Summary
כאן, אנחנו מציגים 3 ניסויים שונים כדי ללמוד זיהום Aeromonas C. elegans. באמצעות שיטות אלה נוח, קל להעריך את הרעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas .
Abstract
פתוגניות Aeromonas הוכח קלינית לגרום דלקת הקבה והמעים, הפצע, ספטיסמיה דלקות בדרכי השתן. רוב המחלות האנושיות דווחו להיות מזוהה עם ארבעה מינים של חיידקים: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Aeromonas caviae. האורגניזם דגם Caenorhabditis elegans הוא bacterivore זה מספק מודל הידבקות מעולה שבו ללמוד חיידקי בפתוגנזה של Aeromonas. כאן, אנחנו מציגים 3 ניסויים שונים כדי ללמוד זיהום Aeromonas באמצעות מודל של C. elegans , כולל הישרדות, רעילות נוזלי של מבחני נמק שריר. התוצאות של שלוש שיטות לקביעת של התקפה אלימה של Aeromonas היו עקביים. Dhakensis א הוצגה רעיל ביותר בין הגדולות Aeromonas מינים גרימת זיהומים קליניים. שיטות אלה מוצגים להיות דרך נוחה כדי להעריך את הרעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas ולתרום להבנת בפתוגנזה של זיהום Aeromonas .
Introduction
פתוגניות, Aeromonas, הוכח קלינית לגרום דלקת הקבה והמעים, הפצע, ספטיסמיה דלקות בדרכי השתן בזיהומים1,2. ביותר הקשורים מחלות האדם דווחו להיות מזוהה עם ארבעת המינים חיידקי: 2, Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Aeromonas caviae 3 , 4 , 5. בין מחלות זיהומיות Aeromonas , דלקות ברקמות הרכות עלולה לגרום לזיהום חמור בבני אדם. ראוי לציין, נמק שריר היא הצורה החמורה ביותר של זיהום רקמות רכות6. תצפית של הישרדות, נמק שריר של Caenorhabditis elegans לאחר ההדבקה היא שיטה נוחה שלפיו לשער הרעילות של Aeromonas.
מדענים פיתחו כבר אורגניזמים רבים דגם ללמוד זיהומים חיידקיים. במחקרים קודמים, עכברים zebrafishes, נמטודות שימשו כמודלים חיים ללמוד הפתוגנזה של התקפה אלימה של7,6, Aeromonas8. כל המודל החייתי יש שלה "יתרונות ויישומים. האורגניזם מודל, Caenorhabditis elegans, היא תולעים נימיות bacterivorous אילו חיידקים intakes כמו foodnaturally. C. elegansפיתחה מערכת חיסונית מולדת מסובך נגד זיהום חיידקי במהלך האבולוציה שלה. תחת הלחץ של זיהום חיידקי, C. elegans הוכח להיות מודל זיהום מצוינת ללמוד חיידקי בפתוגנזה של Aeromonas6,7,9 , פתוגנים אחרים כמו פטריה10 ו- enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H711. עם זאת, יש עדיין אין פרסום המתמקד המתודולוגיה בשימוש C. elegans כמודל ללימוד של התקפה אלימה של Aeromonas.
. כאן, אנחנו מציגים 3 ניסויים שונים כדי ללמוד Aeromonas זיהום באמצעות C. elegans כמו במודל חיה: מבחני הישרדות, רעילות נוזלי של נמק שריר. שיטות אלה הן דרך נוחה להעריך הרעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas , לשפר את ההבנה של הפתוגנזה של Aeromonas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת המדיום תרבות
הערה: ראה טבלה 1 להכנה פתרון.
- כדי להכין M9 בינוני12, להמיס 1.5 גר'2פו ח'4, g 5.66 של Na-2-HPO-4ו- 2.5 גר' NaCl ב 500 מ"ל מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דק עד מקורר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ של 1 מ' MgSO4 לפני השימוש הראשון.
- כדי להכין נמטודות צמיחה בינוני (NGM)12, להמיס 3g NaCl, peptone חיידקי 2.5 g, ו- 20 גרם אגר ב- 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דק עד מקורר עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 1 מ"ל של 5% כולסטרול אתנול, 25 מ של מאגר פוספט. מערבולת לערבב היטב.
- יוצקים על 5 מ"ל NGM לתוך כל 6 ס מ פטרי. הימנע לייצור בועות על פני השטח של צלחת. להשאיר צלחות בטמפרטורת החדר במשך לילה 1 וחבילת כדי לשמור על 4 מעלות צלזיוס. להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- כדי להכין מועשר NGM ואקלים, להמיס 3g NaCl, 5 g peptone חיידקי, תמצית שמרים 1 g, ו- 30 גרם אגר ב- 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דק עד מקורר עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים, ולהוסיף 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 1 מ"ל של 5% כולסטרול אתנול, 25 מ של מאגר פוספט. מערבולת לערבב היטב.
- יוצקים על 10 מ"ל ENGM לתוך כל 9 ס מ פטרי. הימנע לייצור בועות על פני השטח של צלחת. להשאיר צלחות בטמפרטורת החדר במשך לילה 1 וחבילת כדי לשמור על 4 מעלות צלזיוס. מביאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- כדי להכין S בינוני12, מערבבים 40 מ ל S הבזליים, 0.4 מ ל 1 מ' פוטסיום ציטראט, מעקב מ ל 0.4 מתכות פתרון, 0.12 מ של 1 מ' CaCl2, 0.12 מ של 1 מ' MgSO4, 40 µL של 5% כולסטרול אתנול, 1 מ"ל של 8 מ"מ FudR לפני השימוש.
2. סינכרון של C. elegans6,9,12
- רחץ תולעים כ-2,000 בשלב םיפתתשמ gravid עם 10 מ ל מים יונים סטרילי בשפופרת 15 מ"ל. לשטוף החוצה את החיידקים 3 x, לשמור את התולעים בתחתית הצינורית.
- Centrifuge לדוגמה עבור 1 דקות ב x 500 g כדי להוריד את התולעים. הסר את תגובת שיקוע, ולשמור את התולעים יונים 3.5 מ"ל מים.
- להוסיף 1 mL NaOCl (10-15%) ו- 0.5 מ ל 5 מ' KOH לתוך הצינור. תערובת אחיד ע י ניעור עבור < 6 דקות כדי lyse הגופים תולעת.
- אחרי הביצים משתחררים מן התולעים, מוסיפים יונים 10 מ"ל מים כדי לעצור את פירוק. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב x 1,200 g כדי לנתץ את הביצים ולהסיר את תגובת שיקוע ככל האפשר. לשטוף עם x לפחות 3 בינוני 15 מ"ל M9.
הערה: ראה צעד 1.1 ההרכב של M9 בינוני. - שמור ביצים 1 מ"ל M9 בינוני. תחבורה ביצים מאכל 3.5 ס"מ עבור הדגירה ב- 20 ° C ללילה אחד (כ ח 12-18).
הערה: לאחר הדגירה, הביצים יבקעו לתעל זחל אשר נקרא בשם בשלב הראשון פגית (L1). - פיפטה החוצה µL 10 התולעים L1 M9 בינוני. לספור את התולעת ולחשב שהריכוז של L1 תולעים M9 בינוני.
- זרע לכל היותר 10,000 מודגרות L1 הבמה תולעים עם pipet על צלחת ENGM 9 ס מ, מורחים עם Escherichia coli OP50.
- בשלב זה, התפשטות 0.5 mL תרבותי בין לילה e. coli OP50 עם מרק לוריא-Bertani (LB) על הצלחת ENGM 9 ס מ. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h
הערה: כדי למנוע זיהום, הצעד מתפשטת צריכה להתבצע בתוך תא למינארי. - להתקרר לטמפרטורת החדר לפני זריעה L1 תולעים. זרע לכל היותר 10,000 מודגרות L1 תולעים הבמה בצלחת ENGM עם OP50 e. coli .
- בשלב זה, התפשטות 0.5 mL תרבותי בין לילה e. coli OP50 עם מרק לוריא-Bertani (LB) על הצלחת ENGM 9 ס מ. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h
- דגירה התולעים ב- 20 ° C 44 h או עד שהם גדלים לבמהth פגית (L4) 4.
הערה: ראה שלב 1.3 להרכב ENGM בינוני. תולעת יש נקודה לבנה בצורת חצי ירח-אמצע הגוף בצד בשלב L4. - השתמש L4 מסונכרן על הבמה תולעים את מבחני הבאים. השתמש בסוג הפרוע ש-n2 תולעים וזמינותו להישרדות C. elegans עם Aeromonas dhakensis ואת וזמינותו רעילות נוזלי C. elegans עם Aeromonas dhakensis. השתמש תולעים RW1596 (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) ב- C. elegans נמק שריר וזמינותו עם Aeromonas dhakensis.
3. C. elegans וזמינותו להישרדות עם6, Aeromonas9
- ביום של זריעה L1 תולעים על ENGM התפשטות עם OP50 e. coli , לבחור מושבה בודדת של כל אחד של ארבעה זנים Aeromonas או e. coli OP50 והתרבות עם 2 מ ל ציר LB בהתאמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
הערה: כדי למנוע זיהום, שלב זה צריך להתבצע בתוך תא למינארי. כאן, שימשו את זני חיידקים הבאים: e. coli OP50, המקור אוכל רגיל של C. elegans. Dhakensis א AAK1, לבודד הראשון וסודרו באופן מלא פתוגניים קלינית dhakensis א . א hydrophila A2-066 veronii א A2-007, caviae א A2-9307121 הם מבודד representatively קלינית של בית חולים האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג. - למדוד את ספיגת600 OD מרק חיידקי ולהתאים שהמרק בקטריאלי כדי OD600 = 2.0 עם מרק ליברות.
- לזהות ולהפיץ 30 µL מרק חיידקי שהלוח NGM 6 ס מ. תרבות הלוחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
הערה: ראה שלב 1.2 עבור הרכב NGM בינוני. - ביום שהתולעים L1 לגדול על הבמה L4, באופן אקראי לאסוף ולהעביר תולעים 50 ל צלחת NGM עם אחד של ארבעה זנים Aeromonas או OP50 e. coli .
- דגירה הלוחות NGM ב- 20 ° C עד לסיום וזמינותו.
- העברת כל התולעים חי צלחת NGM החדש מוכן עם חיידקים, לספור המספרים של לחיות, מת, חיישן תולעים כל יום עד התולעת האחרון מת.
הערה: להעביר תולעים צלחת NGM מוכן טרי כל יום לשם קיום זיהום, גם אם באמצעות תולעים סטרילי (לדוגמהglp-4, או עם FudR). - להתוות את עקומות הישרדות מבוסס על חישוב נתונים יומי.
4. C. elegans Assay רעילות נוזלי עם Aeromonas7
הערה: כדי למנוע זיהום, צעדים צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
- יום לאחר זריעה התולעים L1 על הצלחת ENGM פזורים OP50 e. coli , לבחור מושבה בודדת של כל אחד של ארבעה זנים Aeromonas ו- e. coli OP50, והתרבות 5 מ ל ציר ליברות כל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
הערה: בפרוטוקול, זני חיידקים הבאים שימשו: e. coli OP50, המקור אוכל רגיל של C. elegans. Dhakensis א AAK1, לבודד הראשון וסודרו באופן מלא פתוגניים קלינית dhakensis א . א hydrophila A2-066 veronii א A2-007, caviae א A2-9307121 הם מבודד representatively קלינית של בית חולים האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג. - למדוד את ספיגת600 OD ציר חיידקים.
- Centrifuge שהמרק בקטריאלי ב x 3,500 g למשך 15 דקות להסיר שהמרק ליברות. Resuspend החיידק ולהתאים שהמרק בקטריאלי כדי OD600 = 3.0 S בינונית. להוסיף µL 195 מרק חיידקי S בינוני לפחות 8 בארות של צלחת 96-ובכן.
הערה: ראה שלב 1.6 על ההרכב של S בינוני. - לשטוף את התולעים L4 בצלחת ENGM עם e. coli OP5 באמצעות M9 בינוני. להתאים את הפתרון תולעת ריכוז של תולעים 5 לכל µL ולהוסיף 5 µL של הפתרון תולעת מכל קידוח של צלחת 96-ובכן. ודא כי ישנם כ 25 תולעים לכל טוב.
- דגירה על הלוחית 96-ובכן מטרף-200 סל ד ב 25 º C.
- לספור את מספר בשידור חי תולעים, תולעים מתים לאחר 24, 48, 72 ח' חשב שיעורי ההישרדות של כל טוב עם הנוסחה הבאה: (תולעים תולעים בשידור חי/סה כ) × 100%.
- צייר גרף פיזור מגרש עם החישוב נתונים יומי.
5. C. elegans שריר נמק Assay עם Aeromonas6
הערה: כדי למנוע זיהום, שלבים אלה צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
- ביום שהתולעים L1 הם נזרע על ENGM להתפשט עם OP50 e. coli , לבחור מושבה בודדת של כל אחד של ארבעה זנים Aeromonas ו- e. coli OP50 והתרבות עם 2 מ ל LB מרק כל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
הערה: כאן, שימשו את זני חיידקים הבאים: e. coli OP50, המקור אוכל רגיל של C. elegans. Dhakensis א AAK1, לבודד הראשון וסודרו באופן מלא פתוגניים קלינית dhakensis א . א hydrophila A2-066 veronii א A2-007, caviae א A2-9307121 הם מבודד representatively קלינית של בית חולים האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג. - למדוד את ספיגת600 OD ציר חיידקים ולהתאים שהמרק חיידקים כדי OD600 = 2.0 עם מרק ליברות. לזהות ולהפיץ 30 µL מרק חיידקי על צלחות NGM 6 ס מ. תרבות הלוחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- ביום לגדל התולעים L1 לבמה L4, תולעים 50 העברת כל צלחת NGM עם אחד של ארבעה זנים Aeromonas או OP50 e. coli . דגירה הלוחות NGM ב 20 º C. להעביר תולעים כל 24 שעות החדש מוכן NGM צלחות עם חיידקים.
- קח תמונות שריר באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
- נבחר באקראי 10 תולעים על 2% agarose ג'ל מדיום M9 בשקופית. לשתק את התולעים באמצעות 2 µL של אזיד הנתרן 1% במדיום M9 על agarose עבור פחות מ 5 דקות לפני לקיחת תמונות.
- המקום מכסה, ללכוד את התמונות שריר באמצעות ירוקה חלבון פלואורסצנטי (GFP) לסנן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם תשלום מצמידים מכשיר המצלמה. ללכוד את התמונות שריר בגיל 24, 48, 72 h פוסט על הבמה L4.
- התנהגות הכנה לניתוח ודמות תמונה עם תמונה בתוכנת עיבוד.
הערה: ציוני לבין רמות נזק השריר המיובאים והקיימים מוצגות באיור 3, שעבורם הקריטריון מפורטים כדלקמן: 3 נקודות על סיבי השריר חסר; 2 נקודות עבור סיבי שריר קרוע או שבורים; 1 נקודה עבור סיבי השריר מכופף; 0 נקודות עבור סיבי שריר בריא.
6. ניתוחים סטטיסטיים
- לבצע ניסויים כל מינימום של שלוש פעמים באופן עצמאי.
- השתמש בשיטת קפלן-מאייר כדי להעריך את מבחני הישרדות של C. elegans , והשתמש לבדוק את יומן-דרגה ניתוח הישרדות הבדלים. להגדיר מובהקות סטטיסטית 0.05.
- השתמש בשם מבחן t של סטודנט כדי לנתח את התוצאות הסטטיסטיות של מבחני רעילות נוזלי C. elegans עבור שתי הקבוצות השונות. השתמש במבחן חד-כיווני אנובה בניתוח הבדלים בין שלושה ערכים או יותר אחד המשתנה הבלתי תלוי. להגדיר מובהקות סטטיסטית 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפי הפרוטוקולים שתוארו לעיל, קל להבחין בין רעילות של זנים Aeromonas 4. וזמינותו להישרדות של C. elegans מוצג באיור1. שיעורי ההישרדות של C. elegans נגוע Aeromonas מינים, שמוצג צו מגבוה לנמוך היו: א caviae, veronii א, א hydrophila, ו dhakensis א. למרות שיש גיוון מבחינת רעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas , שיעורי ההישרדות של C. elegans, הראה בממוצע, התמותה הגבוהה ביותר בין התולעים נגוע dhakensis א. התקפה אלימה של hydrophila א היה נחות dhakensis א (0.01 < p). בניגוד dhakensis א וא hydrophila,virulences הקלוש של veronii א וגם caviae א נצפתה וזמינותו להישרדות C. elegans . המגוון של שיעורי ההישרדות של C. elegans נגוע מינים שונים של Aeromonas עולה בקנה אחד עם תצפיות קליניות של זיהום Aeromonas 7.
התוצאות של רעילות נוזלי וזמינותו של C. elegans מוצגים באיור2. עם הזמן זיהום, המספרים של תולעים ששרדו ירד באופן משמעותי כאשר C. elegans היה נגוע בווירוס או dhakensis א או א hydrophila. שיעור ההישרדות של תולעים נגוע dhakensis א היה נחות אלה עם hydrophila א. לעומת זאת, הקבוצות נדבק veronii א או א caviae היו שיעורי הישרדות גבוהים יותר בכל נקודה בזמן לעומת dhakensis א ו hydrophila א. המגמות של שיעורי ההישרדות של C. elegans , וזמינותו רעילות נוזלי המייצג את התקפה אלימה של מינים שונים של Aeromonas דומות לאלה הנהוגות וזמינותו להישרדות.
ב- C. elegans נמק שריר וזמינותו, אנו קודם מסווג את הרמות של נזק לשרירים, שהוקצו ציונים בהתאם לרמות המתאימים. ההגדרות של הציון ואת רמות נזק השריר ניתנים באיור3. הקריטריונים הבקיע עבור כל רמת נזק השריר הוא כדלקמן: 0 נקודות עבור סיבי שריר בריא; 1 נקודה עבור סיבי השריר מכופף; 2 נקודות עבור סיבי שריר קרוע או שבורים; 3 נקודות על אובדן של סיבי השריר. התוצאות של C. elegans שריר לנמק assay ב Aeromonas הנגוע -C. elegans מוצג באיור4. מעלות של נזק לשרירים מגוונות בין המינים Aeromonas . הרמות של שריר נזק נע ב סדר בין מתון עד חמור כדלקמן: א caviae, veronii א, א hydrophila, ו dhakensis א בכל נקודה בזמן. בניגוד dhakensis א hydrophila א , נמק שריר לא היה ברור ב- worms נגוע caviae א , א veronii. מרבית התולעים נגוע caviae א ו veronii א נרשמו כ 0 נקודות. C. elegans נדבק hydrophila א או א dhakensis הציג שרירים חמורה נזק. ראוי לציין, רוב התולעים נגוע dhakensis א הפגינו שריר נזק מדורגים ≥2 נקודות. מידת נמק שריר של C. elegans נגוע dhakensis א היתה קשה יותר מבחינת אחוז גבוה יותר של ציונים ≥ 2 נקודות לעומת hydrophila א. חומרת נמק שריר ב מינים Aeromonas בקורלציה עם ממצאי מבחני רעילות הישרדות ונוזלים.
השיטות המתוארות לעיל מציעים דרך נוחה כדי להבדיל גיוון התקפה אלימה בין מיני ותוך מיני Aeromonas . בנוסף, זה מודל אמין שבו את האינטראקציה בין הפתוגן לבין המארח.
איור 1 : עקומות הישרדות של C. elegans. וזמינותו להישרדות מראה את רעילות מגוונות של מינים שונים של Aeromonas C. elegans (* *: P < 0.01; *: P < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : שיעור ההישרדות של C. elegans מ וזמינותו רעילות נוזלי. וזמינותו רעילות נוזלי מראה את רעילות שונות של מינים שונים של Aeromonas C. elegans. (א) 24 שעות ביממה, (B) 48 שעות, ו- (ג) 72 h פוסט Aeromonas זיהום, C. elegans נגוע dhakensis א יש שיעור ההישרדות הנמוך. התוצאה מרמזת כי dhakensis א הוא המין Aeromonas הרעילים ביותר ל- C. elegans (* * *: P < 0.001; * *: P < 0.01, קווי שגיאה: סטיית תקן, SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : התוצאות המתאימות עבור נמק שריר C . elegans הנגרמת על ידי זיהום Aeromonas . הקריטריונים שריר נמק, ציונים המתאים הן כדלקמן: 3 נקודות על סיבי השריר חסר; 2 נקודות עבור סיבי שריר קרוע או שבורים; 1 נקודה עבור סיבי השריר מכופף; 0 נקודות עבור סיבי שריר בריא. סיבי השריר מכופף (חיצים) סיבי שריר קרוע (חץ), סיבי השריר חסרים (סטאר) מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : הציונים נמק שריר C. elegans . התוצאות נמק שריר להראות את רעילות שונות של מינים שונים של Aeromonas C. elegans. (א) 24 שעות ביממה, (B) 48 שעות, ו- (ג) 72 h לכתוב Aeromonas זיהום, הנזק שריר C. elegans הוא יצופה מפני הידבקות עם א dhakensis. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פתרון | הכנה |
| מאגר פוספט | להמיס 119.35 g של KH2PO4 ו- g 21.43 של K2HPO4, יונים 1 ליטר מים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות התאם את ערך ה-pH pH = 6.0 עם קו. המתן עד מקורר לטמפרטורת החדר |
| S הבזליים | להמיס 5.85 g NaCl, 6 g ח'2PO4ו- 1 g K2HPO4 ב- 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. המתן עד מקורר לטמפרטורת החדר. |
| 1 מ' פוטסיום ציטראט | להמיס 4 g acid•H לימון2O ו- 58.7 g tri-אשלגן citrate•H2O ב- 0.2 מ ל מים יונים. התאם את ערך ה-pH pH = 6.0. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. המתן עד מקורר לטמפרטורת החדר. |
| לאתר פתרון מתכות | להמיס ניתרן 1.86 g EDTA, g 0.69 מכל4•7 H2O, 0.2 גרם MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4•7 H2O, 0.025 g CuSO4•5 H2O ביונים 1 ליטר מים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. המתן עד מקורר לטמפרטורת החדר להשאיר את הפתרון באפלה. |
| מרק ליברות | להמיס 10 גרם NaCl טריפטון 10 גרם, 5 גרם תמצית שמרים ב- 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. המתן עד מקורר לטמפרטורת החדר. |
טבלה 1: הכנה פתרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans הוא תולעים נימיות bacterivorous זה טבעי intakes חיידקים כמזון, פיתחה חיסון מולדת מסובך חיידקים במהלך התהליך האבולוציוני שלו. שני האיברים החיוניים לתחזוקה ותמיכה החסינות הן האפידרמיס והמעי9,13. האפידרמיס ואת להקות של שריר של C. elegans דומים המבנים ברקמות הרכות יונקים ו בני6. בשל מאפיינים אלו, C. elegans ישימה כאורגניזם מודל לימוד בפתוגנזה של זיהום Aeromonas .
כאן, אנו מציגים שלוש שיטות לבדיקת זיהום Aeromonas C . elegans, נציג של רעילות מגוונים בין מינים Aeromonas , נמצאים בקורלציה עם תצפיות קליניות7. שיטות אלה נוח להבחין את דרגות שונות של רעילות בין המינים Aeromonas . באמצעות שיטות אלה, חוקרים יכולים ללמוד על התקפה אלימה של מינים שונים של Aeromonas , מנגנון ההגנה של המארחים על זיהום Aeromonas .
בשיטות אלו 3, C. elegans פועל לא רק בתור טורף, אלא גם כמו טרף של Aeromonas. אם התולעים אינן במצב בריא לפני המבחן, התוצאות של פתוגן-פונדקאי אינטראקציה יהיה שונה. לכן, חשוב להיות זהירים כאשר מניפולציה C. elegans. כדי למנוע נזק מופרז הביצים של C. elegans בשלב סינכרון, הקפד להתבונן על שחרורו של ביצים ללא הרף. ברגע הביצים פגומים, הבקיעה מספר ביצים C. elegans יקטן במידה רבה. גם אם שניזוקו בוקעות בהצלחה, התולעים יש סבירות לבעיות התפתחותיות. לכן, חשוב לשלב מלאה 2.3 בתוך 6 דקות לאחר התולעים נחשפים NaOCl ו KOH.
משלוש השיטות שתוארו לעיל להראות תוצאות מלוכדת על רעילות Aeromonas C. elegans, כולל שני ניסויים שונים למדידת שיעורי ההישרדות של C. elegans תחת Aeromonas זיהום ואחד התבוננות שינוי מורפולוגי של השריר. הבדיקה התקפה אלימה באמצעות שיטות שונות מעוצב עשוי לספק תוצאות מגוונות. לדוגמה, מדענים הבחינו בעבר תוצאות שונות בצלחת C. elegans , נוזל מבחני14. במחקר שלנו, מצאנו גם היה הפער הקיים בין אלה שני מבחני9. הוא האמין כי הסביבה החיצונית תשפיע התקפה אלימה של המחלה, החוקרים צריכים למצוא את תנאים אופטימליים כדי לחקור את מנגנון התקפה אלימה. מנקודת מבט אחרת, זה שווה בלימוד והבנה של המנגנונים שבבסיס במצב ספציפי של זיהום.
בעבודה זאת, הקמנו מודל זיהום ב- C. elegans ללמוד על התקפה אלימה של Aeromonas ואת התגובה המארח המתאים לאחר ההדבקה. יכול להיות מיושם אלה שלוש שיטות ללמוד זן Aeromonas מעבר מינים התייחס במחקר הנוכחי. בנוסף, גישות אלה תספק פלטפורמה כדי לחקור את המנגנון הבסיסי אחראי נמק שריר הנגרמת על ידי זיהום חיידקי וכדי לפתח טיפולים פוטנציאליים כדי לשפר את התוצאות הקליניות של זיהומים חמורים רקמות רכות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה על הסיוע המתקן הליבה C. elegans בטייוואן, מיקרוביולוגיה אבחון ומבודד Antimicrobial ההתנגדות מעבדה של הלאומית צ'נג קונג החולים האוניברסיטאי למתן את Aeromonas . אנו להכיר גם מרכז הגנטיקה Caenorhabditis (CGC), את WormBase. אנו מודים גם Savana מור לעריכת כתב היד.
מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענקים של משרד המדע, הטכנולוגיה של טייוואן (105-2628-B-006-017-MY3 ביותר) ומבית החולים האוניברסיטאי קונג צ'אנג (NCKUH-10705001) הלאומי חן פ. ל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | Bacteria incubation |
| K2HPO4 | J.T.Baker | MP021519455 | Culture medium preparation |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-05 | Culture medium preparation |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | MP021914405 | Culture medium preparation |
| NaCl | SIGMA | 31434 | Culture medium preparation |
| MgSO4 | SIGMA | M7506 | Culture medium preparation |
| agar | Difco | 214530 | Culture medium preparation |
| CaCl2 | SIGMA | C1016 | Culture medium preparation |
| cholesterol | SIGMA | C8503 | Culture medium preparation |
| ethanol | SIGMA | 32205 | Culture medium preparation |
| KOH | SIGMA | P5958 | Culture medium preparation |
| 6 cm Petri plate | ALPHA PLUS | 46 | agar plate preparation |
| 96-well plate | FALCON | 353072 | liquid assay |
| bacterial peptone | Affymetrix/USB | AAJ20048P2 | Culture medium preparation |
| yeast extract | SIGMA | 92144 | Culture medium preparation |
| citric acid•H2O | SIGMA | C1909 | Culture medium preparation |
| tri-potassium citrate•H2O | SIGMA | 104956 | Culture medium preparation |
| FudR | SIGMA | 1271008 | Culture medium preparation |
| disodium EDTA | SIGMA | E1644 | Culture medium preparation |
| FeSO4•7 H2O | SIGMA | 215422 | Culture medium preparation |
| MnCl2•4 H2O | SIGMA | 221279 | Culture medium preparation |
| ZnSO4•7 H2O | SIGMA | 204986 | Culture medium preparation |
| CuSO4•5 H2O | SIGMA | C8027 | Culture medium preparation |
| tryptone | SIGMA | 16922 | Culture medium preparation |
| Microscope system | Nikon | Eclipase Ti inverted | microscope imaging |
| Scientific CCD Camera | QImaging | Retiga-2000R Fast 1394 | microscope imaging |
References
- Parker, J. L., Shaw, J. G. Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Biliary tract infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).
- Chuang, H. C., et al. Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia. Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).
- Chen, P. L., et al. A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 7, 2058 (2016).
- Chen, P. L., et al. Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences. PLoS One. 9 (11), 111213 (2014).
- Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila. Frontiers in Microbiology. 7, 1219 (2016).
- Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Immunology. 9, 774 (2018).
- Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens. Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Engelmann, I., Pujol, N. Innate immunity in C. elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).
- Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813 (2012).
