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Immunology and Infection

एक Caenorhabditis एलिगेंस मॉडल में Aeromonas संक्रमण के डाह और रोगजनन का मूल् यांकन

Published: December 20, 2018 doi: 10.3791/58768
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 2,4
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Internal Medicine, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

यहां, हम C. एलिगेंसमें Aeromonas संक्रमण का अध्ययन करने के लिए तीन विभिंन प्रयोगों परिचय । इन सुविधाजनक तरीकों का प्रयोग, यह Aeromonas प्रजातियों के बीच और के भीतर विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए आसान है ।

Abstract

मानव रोगज़नक़ Aeromonas चिकित्सकीय आंत्रशोथ, घाव में संक्रमण, गलाघोंटू, और मूत्र पथ के संक्रमण का कारण दिखाया गया है । अधिकांश मानव रोगों में बैक्टीरिया की चार प्रजातियों के साथ जुड़े होने की सूचना मिली है: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, और Aeromonas caviae। मॉडल जीव Caenorhabditis एलिगेंस एक bacterivore कि एक उत्कृष्ट संक्रमण मॉडल है जिसके द्वारा Aeromonasके जीवाणु रोगजनन अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है । यहां, हम अस्तित्व, तरल विषाक्तता सहित एक सी एलिगेंस मॉडल का उपयोग कर Aeromonas संक्रमण का अध्ययन करने के लिए तीन विभिन्न प्रयोगों परिचय, और मांसपेशियों परिगलन परख. Aeromonas के डाह का निर्धारण तीन विधियों के परिणाम संगत थे. ए dhakensis नैदानिक संक्रमण के कारण 4 प्रमुख Aeromonas प्रजातियों के बीच सबसे विषाक्त होना दिखाया गया था । इन तरीकों के बीच और Aeromonas प्रजातियों के भीतर विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए और Aeromonas संक्रमण के रोगजनन की हमारी समझ में योगदान करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका होना दिखाया जाता है ।

Introduction

मानव रोगज़नक़, Aeromonas, चिकित्सकीय आंत्रशोथ, घाव में संक्रमण, गलाघोंटू, और मूत्र पथ के संक्रमण1,2पैदा करने के लिए दिखाया गया है । सबसे अधिक जुड़े मानव रोगों के चार जीवाणु प्रजातियों के साथ जुड़े होने की सूचना दी गई है: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, और Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. Aeromonas संक्रामक रोगों के बीच, कोमल ऊतक संक्रमण मानव में गंभीर रुग्णता और मृत्यु का कारण बन सकता है । ध्यान दें की, मांसपेशियों परिगलन कोमल ऊतक संक्रमण का सबसे गंभीर रूप है6. अस्तित्व और Caenorhabditis एलिगेंस संक्रमण के बाद की मांसपेशी परिगलन का अवलोकन एक सुविधाजनक तरीका है जिसके द्वारा Aeromonasकी विषाक्तता अटकलें है ।

वैज्ञानिकों ने पहले से ही कई मॉडल जीवों के जीवाणु संक्रमण का अध्ययन विकसित किया है । पिछले अध्ययनों में चूहों, zebrafishes, और सूत्रकृमि का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था रोगजनन और डाह के Aeromonas6,7,8. हर पशु मॉडल अपने ' लाभ और आवेदन किया है । मॉडल जीव, Caenorhabditis एलिगेंस, एक bacterivorous निमेटोड जो foodnaturally के रूप में सालभर बैक्टीरिया है । C. एलिगेंसअपने विकास के पाठ्यक्रम पर बैक्टीरियल संक्रमण के खिलाफ एक जटिल जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित की है । जीवाणु संक्रमण के तनाव के तहत, सी एलिगेंस Aeromonas6,7,9 और अन्य रोगजनकों के जीवाणु रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट संक्रमण मॉडल होने के लिए सिद्ध किया गया है कवक की तरह10 और enterohaemorrhagic ई कोलाई O157: H711। हालांकि, वहां अभी भी कोई प्रकाशन है कि Aeromonasके डाह अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में सी एलिगेंस का उपयोग करने में कार्यप्रणाली पर केंद्रित है ।

यहाँ, हम एक पशु मॉडल के रूप में सी एलिगेंस का उपयोग कर Aeromonas संक्रमण का अध्ययन करने के लिए तीन विभिन्न प्रयोगों का परिचय: जीवन रक्षा के लिए परख, तरल विषाक्तता, और मांसपेशियों परिगलन. इन तरीकों के बीच और Aeromonas प्रजातियों के भीतर विषाक्तता का मूल्यांकन और Aeromonasके रोगजनन की समझ में सुधार करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है ।

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Protocol

1. संस्कृति माध्यम की तैयारी

नोट: समाधान तैयारी के लिए तालिका 1 देखें ।

  1. M9 मध्यम तैयार करने के लिए12, KH के2पीओ4, एनए के ५.६६ जी2HPO4, और NaCl के २.५ ग्राम के ५०० मिलीलीटर में घुल पानी की । 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव कमरे के तापमान ठंडा करने के लिए जब तक प्रतीक्षा करें और फिर पहली बार उपयोग करने से पहले 1 मीटर MgSO4 की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. निमेटोड विकास मध् यम (NGM)12तैयार करने के लिए 3 ग्राम NaCl, २.५ ग्राम बैक्टीरियल peptone, और 20 ग्राम आगर में 1 L के जल को विच्छेदित करें । 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव एक पानी के स्नान में ५५ डिग्री सेल्सियस तक ठंडा जब तक प्रतीक्षा करें और फिर 1 मीटर CaCl2, 1 मीटर MgSO4, 1 मिलीलीटर में 5% से अधिक के 1 मिलीलीटर जोड़ने इथेनॉल में कोलेस्ट्रॉल, और फॉस्फेट बफर के 25 मिलीलीटर । अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए भंवर ।
  3. प्रत्येक 6 सेमी पेट्री डिश में लगभग 5 मिलीलीटर NGM डालो । प्लेट की सतह पर बुलबुला उत्पादन से बचें । 4 डिग्री सेल्सियस पर बचाने के लिए 1 रात और पैकेज के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें छोड़ें । उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को वापस लाओ ।
  4. समृद्ध NGM (ENGM) तैयार करने के लिए, 3 ग्राम NaCl, 5 ग्राम बैक्टीरियल peptone, 1 ग्राम खमीर निकालने, और 30 ग्राम के 1 एल में आगर जल को भंग करने के लिए । 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव एक पानी के स्नान में ५५ ° c करने के लिए ठंडा जब तक रुको, और 1 मीटर CaCl2, 1 मीटर MgSO4, 1 मिलीलीटर की 1 एमएल की एक मिलीलीटर में जोड़ें 5% इथेनॉल में कोलेस्ट्रॉल, और फॉस्फेट के 25 मिलीलीटर बफर । अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए भंवर ।
  5. प्रत्येक 9 सेमी पेट्री डिश में लगभग 10 मिलीलीटर ENGM डालो । प्लेट की सतह पर बुलबुला उत्पादन से बचें । 4 डिग्री सेल्सियस पर बचाने के लिए 1 रात और पैकेज के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें छोड़ें । उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए लाओ ।
  6. एस मध्यम12तैयार करने के लिए, ४० मिलीलीटर एस बेसल, ०.४ मिलीलीटर 1 एम पोटेशियम साइट्रेट, ०.४ मिलीलीटर ट्रेस धातुओं समाधान, ०.१२ मिलीलीटर की 1 मीटर CaCl2, ०.१२ मिलीलीटर की 1 मीटर MgSO4, ४० µ एल के 5% से अधिक कोलेस्ट्रॉल इथेनॉल में और 1 मिलीलीटर 8 मिमी FudR का उपयोग करने से पहले ।

2. C. एलिगेंस6,9,12 का सिंक्रनाइज़ेशन

  1. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ पानी की 10 मिलीलीटर के साथ gravid-वयस्क अवस्था में २,००० कीड़े के बारे में धो लें । बाहर बैक्टीरिया 3x धोने, ट्यूब के तल पर कीड़े रखते हुए ।
  2. ५०० एक्स जी में 1 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक नीचे कीड़े खींचने के लिए । supernatant को निकाल लें, और ३.५ मिलीलीटर पानी में कीड़े रखें ।
  3. ट्यूब में 1 मिलीलीटर NaOCl (10-15%) और ०.५ मिलीलीटर 5 मीटर कोह जोड़ें । कीड़ा शरीर लाइसे करने के लिए < 6 मिनट के लिए झटकों से समान रूप से मिश्रण ।
  4. अंडे के कीड़े से जारी होने के बाद, lysis को रोकने के लिए 10 मिलीलीटर पानी जोड़ें । १,२०० एक्स जी में 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक नीचे अंडे खींचने के लिए और जितना संभव हो उतना supernatant हटा दें । 15 मिलीलीटर M9 के साथ धो लें ।
    नोट: M9 माध्यम की संरचना के लिए चरण १.१ देखें ।
  5. 1 एमएल M9 मीडियम में अंडे रखें । एक रात के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के लिए एक ३.५ सेमी डिश के लिए अंडे परिवहन (के बारे में 12-18 ज) ।
    नोट: मशीन के बाद, अंडे कृमि लार्वा जो पहले लार्वा (L1) चरण के रूप में कहा जाता है के लिए हैच जाएगा ।
  6. M9 मीडियम में L1 वर्म्स के 10 µ l को बाहर पिपेट. कीड़ा संख्या गिनती और M9 माध्यम में L1 कीड़े की एकाग्रता की गणना ।
  7. बीज पर सबसे १०,००० एक 9 सेमी ENGM ई कोलाई OP50 के साथ फैल प्लेट पर एक प्लास्टिक के साथ L1 स्टेज कीड़े की मशीन ।
    1. इस कदम में, फैले ०.५ मिलीलीटर रात भर Luria-Bertani (पौंड) 9 सेमी ENGM प्लेट पर शोरबा के साथ ई. कोलाई OP50 । 16 के लिए ३७ ° c पर थाली मशीन-18 ज
      नोट: संदूषण से बचने के लिए, प्रसार कदम एक लामिना प्रवाह हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
    2. L1 कीड़े बोने से पहले कमरे के तापमान के लिए शांत । बीज पर सबसे १०,००० ENGM प्लेट पर ई. कोलाई OP50 के साथ L1 स्टेज कीड़े की मशीन ।
  8. ४४ ज के लिए 20 ° c पर कीड़े की मशीन या जब तक वे 4वें लार्वा (L4) चरण को विकसित ।
    नोट: ENGM माध्यम की संरचना के लिए चरण १.३ देखें । एक कीड़ा एक सफेद L4 मंच पर शरीर की ओर के बीच में आधा चांद के आकार में बिंदी है ।
  9. निंनलिखित परख में सिंक्रनाइज़ L4 स्टेज कीड़े का प्रयोग करें । Aeromonas dhakensis और एलिगेंस Aeromonasके साथ सी. dhakensis तरल विषाक्तता परख के साथ ग. एलिगेंस अस्तित्व परख में जंगली प्रकार N2 कीड़े का प्रयोग करें । RW1596 वर्म्स का उपयोग करें (myo-3 (st386); stEx30 [myo-3p:: GFP:: myo-3 + rol-6 (su1006)]) में सी. एलिगेंस मांसपेशी परिगलन Aeromonas के साथ dhakensis ।

3. C. एलिगेंस जीवन रक्षा परख के साथ Aeromonas6,9

  1. ई. कोलाई OP50 के साथ फैल ENGM पर L1 कीड़े बोने के दिन पर, चार Aeromonas उपभेदों या ई. कोलाई OP50 और संस्कृति के साथ 2 मिलीलीटर पौंड शोरबा में से प्रत्येक के एक एक कॉलोनी लेने के लिए ३७ ° c पर क्रमशः 16 एच ।
    नोट: संक्रमण से बचने के लिए, यह कदम एक लामिना फ्लो हुड में किया जाना चाहिए । यहां, निंनलिखित जीवाणु उपभेदों इस्तेमाल किया गया: ई. कोलाई OP50, सी. एलिगेंस के सामांय खाद्य स्रोत । a. dhakensis AAK1, पहले पूरी तरह से अनुक्रम रोगजनक नैदानिक ए dhakensis अलग । a. hydrophila a2-066, a. veronii a2-007, और a. caviae a2-9307121 राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय अस्पताल से प्रतिनिधि नैदानिक अलग हैं.
  2. जीवाणु शोरबा के आयुध डिपो६०० अवशोषण को मापने और आयुध डिपो६०० £ शोरबा के साथ = २.० के लिए बैक्टीरियल शोरबा समायोजित करें ।
  3. स्पॉट और जीवाणु शोरबा प्रत्येक 6 सेमी NGM प्लेट के 30 µ एल फैल गया । संस्कृति कमरे के तापमान पर रात भर प्लेटें ।
    नोट: NGM माध्यम की संरचना के लिए चरण १.२ देखें ।
  4. दिन L1 कीड़े L4 मंच को बढ़ने पर, बेतरतीब ढंग से लेने और चार Aeromonas उपभेदों या ई. कोलाई OP50 में से प्रत्येक के साथ एक NGM थाली के लिए ५० कीड़े हस्तांतरण ।
  5. 20 ° c पर NGM प्लेट्स मशीन जब तक परख समाप्त हो गया है ।
  6. बैक्टीरिया के साथ एक नए तैयार NGM प्लेट के लिए सभी जीवित कीड़े स्थानांतरण और पिछले कीड़ा मर चुका है जब तक हर दिन जीवित, मृत, और सेंसर कीड़े की संख्या गिनती ।
    नोट: संक्रमण के रखरखाव के लिए हर दिन एक ताजा तैयार NGM प्लेट के लिए कीड़े हस्तांतरण, भले ही बाँझ कीड़े का उपयोग (जैसे, जीएलपी-4, या FudR के साथ).
  7. दैनिक डेटा गणना के आधार पर अस्तित्व घटता प्लाट ।

4. C. एलिगेंस तरल विषाक्तता Aeromonasके साथ परख7

नोट: संक्रमण से बचने के लिए, कदम एक लामिना प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए ।

  1. ENGM प्लेट पर ई. कोलाई OP50 के साथ फैल L1 कीड़े बोने के बाद दिन, चार Aeromonas उपभेदों और ई. कोलाई OP50 में से प्रत्येक की एक भी कॉलोनी उठाओ, और संस्कृति के साथ 5 मिलीलीटर पौंड शोरबा प्रत्येक के लिए ३७ ° c 16 ज ।
    नोट: प्रोटोकॉल में, निंनलिखित बैक्टीरिया उपभेदों इस्तेमाल किया गया: ई. कोलाई OP50, सी. एलिगेंस के सामांय खाद्य स्रोत । a. dhakensis AAK1, पहले पूरी तरह से अनुक्रम रोगजनक नैदानिक ए dhakensis अलग । a. hydrophila a2-066, a. veronii a2-007, और a. caviae a2-9307121 राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय अस्पताल से प्रतिनिधि नैदानिक अलग हैं.
  2. जीवाणु शोरबा के आयुध डिपो६०० अवशोषण को मापने ।
  3. 15 मिनट के लिए ३,५०० x g पर बैक्टीरियल शोरबा केंद्रापसारक को पौंड शोरबा हटा दें । बैक्टीरिया resuspend और एस मध्यम के साथ६०० = ३.० आयुध डिपो के लिए जीवाणु शोरबा समायोजित करें । एस मध्यम में बैक्टीरियल शोरबा के १९५ µ एल जोड़ें एक ९६-अच्छी तरह से थाली के ंयूनतम 8 कुओं के लिए ।
    नोट: एस माध्यम की संरचना के लिए चरण १.६ देखें ।
  4. M9 माध्यम का उपयोग कर ई. कोलाई OP5 के साथ ENGM प्लेट पर L4 कीड़े से धो लें । µ एल प्रति 5 कीड़े की एकाग्रता के लिए कीड़ा समाधान समायोजित करें और ९६-well थाली के प्रत्येक कुआं के लिए कीड़ा समाधान के 5 µ एल जोड़ें । सुनिश्चित करें कि वहां प्रति अच्छी तरह से लगभग 25 कीड़े हैं ।
  5. 25 डिग्री सेल्सियस पर २०० rpm पर एक शेखर पर ९६ अच्छी तरह से थाली मशीन ।
  6. 24, ४८ के बाद जीवित कीड़े और मृत कीड़े की संख्या की गणना, और ७२ एच. निम्नलिखित सूत्र के साथ एक अच्छी तरह से जीवित रहने की दरों की गणना: (लाइव कीड़े/कुल कीड़े) × १००%.
  7. दैनिक डेटा परिकलन के साथ एक स्कैटर प्लॉट ग्राफ़ आरेखित करना.

5. C. एलिगेंस मांसपेशी परिगलन Aeromonas6 के साथ परख

नोट: संक्रमण से बचने के लिए, इन कदमों को एक लामिना फ्लो हुड में किया जाना चाहिए ।

  1. दिन L1 कीड़े ई. कोलाई OP50 के साथ ENGM प्रसार पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, चार Aeromonas उपभेदों और ई. कोलाई OP50 और संस्कृति के साथ 2 मिलीलीटर पौंड शोरबा प्रत्येक में से प्रत्येक की एक कॉलोनी लेने के लिए ३७ ° c 16 घंटे के लिए
    नोट: यहां, निंनलिखित बैक्टीरिया उपभेदों इस्तेमाल किया गया: ई. कोलाई OP50, सी. एलिगेंस के सामांय खाद्य स्रोत । a. dhakensis AAK1, पहले पूरी तरह से अनुक्रम रोगजनक नैदानिक ए dhakensis अलग । a. hydrophila a2-066, a. veronii a2-007, और a. caviae a2-9307121 राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय अस्पताल से प्रतिनिधि नैदानिक अलग हैं.
  2. जीवाणु शोरबा के आयुध डिपो६०० अवशोषण को मापने और आयुध डिपो को समायोजित६०० = २.० £ शोरबा के साथ । स्पॉट और 6 सेमी NGM प्लेटों पर बैक्टीरियल शोरबा के 30 µ एल फैल गया । संस्कृति कमरे के तापमान पर रात भर प्लेटें ।
  3. दिन L1 कीड़े L4 चरण को बढ़ने पर, चार Aeromonas उपभेदों या ई. कोलाई OP50 में से प्रत्येक के साथ प्रत्येक NGM प्लेट को ५० कीड़े हस्तांतरण । 20 डिग्री सेल्सियस पर NGM प्लेट्स की मशीन । स्थानांतरण कीड़े हर 24 NGM बैक्टीरिया के साथ नए तैयार प्लेटों के लिए एच ।
  4. मांसपेशी छवियों एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ले लो ।
    1. बेतरतीब ढंग से एक स्लाइड पर M9 माध्यम में एक 2% agarose जेल पर 10 कीड़े उठाओ । agarose पर M9 माध्यम में 1% सोडियम azide के 2 µ एल का उपयोग कर कीड़े से कम 5 मिनट के लिए छवियों को लेने से पहले पंगु बना ।
    2. एक कवर पर्ची प्लेस और मांसपेशी एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर छवियों पर कब्जा (GFP) आरोप-युग्मित डिवाइस कैमरा के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर फिल्टर । 24, ४८ पर मांसपेशी छवियों पर कब्जा, और ७२ एच पोस्ट L4 चरण ।
  5. आचरण छवि विश्लेषण और एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ चित्रा तैयारी ।
    नोट: स्कोर की परिभाषा और मांसपेशी क्षति स्तर चित्रा 3में दिखाया गया है, जिसके लिए मानदंड निम्नानुसार सूचीबद्ध हैं: लापता मांसपेशी फाइबर के लिए 3 अंक; उठी या टूटी हुई मांसपेशी फाइबर के लिए 2 अंक; 1 तुला मांसपेशी फाइबर के लिए बिंदु; 0 स्वस्थ मांसपेशी फाइबर के लिए अंक ।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सभी प्रयोग ंयूनतम तीन बार स्वतंत्र रूप से करते हैं ।
  2. सी. एलिगेंस अस्तित्व की परख का आकलन करने के लिए कापलान-Meier विधि का प्रयोग करें, और अस्तित्व के मतभेदों का विश्लेषण करने में लॉग-रैंक परीक्षण का उपयोग करें । ०.०५ पर सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करें ।
  3. दो अलग समूहों के लिए C. एलिगेंस तरल विषाक्तता परख के सांख्यिकीय परिणामों का विश्लेषण करने के लिए छात्र के टी परीक्षण का प्रयोग करें । एक स्वतंत्र चर के लिए तीन या अधिक मानों के बीच अंतर का विश्लेषण करने में एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण का उपयोग करें । ०.०५ पर सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करें ।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके, यह चार Aeromonas उपभेदों से विषाक्तता के बीच अंतर करने के लिए आसान है । सी. एलिगेंस का अस्तित्व परख चित्रा 1में दिखाया गया है । C. एलिगेंस के जीवित रहने की दरें Aeromonas प्रजातियों से संक्रमित हैं, जो उच्च से कम क्रम में दर्शाए गए थे: a. caviae, a. veronii, a. hydrophila, and a. dhakensis. हालांकि वहां के बीच विषाक्तता के मामले में और Aeromonas प्रजातियों के भीतर विविधता है, सी एलिगेंसके जीवित रहने की दर, औसत पर, एक. dhakensisसे संक्रमित कीड़े के बीच उच्चतम मृत्यु दर दिखाया । ए. hydrophila के डाह से हीन था कि ए. dhakensis (p < ०.०१) के. ए. dhakensis और ए. hydrophilaके विपरीत, सी. veronii और ए. caviae दोनों की तनु virulences को सी. एलिगेंस अस्तित्व की परख में मनाया गया. विभिन्न Aeromonas प्रजातियों से संक्रमित सी. एलिगेंस के जीवित रहने की दरों की विविधता Aeromonas संक्रमण के नैदानिक टिप्पणियों के साथ संगत है7.

C. एलिगेंस के तरल विषाक्तता परख के परिणाम चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । संक्रमण के समय के साथ, कीड़े कि बच की संख्या काफी कम हो गई जब सी एलिगेंस या तो एक. dhakensis या ए. hydrophilaसे संक्रमित था । एक. dhakensis से संक्रमित कीड़े के जीवित रहने की दर एक. hydrophilaसे संक्रमित उन लोगों के लिए अवर था । इसके विपरीत, एक. veronii या ए. caviae से संक्रमित समूहों के रूप में एक. dhakensis और ए. hydrophilaकी तुलना में हर समय बिंदु पर उच्च जीवित रहने की दर थी । तरल विषाक्तता में विभिंन Aeromonas प्रजातियों के डाह का प्रतिनिधित्व परख में एलिगेंस के जीवित रहने की दर की प्रवृत्तियों अस्तित्व परख में मनाया उन लोगों के लिए समान हैं ।

C. एलिगेंस मांसपेशी परिगलन परख में, हम पहले मांसपेशियों की क्षति के स्तर और नियत स्कोर इसी स्तर के अनुसार वर्गीकृत । स्कोर की परिभाषा और मांसपेशी क्षति स्तर चित्रा 3में प्रदान की जाती हैं । प्रत्येक मांसपेशी क्षति स्तर के लिए स्कोरिंग मानदंड इस प्रकार है: स्वस्थ मांसपेशी फाइबर के लिए 0 अंक; 1 तुला मांसपेशी फाइबर के लिए बिंदु; उठी या टूटी हुई मांसपेशी फाइबर के लिए 2 अंक; मांसपेशी फाइबर के नुकसान के लिए 3 अंक । Aeromonas संक्रमित-सी. एलिगेंस में सी. एलिगेंस मांसपेशी परिगलन परख के परिणाम चित्रा 4में दिखाया गया है । मांसपेशी क्षति की डिग्री Aeromonas प्रजातियों के बीच विविध । मांसपेशियों की क्षति के स्तर के क्रम में हल्के से गंभीर के रूप में हुई: a. caviae, a. veronii, a. hydrophila, और हर समय बिंदु पर a. dhakensis । ए. hydrophila और ए. dhakensisके साथ इसके विपरीत, मांसपेशियों में परिगलन एक. caviae और ए. veroniiसे संक्रमित कीड़े में स्पष्ट नहीं था । ए. caviae और ए. veronii से संक्रमित कीड़े के अधिकांश 0 अंक के रूप में दर्ज किए गए । C. hydrophila या ए. dhakensis से संक्रमित एलिगेंस गंभीर मांसपेशी क्षति का प्रदर्शन किया । नोट की, एक. dhakensis से संक्रमित कीड़े के अधिकांश ≥ 2 अंक वर्गीकृत मांसपेशियों की क्षति का प्रदर्शन किया । एक. dhakensis से संक्रमित सी. एलिगेंस की मांसपेशी परिगलन की डिग्री एक. hydrophilaके साथ तुलना में स्कोर ≥ 2 अंक के एक उच्च प्रतिशत के मामले में अधिक गंभीर था । 4 Aeromonas प्रजातियों में मांसपेशियों परिगलन की गंभीरता अस्तित्व और तरल विषाक्तता परख से निष्कर्षों के साथ संबंधित ।

ऊपर वर्णित तरीकों के बीच और Aeromonas प्रजातियों के भीतर डाह विविधता अंतर करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करते हैं । इसके अलावा, यह एक विश्वसनीय मॉडल है जिसके द्वारा एक रोगज़नक़ और मेजबान के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए है ।

Figure 1
चित्रा 1 : सी. एलिगेंसके अस्तित्व घटता है । अस्तित्व परख सी. एलिगेंस (* *: p < ०.०१; *: p < ०.०५) को विभिंन Aeromonas प्रजातियों के विभिंन विषाक्तता से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : तरल विषाक्तता परख से सी एलिगेंस के जीवित रहने की दर । तरल विषाक्तता परख सी. एलिगेंसकरने के लिए विभिंन Aeromonas प्रजातियों के विभिंन विषाक्तता से पता चलता है । (क) 24 ज, (ख) ४८ ज, और (ग) ७२ ज पद Aeromonas संक्रमण, सी. dhakensis से संक्रमित एलिगेंस सबसे कम जीवित रहने की दर है । परिणाम पता चलता है कि A. dhakensis सबसे विषैले Aeromonas प्रजाति C. एलिगेंस (* * *: p < ०.००१; * *: p < ०.०१, त्रुटि पट्टियां: मानक विचलन, SD) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : Aeromonas संक्रमण से प्रेरित सी एलिगेंस में पेशी परिगलन के लिए इसी स्कोर । मांसपेशी परिगलन और इसी स्कोर के लिए मानदंड इस प्रकार हैं: लापता मांसपेशी फाइबर के लिए 3 अंक; उठी या टूटी हुई मांसपेशी फाइबर के लिए 2 अंक; 1 तुला मांसपेशी फाइबर के लिए बिंदु; 0 स्वस्थ मांसपेशी फाइबर के लिए अंक । तुला मांसपेशी फाइबर (तीर), उठी मांसपेशी फाइबर (ऐरोहेड), और लापता मांसपेशी फाइबर (स्टार) संकेत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : C. एलिगेंस मांसपेशी परिगलन स्कोर । मांसपेशी परिगलन स्कोर सी. एलिगेंसकरने के लिए विभिंन Aeromonas प्रजातियों के विभिंन विषाक्तता दिखाते हैं । पर (a) 24 ज, (ख) ४८ ज, औ (ग) ७२ ज पद Aeromonas संक्रमण, c. एलिगेंस मांसपेशी क्षति ए. dhakensis के साथ संक्रमण से विच्छेद है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समाधान तैयारी
फॉस्फेट बफर K2HPO4 के KH2PO4 और २१.४३ ग्राम के ११९.३५ g को भंग करें, 1 L ध जल में ।
20 मिनट के लिए १२१ ° c पर आटोक्लेव
पीएच मान को समायोजित करें = ६.० KOH के साथ पीएच ।
कमरे के तापमान को ठंडा तक रुको
एस बसाल भंग ५.८५ g NaCl, 6 ग्राम KH2पो4, र 1 छ K2HPO4 म 1 L त के
20 मिनट के लिए १२१ ° c पर आटोक्लेव ।
कमरे के तापमान को ठंडा जब तक रुको ।
1 M पोटेशियम साइट्रेट भंग 4 जी साइट्रिक एसिड • एच2ओ और ५८.७ g त्रि-पोटेशियम साइट्रेट • एच2हे जल के ०.२ मिलीलीटर में ।
पीएच मान के लिए पीएच = 6.0 समायोजित करें ।
20 मिनट के लिए १२१ ° c पर आटोक्लेव ।
कमरे के तापमान को ठंडा जब तक रुको ।
ट्रेस धातुओं समाधान भंग १.८६ g disodium EDTA, ०.६९ g FeSO4• 7 ज2o, ०.२ g MnCl2• 4 ज2o, ०.२९ g ZnSO4• 7 ज2ओ,
०.०२५ g CuSO4• 5 ज2O म 1 L म जल क/
20 मिनट के लिए १२१ ° c पर आटोक्लेव ।
कमरे के तापमान को ठंडा तक रुको
अंधेरे में समाधान रखें ।
पौंड शोरबा भंग 10 ग्राम NaCl, 10 ग्राम tryptone, और 5 जी खमीर निकालने के 1 एल में पानी की । 20 मिनट के लिए १२१ ° c पर आटोक्लेव ।
कमरे के तापमान को ठंडा जब तक रुको ।

तालिका 1: समाधान तैयारी ।

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Discussion

C. एलिगेंस एक bacterivorous निमेटोड कि स्वाभाविक रूप से भोजन के रूप में बैक्टीरिया सालभर है और अपनी विकासवादी प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया के लिए एक जटिल जंमजात प्रतिरक्षा विकसित की है । दो प्रमुख अंगों को बनाए रखने और प्रतिरक्षा का समर्थन कर रहे है एपिडर्मिस और आंत9,13। एपिडर्मिस और सी एलिगेंस की मांसपेशी के बैंड स्तनधारियों और मनुष्यों में कोमल ऊतक संरचनाओं के समान6। इन विशेषताओं के कारण, C. एलिगेंस Aeromonas संक्रमण के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में लागू है ।

यहाँ, हम 4 Aeromonas प्रजातियों के बीच विविध विषाक्तता के प्रतिनिधि हैं और नैदानिक अवलोकन7के साथ संबंधित हैं कि सी एलिगेंस में Aeromonas संक्रमण की जांच के लिए तीन तरीके पेश करते हैं. इन सुविधाजनक तरीकों Aeromonas प्रजातियों के बीच विषाक्तता के विभिंन डिग्री भेद । इन तरीकों का प्रयोग, शोधकर्ताओं ने विभिंन Aeromonas प्रजातियों के डाह और Aeromonas संक्रमण पर मेजबान के बचाव तंत्र का अध्ययन कर सकते हैं ।

इन तीनों पद्धतियों में सी. एलिगेंस न केवल एक शिकारी के रूप में बल्कि Aeromonasके शिकार के रूप में भी कार्य करती है. यदि कीड़े परीक्षण से पहले स्वस्थ हालत में नहीं हैं, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के परिणाम अलग हो जाएगा । इस प्रकार, C. एलिगेंसहेर-फेर करते समय बहुत सावधान रहना जरूरी है । तुल्यकालन कदम में सी. एलिगेंस के अंडे को अत्यधिक नुकसान से बचने के लिए, लगातार अंडे की रिहाई का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित हो । एक बार अंडों के क्षतिग्रस्त हो जाने से सी. एलिगेंस अंडों की सेने संख्या काफी हद तक कम हो जाएगी. यहां तक कि अगर क्षतिग्रस्त अंडे सफलतापूर्वक हैच, कीड़े विकास की समस्याओं की संभावना है । इसलिए, यह 6 मिनट के भीतर कदम २.३ कीड़े NaOCl और KOH के लिए उजागर कर रहे है के बाद पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

तीन तरीकों से ऊपर वर्णित Aeromonas विषाक्तताओं पर सी एलिगेंसके लिए, दो अलग Aeromonas संक्रमण और एक के तहत सी एलिगेंस के जीवित रहने की दर को मापने के प्रयोग सहित, शो एकजुट परिणाम मांसपेशी के रूपात्मक परिवर्तन देख रहे हैं । विभिंन डिजाइन तरीकों का उपयोग कर डाह परीक्षण विविध परिणाम प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, वैज्ञानिकों ने पहले सी एलिगेंस प्लेट और तरल परख14में विभिंन परिणामों को मनाया । हमारे शोध में, हम भी वहां पाया विसंगति था इन दोनों के बीच मौजूदा9परख । यह माना जाता है कि बाहरी वातावरण रोगज़नक़ के डाह को प्रभावित करेगा, और शोधकर्ताओं डाह तंत्र का पता लगाने के लिए इष्टतम शर्तों को खोजने की जरूरत है । एक और परिप्रेक्ष्य से, यह अध्ययन और संक्रमण की विशिष्ट स्थिति में अंतर्निहित तंत्र को समझने लायक है ।

इस काम में, हम Aeromonas के डाह और संक्रमण के बाद इसी मेजबान प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए सी एलिगेंस में एक संक्रमण मॉडल की स्थापना की । इन तीन विधियों को वर्तमान अध्ययन में संबोधित 4 प्रजातियों से परे अन्य Aeromonas प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इन तरीकों को एक मंच के लिए अंतर्निहित मांसपेशी जीवाणु संक्रमण से प्रेरित परिगलन के लिए जिंमेदार तंत्र का अध्ययन करने और संभावित चिकित्सा गंभीर कोमल ऊतक संक्रमण के नैदानिक परिणामों में सुधार करने के लिए विकसित करने के लिए प्रदान करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम एलिगेंस से सहायता के लिए आभारी है ताइवान में कोर सुविधा और नैदानिक माइक्रोबायोलॉजी और रोगाणुरोधी प्रतिरोध प्रयोगशाला के लिए राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय अस्पताल के Aeromonas प्रदान करने के लिए अलग । हम भी Caenorhabditis आनुवंशिकी केंद्र (CGC), और WormBase स्वीकार करते हैं । हम भी पांडुलिपि के संपादन के लिए सावना मूर धंयवाद ।

यह अध्ययन आंशिक रूप से विज्ञान और ताइवान के प्रौद्योगिकी मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित था (सबसे 105-2628-B-006-017-MY3) और राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय अस्पताल (NCKUH-१०७०५००१) P.L. चेन के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shaker incubator YIH DER LM-570R Bacteria incubation
K2HPO4 J.T.Baker MP021519455 Culture medium preparation 
KH2PO4 J.T.Baker 3246-05 Culture medium preparation 
Na2HPO4 J.T.Baker MP021914405 Culture medium preparation 
NaCl SIGMA 31434 Culture medium preparation 
MgSO4 SIGMA M7506 Culture medium preparation 
agar Difco 214530 Culture medium preparation 
CaCl2 SIGMA C1016 Culture medium preparation 
cholesterol SIGMA C8503 Culture medium preparation 
ethanol SIGMA 32205 Culture medium preparation 
KOH SIGMA P5958 Culture medium preparation 
6 cm Petri plate ALPHA PLUS 46 agar plate preparation
96-well plate FALCON 353072 liquid assay
bacterial peptone Affymetrix/USB AAJ20048P2 Culture medium preparation 
yeast extract SIGMA 92144 Culture medium preparation 
citric acid•H2O SIGMA C1909 Culture medium preparation 
tri-potassium citrate•H2O SIGMA 104956 Culture medium preparation 
FudR  SIGMA 1271008 Culture medium preparation 
disodium EDTA SIGMA E1644 Culture medium preparation 
FeSO4•7 H2O SIGMA 215422 Culture medium preparation 
MnCl2•4 H2O SIGMA 221279 Culture medium preparation 
ZnSO4•7 H2O SIGMA 204986 Culture medium preparation 
CuSO4•5 H2O SIGMA C8027 Culture medium preparation 
tryptone SIGMA 16922 Culture medium preparation 
Microscope system Nikon  Eclipase Ti inverted  microscope imaging
Scientific CCD Camera QImaging  Retiga-2000R Fast 1394  microscope imaging

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४२ Aeromonas dhakensis Aeromonas hydrophila Aeromonas veronii Aeromonas caviae Caenorhabditis एलिगेंस जीवाणु संक्रमण तरल विषाक्तता परख अस्तित्व परख मांसपेशी परिगलन परख ।
एक <em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> मॉडल में <em>Aeromonas</em> संक्रमण के डाह और रोगजनन का मूल् यांकन
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Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., … More

Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model. J. Vis. Exp. (142), e58768, doi:10.3791/58768 (2018).

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