdnar.
3. Tillsätt Rhizoctonia utmaningen
- Använd aseptisk teknik, överföra lika stora bitar av R. solani till varje par av provet agarplattor (3 till 5 mm corkborer fungerar bra för att upprätta lika stora bitar). Ta bitar av kolonin från yttermarginalen av kolonin att försäkra mycel växer aktivt.
Obs: Fungerar i en LAF eller torka en arbetsbänk med 10% blekmedel eller 70% etanol. - Inkubera plattorna vid rumstemperatur i 1-2 dagar tills kolonin tillväxten når ungefär halvvägs till kanten av A pläterar.
4. Mät R. solani tillväxt
- Mät radien av mycelet i varje platta till närmaste 1 mm med en tydlig plan linjal med stereo Mikroskop med överförda belysning.
Obs: Sneda eller mörka fält belysning kommer att göra det lättare att se och mäta de transparenta hyfer. Vid denna punkt, syns hämningszoner runt komposten fragment i B plattan om komposten är suppressiv. - Spela in radien på tre ställen per platta och beräkna ett medelvärde av de tre att tjäna som ett representativt mått.
- Subtrahera medelvärdet av B plattorna från A plattorna. Om B < en sedan finns mikrober i B tallrikar som är suppressiv till R. solani patogenen.
- Dividera medelvärdet radien med antalet dagar utmaning att uttrycka enheter av relativa dämpning som en kurs, mm mycel per dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Färdiga komposten bör vara stabil och mogen, två termer som ofta används omväxlande, så det kan vara säkert förpackade och transporteras, och inte orsaka negativa effekter under dess slutanvändning4. Stabilitet är ett motstånd mot nedbrytning och vanligtvis bestäms med hjälp av index av mikrobiell aktivitet. Allmänna åtgärder av mikrobiell andning kan mäta kompost stabilitet, men inte nödvändigtvis sjukdom dämpning av en aggressiv patogen och saprophyte såsom R. solani7. Denna studie fokuserar på mognad som härleder materialet är redo för en viss användning, och, för trädgårdsodling, bestäms av växten grobarhet och tillväxt analyser.
Extrakt av de levande komposter undertryckta R. solani tillväxten betydligt mer än Ånghärdad prover (P ≤ 0,0001). Autoklavering dödar mikrobiell aktivitet, pekar på en mikrobiellt medierad dämpning. Detta bekräftar att plattan A i metoden fungerar som en negativ kontroll för mikrobiellt medierad biologisk bekämpning (figur 3).
Figur 3: effekter av autoklav på R. solani tillväxt in vitro-, mätt som procentuell förändring i mycelial tillväxt från kontroll. Ett testmaterial är 'suppressiv' till svampen om radien av mycelial tillväxt är mindre än en Ånghärdad kontroll. Illustrerade är medel ± 1 standardavvikelse. Fel baren för Ånghärdad kontroll är för liten att se. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tillväxten av R. solani mycel på komposten extrakt påverkades av kompost metod och råvara i receptet av kompost men inte löptid mognad eller bota6,8. Tillväxt minskade vermicompost och windrow processer och recept som innehåller lövträ bark (figur 4). Suppressiveness motsvarar en minskning av tillväxten av R. solani.
Figur 4: användning av plattan konkurrens analys att jämföra suppressiveness av kompost produkter. Innebär ± 1 standardfel för förändringen i R. solani tillväxt på en Ånghärdad referens tallrik. Både kontroller och behandling jämförelser var inokuleras med virulent R. solani. Värden under noll representerar suppressiveness. Suppressiveness av R. solani påverkades av kompost A) metod, B) varaktigheten av härdning eller mognad, och C) recept. Processer som jämfördes var kolsyrat statisk lugg (ASP), windrow (W), vermicompost (V) och rötning (AD). Recept ingredienser jämfört var matavfall (F), fjäderfägödsel (P), matavfall och fjäderfägödsel (FP), mejeri gödsel (M) och lövträ bark (H). Kontrasterande bokstäver ovanför barer beteckna behandlingar som skiljer sig avsevärt. Denna siffra har ändrats från Neher o.a. 8 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi vet från tidigare forskning, att vissa komposter är effektiva på att undertrycka R. solani och att suppressiv effekterna är på grund av de mikrober som lever i komposten, inte abiotiska egenskaperna för kompost6,8. Användningen av autoklav som ett sätt att 'döda' bakterieflora har kritiserats eftersom den påverkar de media10kol kemi. Vi jämförde användningen av autoklavering till dammsugarfilter genom Whatman nr 1 papper. Behandlingar som varken var filtrerade eller autoklaveras visade störst dämpning av R. solani tillväxt6. Filtrering bort de större, fasta partiklar som var tydligen viktigt att sjukdomen undertryckande av sannolikt hysande antibiotikum producerar mikrober.
Fördelarna med metoden är dess enkelhet och överkomliga priser. Liknande slutsatser och rekommendationer av Alfano o.a. 2, plattan konkurrens analysen är en snabb preliminär bedömning av sjukdom förtryck men inte pålitlig som en fristående analys eftersom endast den sjukdomsalstrande organismen, och inte växt värden, är närvarande. Sjukdom skulle dessutom inte fastställa om miljön var unfavorable; R. solani sjukdomar gynnas av varm och fuktig villkor1. Sammantaget finns det mer komplexitet i jord och kompost ekosystemet än kunde vara härmade fullständigt av en enda laboratorium analys4,8. I plate assay är jämförbar med andra indikatorer inklusive en nematoder index av kompost mognad och tre mikrobiella ecoenzymes, fosfatas, β-1,4-glukosidas och β-1,4-N-acetylglucosaminidase8. Ecoenzymes återspeglar tillståndet för nedbrytning och kol och näringsämne behov av mikrobiell gemenskap. Bekräftelse av suppressiveness kan uppnås med växt-analyser, men de tar längre tid att slutföra. Isolera och underhålla en renkultur av en svamp hand tar för att undvika kontaminering. ATCC9 erbjuder tips och metoder för odling av jäst och filamentösa svampar.
Metoden är en potentiell kandidat för kommersiella certifiering av sjukdom suppressiv boenden. Resultatet speglar dämpning som markens funktion. Det anger inte mekanismer eller specifika mikrobiell arter som är ansvarig för sjukdomen dämpning. En framtida tillämpning kan vara att klippa ut en del av zonen hämning för extraktion av DNA för sekvensering och identifiering av community-medlemmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vermont jordbruks Experiment Station konkurrenskraftiga Hatch Program VT-HO1609 finansierade forskningen. Lynn Fang används metoden som en del av sin M.S. avhandling vid University of Vermont6.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
