Summary
هنا، نحن نقدم ثلاث تجارب مختلفة لدراسة الإصابة Aeromonas في C. ايليجانس. باستخدام هذه الأساليب ملائمة، فمن السهل تقييم سمية فيما بين وداخل الأنواع Aeromonas .
Abstract
مسببات الأمراض البشرية Aeromonas ثبت سريرياً يسبب التهاب المعدة والأمعاء، وعدوى الجرح، وتسمم الدم، والتهابات المسالك البولية. قد أبلغ معظم البشرية من الأمراض تترافق مع أربعة أنواع من البكتيريا: Aeromonas دهاكينسيس هيدروفيلا Aeromonasو بروني Aeromonasو كافي أيروموناس. نموذج الكائن الحي ايليجانس كاينورهابديتيس هو باكتيريفوري الذي يوفر نموذج عدوى ممتازة لدراسة الآلية المرضية البكتيرية من أيروموناس. وهنا، نحن نقدم ثلاث تجارب مختلفة لدراسة الإصابة أيروموناس باستخدام نموذج C. ايليجانس ، بما في ذلك البقاء على قيد الحياة وسمية سائلة وفحوصات نخر العضلات. وكانت نتائج ثلاثة أساليب تحديد ضراوة Aeromonas متسقة. وأبدى دهاكينسيس (أ) أن تكون الأكثر سمية بين 4 أهم الأنواع Aeromonas تسبب العدوى السريرية. وترد هذه الأساليب لتكون وسيلة مريحة لتقييم سمية فيما بين وداخل الأنواع Aeromonas وتسهم في فهمنا للآلية المرضية للإصابة أيروموناس .
Introduction
مسببات الأمراض البشرية، Aeromonas، ثبت سريرياً يسبب التهاب المعدة والأمعاء، وعدوى الجرح، وتسمم الدم، والتهابات المسالك البولية1،2. أبلغ معظم الأمراض البشرية المرتبطة بها لتكون مرتبطة مع أربعة أنواع من البكتيريا: 2، دهاكينسيس أيروموناس، هيدروفيلا Aeromonasو بروني Aeromonasو كافي Aeromonas 3 , 4 , 5-من بين الأمراض المعدية أيروموناس ، يمكن أن يسبب التهابات الأنسجة اللينة حادة في معدلات الاعتلال والوفيات في البشر. ملاحظة، نخر العضلات هو أشد أشكال الأنسجة اللينة العدوى6. المراقبة للبقاء على قيد الحياة ونخر العضلات من ايليجانس كاينورهابديتيس بعد الإصابة أسلوب مناسب للتكهن بسمية Aeromonas.
فعلا طور العلماء الكائنات نموذج عديدة لدراسة حالات العدوى البكتيرية. في دراسات سابقة، استخدمت الفئران، زيبرافيشيس، والديدان الخيطية كنماذج حيوانية لدراسة الآلية المرضية وضراوة Aeromonas6،،من78. كل نموذج الحيوان في ' المزايا والتطبيقات. نموذج الكائن الحي، ايليجانس كاينورهابديتيس، هي ديدان أسطوانية باكتيريفوروس أي مأخذ البكتيريا فودناتورالي. C. ايليجانسطورت نظام المناعة فطرية معقدة ضد العدوى البكتيرية على مدى تطورها. وقد ثبت C. ايليجانس تحت ضغط العدوى البكتيرية، تكون نموذجا عدوى ممتازة لدراسة الآلية المرضية البكتيرية أيروموناس6،،من79 ومسببات الأمراض الأخرى مثل الفطريات10 واسشيريشيا الإشريكيّة القولونية O157:H711. ومع ذلك، لا يزال هناك لا المنشور يركز على المنهجية في استخدام C. ايليجانس كنموذج لدراسة ضراوة Aeromonas.
هنا، نحن نقدم ثلاث تجارب مختلفة لدراسة الإصابة Aeromonas استخدام C. ايليجانس كنموذج حيوان: فحوصات للبقاء على قيد الحياة وسمية سائلة ونخر العضلات. هذه الأساليب طريقة ملائمة لتقييم سمية فيما بين وداخل الأنواع Aeromonas وتحسين فهم الآلية المرضية أيروموناس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد متوسطة الثقافة
ملاحظة: انظر الجدول 1 لإعداد الحل.
- إعداد M9 المتوسطة12، حل 1.5 ز خ2ص4، ز 5.66 Na2هبو4و 2.5 g من كلوريد الصوديوم في 500 مل مياه.. انتظر حتى تبرد بدرجة حرارة الغرفة اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية عن 20 دقيقة ثم قم بإضافة 0.5 مل من 1 م MgSO4 قبل أول استخدام.
- إعداد السلكية النمو المتوسطة (NGM)12، يحل الجيل الثالث 3g كلوريد الصوديوم، ببتون البكتيرية 2.5 g، واجار ز 20 في 1 لتر مياه.. انتظر حتى تبرد إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية عن 20 دقيقة ثم قم بإضافة 1 مل م 1 كاكل2، 1 مل 1 م MgSO4، 1 مل 5% الكولسترول في الإيثانول، و 25 مل من المخزن المؤقت للفوسفات. دوامة مزيج جيد.
- صب حوالي 5 مل NGM في كل سم 6 طبق بيتري. تجنب إنتاج فقاعة على السطح اللوحة. ترك لوحات في درجة حرارة الغرفة 1 ليلة وحزمة إنقاذ في 4 درجات مئوية. يعود إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
- إعداد المخصب NGM (أنجم)، حل ببتون البكتيرية ز 5 واستخراج الخميرة ز 1، ز 3 كلوريد الصوديوم واجار 30 جرام في 1 لتر مياه.. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية 20 دقيقة للانتظار حتى تبرد إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي، وإضافة 1 مل م 1 كاكل2، 1 مل 1 م MgSO4، 1 مل 5% الكولسترول في الإيثانول، و 25 مل من المخزن المؤقت للفوسفات. دوامة مزيج جيد.
- صب حوالي 10 مل أنجم في كل سم 9 طبق بيتري. تجنب إنتاج فقاعة على السطح اللوحة. ترك لوحات في درجة حرارة الغرفة 1 ليلة وحزمة إنقاذ في 4 درجات مئوية. يصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
- إعداد متوسطة S12، خلط 40 مل S القاعدية، 0.4 مل سترات البوتاسيوم 1 م، المعادن تتبع 0.4 مل الحل، 0.12 مل كاكل 1 م2، 0.12 مل من 1 م MgSO4، 40 ميليلتر من الكوليسترول 5% في الإيثانول ومل 1 من 8 مم فودر قبل الاستخدام.
2-تزامن ايليجانس جيم-6،،من912
- أغسل حوالي 2,000 الديدان في مرحلة جرابيد الكبار مع 10 مل مياه المعقمة في أنبوب 15 مل. تغسل البكتيريا 3 x، حفظ الديدان في الجزء السفلي من الأنبوب.
- الطرد المركزي العينة لمدة 1 دقيقة على 500 x ز لهدم الديدان. إزالة المادة طافية، والاحتفاظ الديدان في 3.5 مل منزوع الماء.
- أضف 1 مل NaOCl (10 – 15%) و 0.5 مل م 5 كوه في الأنبوب. المزيج بالتساوي بالهز < 6 دقيقة الهيئات دودة.
- بعد أن يتم الإفراج عن البيض من الديدان، أضف منزوع 10 مل من الماء لوقف تحلل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في س 1,200 ز هدم البيض وإزالة المادة طافية بقدر الإمكان. يغسل مع 15 مل M9 المتوسطة على الأقل 3 س.
ملاحظة: راجع الخطوة 1.1 لتكوين المتوسطة M9. - الحفاظ على البيض في المتوسط 1 مل M9. نقل البيض إلى طبق 3.5 سم للحضانة في 20 درجة مئوية لليلة واحدة (حوالي 12-18 ساعة).
ملاحظة: بعد الحضانة، سوف يفقس البيض دودة اليرقة التي تسمى كأول مرحلة من مراحل اليرقة (L1). - "الماصة؛" إلى 10 ميليلتر من الديدان L1 في المتوسط M9. عد دودة وحساب تركيز L1 الديدان في المتوسط M9.
- البذور في معظم 10,000 المحتضنة الديدان المرحلة L1 مع بيبيت على لوحة أنجم 9 سم تنتشر مع OP50 الإشريكيّة القولونية .
- في هذه الخطوة، مثقف انتشار 0.5 مل بين عشية وضحاها OP50 كولاي مع مرق لوريا بيرتاني (رطل) على لوحة أنجم 9 سم. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية ح 16 – 18
ملاحظة: لتفادي التلوث، ينبغي إجراء هذه الخطوة نشر في غطاء الاندفاق الصفحي. - تبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل البذر الديدان L1. البذور في معظم 10,000 المحتضنة L1 المرحلة الديدان على لوحة أنجم مع OP50 كولاي .
- في هذه الخطوة، مثقف انتشار 0.5 مل بين عشية وضحاها OP50 كولاي مع مرق لوريا بيرتاني (رطل) على لوحة أنجم 9 سم. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية ح 16 – 18
- احتضان الديدان في 20 درجة مئوية ح 44، أو حتى أنها تنمو إلى مرحلة اليرقة (L4)ال 4.
ملاحظة: راجع الخطوة 1.3 لتكوين أنجم المتوسطة. وقد دودة نقطة بيضاء في الشكل هالفمون في منتصف الجانب الجسم في مرحلة L4. - استخدام L4 متزامنة المرحلة الديدان في الاختبارات التالية. استخدم نوع البرية N2 الديدان في مقايسة البقاء C. ايليجانس مع دهاكينسيس Aeromonas والمقايسة سمية سائلة C. ايليجانس مع دهاكينسيس أيروموناس. استخدام الديدان RW1596 (myo-3(st386)؛ stEx30 [ميو-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) في مقايسة نخر العضلات C. ايليجانس مع دهاكينسيس أيروموناس.
3- C. ايليجانس "بقاء المقايسة" مع Aeromonas،من69
- في يوم البذر الديدان L1 في أنجم نشر مع OP50 كولاي ، اختيار مستعمرة واحدة من كل أربع سلالات أيروموناس أو OP50 كولاي والثقافة مع 2 مل مرق رطل على التوالي في 37 درجة مئوية ح 16.
ملاحظة: لتجنب التلوث، يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الاندفاق الصفحي. وهنا استخدمت السلالات البكتيرية التالية: OP50 كولاي ، مصدر الغذاء الطبيعي ايليجانس جيم. أ-دهاكينسيس AAK1، أول التسلسل الكامل المسببة للأمراض السريرية دهاكينسيس (أ) عزل. ألف-هيدروفيلا A2-066 و بروني ألف- A2-007 و كافي أ- A2-9307121 هي بالإسم السريرية المعزولة من مستشفى جامعة الكونغ تشنغ الوطني. - قياس امتصاص600 OD من مرق البكتيرية وضبط مرق البكتيرية OD600 = 2.0 مع مرق رطل.
- بقعة وانتشرت 30 ميليلتر من مرق البكتيرية كل لوحة NGM 6 سم. الثقافة اللوحات في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: راجع الخطوة 1.2 لتكوين NGM المتوسطة. - اليوم تنمو الديدان L1 إلى مرحلة L4، عشوائياً اختيار ونقل الديدان 50 صفيحة NGM مع كل أربع سلالات أيروموناس أو OP50 كولاي .
- احتضان لوحات NGM في 20 درجة مئوية حتى يتم الانتهاء المقايسة.
- نقل جميع الديدان الحية لصفيحة NGM أعدت حديثا مع البكتيريا والعد الأرقام للعيش، الميتة، والديدان استشعار كل يوم حتى الدودة آخر ميت.
ملاحظة: نقل الديدان إلى لوحة NGM إعداد جديدة كل يوم للحفاظ على الإصابة، حتى في حالة استخدام الديدان العقيمة (مثلاً، glp-4، أو مع فودر). - رسم منحنيات البقاء على قيد الحياة تقوم على حساب البيانات اليومية.
4- C. ايليجانس "المقايسة سمية السائل" مع أيروموناس7
ملاحظة: لتجنب التلوث، ينبغي إجراء الخطوات في غطاء الاندفاق الصفحي.
- اختيار اليوم بعد البذر الديدان L1 على لوحة أنجم انتشرت مع OP50 كولاي ، مستعمرة واحدة من كل أربع سلالات Aeromonas OP50 كولاي ، والثقافة مع 5 مل مرق رطل كل في 37 درجة مئوية ح 16.
ملاحظة: في البروتوكول، وسلالات البكتيريا التالية استخدمت: OP50 كولاي ، مصدر الغذاء الطبيعي ايليجانس جيم. أ-دهاكينسيس AAK1، أول التسلسل الكامل المسببة للأمراض السريرية دهاكينسيس (أ) عزل. ألف-هيدروفيلا A2-066 و بروني ألف- A2-007 و كافي أ- A2-9307121 هي بالإسم السريرية المعزولة من مستشفى جامعة الكونغ تشنغ الوطني. - قياس امتصاص600 OD من مرق البكتيريا.
- الطرد المركزي مرق البكتيرية في س 3,500 ز لمدة 15 دقيقة لإزالة مرق رطل. ريسوسبيند البكتيريا وضبط مرق البكتيرية OD600 = 3.0 مع المتوسطة S. إضافة ميليلتر 195 من مرق البكتيرية في المتوسط S إلى آبار على الأقل 8 من لوحة 96-جيدا.
ملاحظة: راجع الخطوة 1، 6 لتكوين المتوسطة S. - يغسل الديدان L4 على لوحة أنجم مع البرنامج التنفيذي 5 كولاي استخدام المتوسطة M9. ضبط الحل دودة لتركيز ديدان 5 كل ميليلتر وإضافة 5 ميليلتر من دودة الحل لكل بئر من لوحة 96-جيدا. التأكد من أن هناك ما يقرب من 25 الديدان كل بئر.
- احتضان لوحة 96-جيدا على شاكر 200 لفة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية.
- حساب العدد من الديدان الحية والديدان الميت بعد 24 و 48 و 72 حاء حساب معدلات البقاء على قيد الحياة لكل بئر بالصيغة التالية: (يعيش إلى مجموع الديدان الديدان) × 100%.
- رسم الرسم بياني مؤامرة مبعثر مع حساب البيانات اليومية.
5- C. ايليجانس "المقايسة نخر العضلات" مع أيروموناس6
ملاحظة: لتجنب التلوث، ينبغي تنفيذ هذه الخطوات في غطاء الاندفاق الصفحي.
- في اليوم هي تبذر الديدان L1 في أنجم انتشرت مع OP50 كولاي ، واختيار مستعمرة واحدة من كل أربع سلالات Aeromonas و OP50 كولاي والثقافة مع 2 مل رطل مرق كل في 37 درجة مئوية ح 16.
ملاحظة: وهنا استخدمت سلالات البكتريا التالية: OP50 كولاي ، مصدر الغذاء الطبيعي ايليجانس جيم. أ-دهاكينسيس AAK1، أول التسلسل الكامل المسببة للأمراض السريرية دهاكينسيس (أ) عزل. هيدروفيلا أ- A2-066 و فيروني أ- A2-007 و كافياي أ- A2-9307121 هي بالإسم السريرية المعزولة من مستشفى جامعة الكونغ تشنغ الوطنية. - قياس امتصاص600 OD من مرق البكتيريا وضبط مرق البكتيريا إلى OD600 = 2.0 مع مرق رطل. بقعة وانتشرت 30 ميليلتر من مرق البكتيرية في لوحات NGM 6 سم. الثقافة اللوحات في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- في اليوم تنمو الديدان L1 إلى مرحلة L4، نقل الديدان 50 لكل لوحة NGM مع كل أربع سلالات أيروموناس أو OP50 كولاي . احتضان لوحات NGM في 20 درجة مئوية. نقل الديدان كل 24 ساعة إلى لوحات NGM أعدت حديثا مع البكتيريا.
- تأخذ الصور العضلات باستخدام مجهر الأسفار.
- عشوائياً اختيار الديدان 10 على 2% [اغروس] هلام في المتوسط M9 على شريحة. شل الديدان باستخدام 2 ميليلتر من أزيد الصوديوم 1% في المتوسط M9 على [اغروس] لمدة أقل من 5 دقائق قبل التقاط الصور.
- ضع غطاء زلة والتقاط الصور العضلات استخدام أخضر تصفية البروتينات الفلورية (التجارة والنقل) في مجهر فلوري مع جهاز الكاميرا. التقاط الصور العضلات في 24، 48، وح 72 وظيفة المرحلة L4.
- القيام بإعداد تحليل والشكل الصورة مع برامج معالجة صور.
ملاحظة: تعاريف الدرجات ومستويات الضرر العضلات وترد في الشكل 3، التي يتم سرد المعايير على النحو التالي: 3 نقاط لألياف العضلات المفقودين؛ 2 نقطة لألياف العضلات تمزق أو كسر؛ 1 نقطة لألياف العضلات بنت؛ 0 نقطة لألياف العضلات صحية.
6. التحليلات الإحصائية
- إجراء جميع التجارب على الأقل ثلاث مرات بشكل مستقل.
- استخدام الأسلوب كابلان-ماير لتقييم فحوصات بقاء C. ايليجانس ، واستخدم اختبار رتبة سجل في تحليل الاختلافات البقاء على قيد الحياة. تعيين دلالة إحصائية 0.05.
- استخدم اختبار t للطالب لتحليل النتائج الإحصائية لفحوصات سمية سائلة C. ايليجانس لمجموعتين مختلفتين. استخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه في تحليل الاختلافات بين ثلاثة أو أكثر من القيم لمتغير مستقل واحد. تعيين دلالة إحصائية 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عن طريق اتباع البروتوكولات المذكورة أعلاه، فمن السهل للتفريق بين السمية من أربع سلالات أيروموناس . ويرد في الشكل 1مقايسة البقاء على قيد الحياة من C. ايليجانس . كانت معدلات البقاء على قيد الحياة من C. ايليجانس المصابين بالأنواع Aeromonas ، سيظهر في الترتيب من عالية إلى منخفضة: كافياي أ، فيروني أ، هيدروفيلا (أ)، ودهاكينسيس (أ). على الرغم من أن هناك تنوع من حيث السمية بين وداخل الأنواع Aeromonas ، أظهرت معدلات البقاء على قيد الحياة من C. ايليجانس، في المتوسط، معدل الوفيات أعلى بين الديدان المصابين دهاكينسيس أ. ضراوة هيدروفيلا (أ) كانت أدنى من دهاكينسيس أ (ف < 0.01). على النقيض من دهاكينسيس ألف و ألف-هيدروفيلا،لوحظت فيرولينسيس الموهنة بروني (أ) و كافي أ في مقايسة البقاء C. ايليجانس . تنوع معدلات البقاء على قيد الحياة من C. ايليجانس المصابين بأنواع مختلفة من أيروموناس يتسق مع الملاحظات السريرية ل الإصابة أيروموناس 7.
يتم عرض نتائج الفحص سمية سائلة من C. ايليجانس في الشكل 2. مع وقت الإصابة، انخفض عدد الديدان التي نجت كثيرا عندما كانت مصابة C. ايليجانس مع دهاكينسيس أ أو هيدروفيلا (أ). وكان معدل البقاء على قيد الحياة من الديدان المصابين دهاكينسيس (أ) أقل شأنا من أولئك المصابين هيدروفيلا (أ). على النقيض من ذلك، كانت المجموعات المصابة مع بروني (أ) أو (أ) كافي معدلات البقاء على قيد الحياة في كل وقت نقطة بالمقارنة مع دهاكينسيس ألف و ألف-هيدروفيلا. اتجاهات معدلات البقاء على قيد الحياة من C. ايليجانس في مقايسة سمية سائلة يمثلون ضراوة من مختلف الأنواع Aeromonas مماثلة لتلك التي لوحظت في مقايسة البقاء على قيد الحياة.
في مقايسة نخر العضلات C. ايليجانس ، نحن أولاً تصنيف مستويات تلف العضلات وتعيين العشرات وفقا لمستويات المقابلة. وترد التعاريف مستويات الضرر العضلات والنتيجة في الشكل 3. معايير التسجيل لكل مستوى الضرر العضلات كما يلي: 0 نقطة لألياف العضلات صحية؛ 1 نقطة لألياف العضلات بنت؛ 2 نقطة لألياف العضلات تمزق أو كسر؛ 3 نقاط للخسارة من ألياف العضلات. نتائج نخر العضلات C. ايليجانس الاعتداء في أيروموناس المصابة-C. ايليجانس هو المبين في الشكل 4. تفاوتت درجات تلف العضلات فيما بين الأنواع أيروموناس . مستويات العضلات تراوحت في الترتيب من معتدلة إلى شديدة الضرر على النحو التالي: كافي أ، وبروني (أ)، هيدروفيلا (أ)، و دهاكينسيس أ في كل وقت نقطة. على النقيض من هيدروفيلا أ و دهاكينسيس أ، نخر العضلات لم يكن واضحا في الديدان المصابين كافي أ و بروني (أ). وسجلت معظم الديدان المصابين كافي أ و بروني (أ) كنقاط 0. C. ايليجانس المصابين هيدروفيلا (أ) أو دهاكينسيس (أ) عرض العضلات شديدة الضرر. ملاحظة، أظهرت معظم الديدان المصابين دهاكينسيس أ العضلات الضرر تصنيف إيه تو نقطة. وكانت درجة نخر العضلات من C. ايليجانس المصابين دهاكينسيس أ أكثر حدة من حيث نسبة مئوية أعلى من درجات ≥ 2 نقطة مقارنة مع هيدروفيلا (أ). شدة نخر العضلات في الأنواع Aeromonas 4 يرتبط بنتائج فحوصات السمية سائل والبقاء على قيد الحياة.
الأساليب المذكورة أعلاه توفر وسيلة مريحة للتفريق بين الفوعة التنوع داخل الأنواع Aeromonas وفيما بينها. وبالإضافة إلى ذلك، هذا نموذج موثوق بها لدراسة التفاعل بين العوامل الممرضة والمضيفة.
الشكل 1 : منحنيات البقاء على قيد الحياة من C. ايليجانس. يظهر المقايسة بقاء السمية متنوعة من مختلف الأنواع Aeromonas إلى C. ايليجانس (* *: P < 0.01؛ *: P < 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : أن معدل البقاء على قيد الحياة C. ايليجانس من مقايسة سمية سائلة. يظهر الإنزيم سمية سائلة السمية مختلفة لأنواع مختلفة من أيروموناس إلى C. ايليجانس. في (أ) ح 24، (ب) ح 48، و (ج) ح 72 وظيفة العدوى أيروموناس ، C. ايليجانس المصابين دهاكينسيس (أ) بأدنى معدل للبقاء على قيد الحياة. النتيجة تشير إلى أن دهاكينسيس أ- الأنواع C. ايليجانس Aeromonas الأكثر سمية (* * *: P < 0.001؛ * *: ف < 0.01، أشرطة الخطأ: الانحراف المعياري، SD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الدرجات المقابلة للعضلات ونخر في C. ايليجانس الناجمة عن العدوى أيروموناس . المعايير الخاصة بالعضلات ونخر وعشرات المقابلة كما يلي: 3 نقاط لألياف العضلات المفقودين؛ 2 نقطة لألياف العضلات تمزق أو كسر؛ 1 نقطة لألياف العضلات بنت؛ 0 نقطة لألياف العضلات صحية. يتم الإشارة إلى ألياف عضلة مثنية (الأسهم) وتمزق العضلات الألياف (رؤوس) وألياف العضلات المفقودة (نجمة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : عشرات نخر العضلات C. ايليجانس . عشرات نخر العضلات تظهر السمية مختلفة للأنواع المختلفة من أيروموناس إلى C. ايليجانس. في (أ) 24 ح، (ب) ح 48، و (ج) ح 72 وظيفة الإصابة أيروموناس ، وتلف العضلات C. ايليجانس هي الأشد من العدوى مع دهاكينسيس أ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الحل | إعداد |
| المخزن المؤقت للفوسفات | حل ز 119.35 من KH2PO4 وز 21.43 من K2HPO4، في ماء منزوع 1 لتر. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قم بضبط قيمة pH على درجة الحموضة = 6.0 مع كوه. انتظر حتى تبرد بدرجة حرارة الغرفة |
| S القاعدية | حل ز 5.85 كلوريد الصوديوم وز 6 خ2بو4ز 1 ك2هبو4 في 1 لتر مياه. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انتظر حتى تبرد بدرجة حرارة الغرفة. |
| سترات البوتاسيوم م 1 | حل ز 4 acid•H الستريك2س وز 58.7 ثلاثي البوتاسيوم citrate•H2س في 0.2 مل مياه. قم بضبط قيمة pH على درجة الحموضة = 6.0. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انتظر حتى تبرد بدرجة حرارة الغرفة. |
| تتبع حل المعادن | حل ثنائي ز 1.86 يدتا، 0.69 غ فيسو4•7 ح2س، ز 0.2 الحركة2• 4 ح2س، ز 0.29 زنسو4•7 ح2س، ز 0.025 CuSO4• 5 ح2س في ماء منزوع 1 لتر. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انتظر حتى تبرد بدرجة حرارة الغرفة يبقى الحل في الظلام. |
| مرق رطل | حل 10 جرام كلوريد الصوديوم، تريبتوني ز 10، واستخراج الخميرة ز 5 في 1 لتر مياه. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انتظر حتى تبرد بدرجة حرارة الغرفة. |
الجدول 1: إعداد الحل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. ايليجانس ديدان أسطوانية باكتيريفوروس بطبيعة الحال أن مأخذ البكتيريا كغذاء، وقد وضعت حصانة فطرية تعقيداً للبكتريا أثناء عملية تطورية. اثنين من الأجهزة الرئيسية للحفاظ على ودعم الحصانة هي9،البشرة والأمعاء13. البشرة وعصابات من العضلات C. ايليجانس تشبه هياكل الأنسجة اللينة في الثدييات والبشر6. وبسبب هذه الخصائص، C. ايليجانس قابل للتطبيق ككائن نموذج لدراسة الآلية المرضية للإصابة أيروموناس .
هنا، نحن نقدم ثلاث طرق لفحص الإصابة Aeromonas في C. ايليجانس ممثل سمية المتنوعة بين 4 Aeromonas الأنواع وترتبط مع الملاحظة الإكلينيكية7. هذه الأساليب ملاءمة تميز درجات مختلفة من السمية بين الأنواع أيروموناس . باستخدام هذه الأساليب، يمكن دراسة الباحثين فوعة مختلفة الأنواع Aeromonas وآلية الدفاع عن المضيفين على الإصابة أيروموناس .
C. ايليجانس يعمل في هذه الأساليب الثلاثة، ليس فقط مفترس ولكن أيضا كفريسة أيروموناس. إذا لم تكن الديدان في حالة صحية جيدة قبل الاختبار، سوف تكون نتائج التفاعل المضيف الممرض مختلفة. وبالتالي، من المهم أن تكون حذراً جداً عند التعامل مع C. ايليجانس. لتجنب الضرر المفرط لبيض C. ايليجانس في الخطوة المزامنة، يجب التأكد من التقيد بالإفراج عن البيض بشكل مستمر. مرة واحدة معطوبة البيض، عدد تفقيس بيض C. ايليجانس ستنخفض إلى حد كبير. حتى في حالة تلف البيض يفقس بنجاح، من المحتمل أن يكون المشاكل الإنمائية الديدان. ولذلك، أنها حاسمة لإكمال الخطوة 2، 3 ضمن 6 دقيقة بعد الديدان معرضة إلى ناوكل وكوه.
الأساليب الثلاثة المذكورة أعلاه تظهر نتائج متماسكة على السمية Aeromonas إلى C. ايليجانس، بما في ذلك تجربتين مختلفة قياس معدلات البقاء على قيد الحياة C. ايليجانس تحت الإصابة Aeromonas وواحد مراقبة التغيير المورفولوجية للعضلات. فوعة الاختبار باستخدام أساليب مختلفة مصممة قد توفر نتائج متنوعة. على سبيل المثال، قد لاحظ العلماء سابقا نتائج مختلفة في لوحة C. ايليجانس وفحوصات السائل14. في بحثنا، وجدنا أيضا كان هناك التناقض القائم بين هذه الاختبارات اثنين9. ويعتقد أن البيئة الخارجية ستؤثر الفوعة من مسببات المرض، والباحثون بحاجة إلى إيجاد الظروف المثلى لاستكشاف إليه الفوعة. ومن منظور آخر، فإنه يستحق دراسة وفهم الآليات الكامنة في حالة معينة من حالات العدوى.
في هذا العمل، أنشأنا نموذج عدوى في C. ايليجانس لدراسة الفوعة Aeromonas واستجابة المضيف المقابلة بعد الإصابة. ويمكن تطبيق هذه الأساليب الثلاثة لدراسة الأنواع Aeromonas أخرى تتجاوز الأنواع 4 التي تتناولها هذه الدراسة. وبالإضافة إلى ذلك، ستوفر هذه النهج منهاجا لدراسة الآلية الأساسية المسؤولة عن نخر العضلات الناجمة عن العدوى البكتيرية ووضع العلاجات المحتملة لتحسين النتائج السريرية من التهابات حادة الأنسجة اللينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للمساعدة من مرفق الأساسية C. ايليجانس في تايوان والميكروبيولوجيا التشخيصية ويعزل "مضادات الميكروبات المقاومة المختبر من الوطني تشنغ الكونغ المستشفى الجامعي" لتقديم أيروموناس . ونعترف أيضا مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك)، وفي وورمباسي. ونشكر أيضا مور سفانا لتحرير المخطوطة.
وأيد هذه الدراسة جزئيا المنح المقدمة من وزارة العلوم والتكنولوجيا من تايوان (آخر 105-2628-B-006-017-MY3) والمستشفى الوطني لجامعة الكونغ تشنغ (نكوه-10705001) بفضل تشن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | Bacteria incubation |
| K2HPO4 | J.T.Baker | MP021519455 | Culture medium preparation |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-05 | Culture medium preparation |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | MP021914405 | Culture medium preparation |
| NaCl | SIGMA | 31434 | Culture medium preparation |
| MgSO4 | SIGMA | M7506 | Culture medium preparation |
| agar | Difco | 214530 | Culture medium preparation |
| CaCl2 | SIGMA | C1016 | Culture medium preparation |
| cholesterol | SIGMA | C8503 | Culture medium preparation |
| ethanol | SIGMA | 32205 | Culture medium preparation |
| KOH | SIGMA | P5958 | Culture medium preparation |
| 6 cm Petri plate | ALPHA PLUS | 46 | agar plate preparation |
| 96-well plate | FALCON | 353072 | liquid assay |
| bacterial peptone | Affymetrix/USB | AAJ20048P2 | Culture medium preparation |
| yeast extract | SIGMA | 92144 | Culture medium preparation |
| citric acid•H2O | SIGMA | C1909 | Culture medium preparation |
| tri-potassium citrate•H2O | SIGMA | 104956 | Culture medium preparation |
| FudR | SIGMA | 1271008 | Culture medium preparation |
| disodium EDTA | SIGMA | E1644 | Culture medium preparation |
| FeSO4•7 H2O | SIGMA | 215422 | Culture medium preparation |
| MnCl2•4 H2O | SIGMA | 221279 | Culture medium preparation |
| ZnSO4•7 H2O | SIGMA | 204986 | Culture medium preparation |
| CuSO4•5 H2O | SIGMA | C8027 | Culture medium preparation |
| tryptone | SIGMA | 16922 | Culture medium preparation |
| Microscope system | Nikon | Eclipase Ti inverted | microscope imaging |
| Scientific CCD Camera | QImaging | Retiga-2000R Fast 1394 | microscope imaging |
References
- Parker, J. L., Shaw, J. G. Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Biliary tract infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).
- Chuang, H. C., et al. Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia. Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).
- Chen, P. L., et al. A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 7, 2058 (2016).
- Chen, P. L., et al. Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences. PLoS One. 9 (11), 111213 (2014).
- Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila. Frontiers in Microbiology. 7, 1219 (2016).
- Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Immunology. 9, 774 (2018).
- Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens. Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Engelmann, I., Pujol, N. Innate immunity in C. elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).
- Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813 (2012).
