Summary
Hier stellen wir drei verschiedene Experimente zur Aeromonas Infektion in C. Eleganszu studieren. Mit diesen praktischen Methoden, ist es leicht, die Toxizität unter und innerhalb der Aeromonas Arten zu bewerten.
Abstract
Der menschliche Krankheitserreger Aeromonas nachweislich klinisch Gastroenteritis, Wundinfektionen, Sepsis und Infektionen der Harnwege verursachen. Die meisten menschliche Krankheiten gemeldet wurden, vier Arten von Bakterien zugeordnet werden: Aeromonas Dhakensis, Aeromonas Hydrophila, Aeromonas Veroniiund Aeromonas Caviae. Der Modellorganismus Caenorhabditis Elegans ist eine Bacterivore, die eine ausgezeichnete Infektionsmodell durch, um die bakterielle Pathogenese der Aeromonaslernen bietet. Hier stellen wir drei verschiedene Experimente zur Aeromonas Infektion mit C. Elegans -Modell, einschließlich überleben, flüssige Toxizität und Muskel Nekrose Assays zu studieren. Die Ergebnisse der drei Methoden, die Bestimmung der Virulenz der Aeromonas entsprachen. A. Dhakensis zeigte sich der giftigsten unter den 4 wichtigsten Aeromonas Arten klinische Infektionen verursachen werden. Diese Methoden erweisen sich als eine bequeme Möglichkeit zum Bewerten der Toxizität unter und innerhalb der Arten Aeromonas und dazu beitragen, unser Verständnis der Pathogenese der Aeromonas Infektion.
Introduction
Der menschliche Krankheitserreger Aeromonas, nachweislich klinisch Gastroenteritis, Wundinfektionen, Sepsis und Harnwege Infektionen1,2verursachen. Die meisten menschlichen Erkrankungen gemeldet wurden, vier bakteriellen Spezies zugeordnet werden: Aeromonas Dhakensis, Aeromonas Hydrophila, Aeromonas Veroniiund Aeromonas Caviae 2,3 , 4 , 5. unter den Infektionskrankheiten Aeromonas , Weichgewebe Infektionen können schwerer Morbidität und Mortalität beim Menschen auslösen. Muskel Nekrose ist hervorzuheben die schwerste Form von Weichgewebe-Infektion-6. Beobachtung des Überlebens und Muskel Nekrose von Caenorhabditis Elegans nach der Infektion ist eine bequeme Methode, um die Toxizität von Aeromonasspekulieren.
Wissenschaftler haben bereits zahlreiche Modellorganismen um bakterielle Infektionen zu studieren entwickelt. In früheren Studien wurden Mäuse, Zebrafishes und Nematoden Tiermodelle zur Untersuchung der Pathogenese und Virulenz von Aeromonas6,7,8. Jedes Tier-Modell hat seine "Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten. Der Modellorganismus Caenorhabditis Elegansist eine Bacterivorous-Nematode welche Aufnahme-Bakterien als Foodnaturally. C. Eleganshat eine komplizierte angeborene Immunsystem gegen bakterielle Infektion im Laufe seiner Evolution entwickelt. Unter dem Druck der bakteriellen Infektion hat C. Elegans erwiesen eine ausgezeichnete Infektionsmodell, die bakterielle Pathogenese von Aeromonas6,7,9 und anderen Krankheitserregern zu studieren wie Pilz10 und enterohämorrhagische Escherichia coli O157: H711. Allerdings gibt es noch keine Publikation, die auf die Methodik im Umgang mit C. Elegans als Modell für das Studium der Virulenz der Aeromonaskonzentriert.
Hier stellen wir drei verschiedene Experimente zur Untersuchung der Aeromonas Infektion mit C. Elegans als Tiermodell: Assays für überleben, flüssige Toxizität und Muskel Nekrose. Diese Methoden sind eine bequeme Möglichkeit, die Toxizität unter und innerhalb der Arten Aeromonas bewerten und verbessern das Verständnis der Pathogenese der Aeromonas.
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Protocol
1. Vorbereitung des Kulturmediums
Hinweis: Siehe Tabelle 1 für die Vorbereitung der Lösung.
- Um M9 Medium12vorzubereiten, lösen Sie 1,5 g KH2PO4, 5,66 g Na2HPO4und 2,5 g NaCl in 500 mL entionisiertem Wasser auf. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. warten, bis auf Raumtemperatur abgekühlt und dann hinzufügen 0,5 mL 1 M MgSO4 vor dem ersten Gebrauch.
- Lösen sich um Nematoden Wachstum Medium (NGM)12vorzubereiten, 3 g NaCl, bakterielle Pepton 2,5 g und 20 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. warten, bis zu 55 ° C im Wasserbad abgekühlt und dann fügen Sie 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 5 % Cholesterin in Ethanol und 25 mL Phosphatpuffer. Wirbel um gut zu mischen.
- Gießen Sie etwa 5 mL NGM in je 6 cm Petrischale. Blase-Produktion auf der Oberfläche der Platte zu vermeiden. Lassen Sie Platten bei Raumtemperatur für 1 Nacht und Paket, sparen bei 4 ° C. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen.
- Um angereichertes NGM (ENGM) vorzubereiten, lösen Sie bakterielle Pepton 5 g, 3 g NaCl, 1 g Hefeextrakt und 30 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. warten, bis zu 55 ° C im Wasserbad abgekühlt, und fügen Sie 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 5 % Cholesterin in Ethanol und 25 mL Phosphatpuffer. Wirbel um gut zu mischen.
- Gießen Sie etwa 10 mL ENGM in je 9 cm Petrischale. Blase-Produktion auf der Oberfläche der Platte zu vermeiden. Lassen Sie Platten bei Raumtemperatur für 1 Nacht und Paket, sparen bei 4 ° C. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen.
- S mittlerer12vorbereiten, mischen Sie 40 mL S Basal, 0,4 mL 1 M Kalium Citrat, Metalle 0,4 mL Trace Lösung, 0,12 mL 1 M CaCl2, 0,12 mL 1 M MgSO4, 40 µL 5 % Cholesterin in Ethanol und 1 mL 8 mM FudR vor Gebrauch.
(2) Synchronisierung von C. Elegans6,9,12
- Waschen Sie etwa 2.000 Würmer in der trächtigen Erwachsenen-Bühne mit 10 mL sterile deionisiertes Wasser in einer 15 mL Tube. Waschen Sie die Bakterien 3 x, die Würmer an der Unterseite des Rohres zu halten.
- Zentrifugieren der Probe 1 min. bei 500 X g nach unten die Würmer ziehen. Entfernen Sie den Überstand zu, und halten Sie die Würmer in 3,5 mL entionisiertem Wasser.
- Fügen Sie 1 mL NaOCl (10 – 15 %) und 0,5 mL 5 M KOH in die Röhre. Mischung gleichmäßig durch Schütteln für < 6 min um die Wurm-Körper zu lösen.
- Nachdem die Eier von den Würmern freigesetzt werden, fügen Sie 10 mL entionisiertem Wasser um die Zerstörung zu stoppen. Zentrifuge für 1 min bei 1.200 X g herunterziehen der Eier und den überstand so weit wie möglich zu entfernen. Waschen Sie mit mittlerer mindestens 3 X 15 mL M9.
Hinweis: Siehe Schritt 1.1 für die Zusammensetzung der M9 Medium. - Halten Sie die Eier in 1 mL M9 Medium. Eier in eine 3,5 cm Schale für die Inkubation bei 20 ° C für eine Nacht (ca. 12 – 18 h) zu transportieren.
Hinweis: Nach der Inkubation schlüpfen die Eier um Larven Wurm, die als erste Stufe der Larve (L1) genannt wird. - Pipette, 10 µL L1 Würmer in M9 Medium. Die Wurm-Anzahl und berechnen Sie die Konzentration der L1 in M9 Medium Würmer.
- Samen höchstens 10.000 inkubiert L1 Stadium Würmer mit einem Pipettieren auf einem 9 cm ENGM Teller mit Escherichia coli OP50 zu verbreiten.
- In diesem Schritt kultiviert Ausbreitung 0,5 mL über Nacht E. Coli OP50 mit Luria-Bertani (LB) Brühe auf dem Teller 9 cm ENGM. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 – 18 h
Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollte die Verbreitung Schritt in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. - Vor der Aussaat L1 Würmer auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Samen höchstens 10.000 inkubiert L1 Stadium Würmer auf dem ENGM Teller mit E. Coli OP50.
- In diesem Schritt kultiviert Ausbreitung 0,5 mL über Nacht E. Coli OP50 mit Luria-Bertani (LB) Brühe auf dem Teller 9 cm ENGM. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 – 18 h
- Inkubieren Sie die Würmer bei 20 ° C für 44 h oder bis sie auf die 4th (L4) Larvenstadium wachsen.
Hinweis: Siehe Punkt 1.3 für die Zusammensetzung des Mediums ENGM. Ein Wurm ist einen weißen Punkt in Halbmond-Form in der Mitte der Körperseite in der L4-Stadium. - Verwenden Sie die synchronisierten L4 Stadium in den folgenden Tests Würmer. Verwendung Wildtyp N2 Würmer in C. Elegans überleben Assay mit Aeromonas Dhakensis und C. Elegans flüssige Toxizität Assay mit Aeromonas Dhakensis. Verwenden Sie RW1596 Würmer (myo-3(st386); stEx30 [Myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) in C. Elegans Muskel Nekrose Assays mit Aeromonas Dhakensis.
3. C. Elegans überleben Assay mit Aeromonas6,9
- Am Tag der Aussaat L1 Würmer auf die Ausbringung mit E. Coli OP50 ENGM wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder der vier Stämme von Aeromonas oder E. Coli OP50 und Kultur mit 2 mL LB Brühe bzw. bei 37 ° C 16 h.
Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollte dieser Schritt in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden. Hier die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. Coli OP50, die normalen Nahrungsquelle von C. Elegans. A. Dhakensis AAK1, der ersten vollständig sequenziert pathogenen klinische A. Dhakensis isolieren. A. Hydrophila A2-066, A. Veronii A2-007 und A. Caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinischen Isolaten von National Cheng Kung University Hospital. - Messen die OD600 Extinktion der bakteriellen Brühe und passen Sie die bakterielle Brühe auf OD600 = 2,0 mit LB Brühe.
- Vor Ort und 30 µL bakterielle Brühe jeder 6 cm NGM Platte zu verbreiten. Die Platten bei Raumtemperatur über Nacht Kultur.
Hinweis: Siehe Schritt 1.2 für die Zusammensetzung der NGM Medium. - Am Tag wachsen die L1-Würmer auf die L4-Bühne, nach dem Zufallsprinzip wählen und auf eine NGM-Platte mit jedem der vier Stämme von Aeromonas oder E. Coli OP50 50 Würmer übertragen.
- Inkubieren Sie die NGM-Platten bei 20 ° C, bis der Test abgeschlossen ist.
- Übertragen Sie die lebenden Würmer auf einen neu vorzubereitenden NGM Teller mit Sensor Würmer, Bakterien und Count die Anzahl der Leben, tot, jeden Tag, bis der letzte Wurm tot ist.
Hinweis: Übertragen Würmer auf einen frisch zubereiteten NGM Teller jeden Tag für die Aufrechterhaltung der Infektion, auch wenn sterile Würmer verwenden (z.B.Glp-4, oder mit FudR). - Basierend auf den täglichen Datenberechnung Überleben-Kurven Plotten.
4. C. Elegans flüssige Toxizität Assay mit Aeromonas7
Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollten Schritte in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden.
- Am Tag nach der Aussaat die L1-Würmer auf dem ENGM Teller verteilen mit E. Coli OP50, wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder der vier Stämme von Aeromonas und E. Coli OP50 und Kultur mit 5 mL LB Brühe bei 37 ° C 16 h.
Hinweis: In das Protokoll die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. Coli OP50, die normalen Nahrungsquelle von C. Elegans. A. Dhakensis AAK1, der ersten vollständig sequenziert pathogenen klinische A. Dhakensis isolieren. A. Hydrophila A2-066, A. Veronii A2-007 und A. Caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinischen Isolaten von National Cheng Kung University Hospital. - Messen Sie die OD600 Extinktion der Bakterien-Brühe.
- Zentrifugieren Sie die bakterielle Brühe bei 3.500 X g für 15 min, die LB-Brühe zu entfernen. Die Bakterien aufzuwirbeln und passen Sie die bakterielle Brühe auf OD600 = 3,0 S Medium. Mindestens 8 Brunnen einer 96-Well-Platte 195 µL bakterielle Brühe in S Medium hinzufügen.
Hinweis: Siehe Schritt 1.6 für die Zusammensetzung des S Medium. - Die L4-Würmer auf dem ENGM Teller mit E. Coli OP5 mit M9 Medium abwaschen. Passen Sie die Wurm-Lösung zu einer Konzentration von 5 Würmer pro Mikroliter und geben Sie 5 µL der Wurm Lösung in jede der 96-Well-Platte. Sicherstellen Sie, dass es etwa 25 Würmer pro Bohrloch gibt.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Platte auf einen Shaker bei 200 u/min bei 25 ° c
- Die Anzahl der Leben Würmer und toten Würmer nach 24, 48 und 72 h die Überlebensraten von jedem Bohrloch mit folgender Formel berechnen: (Live Würmer/Total Würmer) × 100 %.
- Zeichnen Sie ein Scatter Plot Diagramm mit der täglichen Datenberechnung.
5. C. Elegans Muskel Nekrose Assay mit Aeromonas6
Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollten diese Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
- Am Tag sind die L1-Würmer auf den ENGM verbreiten mit E. Coli OP50 ausgesät, wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder der vier Stämme von Aeromonas und E. Coli OP50 und Kultur mit 2 mL LB Brühe bei 37 ° C 16 h.
Hinweis: Hier die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. Coli OP50, die normalen Nahrungsquelle von C. Elegans. A. Dhakensis AAK1, der ersten vollständig sequenziert pathogenen klinische A. Dhakensis isolieren. A. Hydrophila A2-066, A. Veronii A2-007 und A. Caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinischen Isolaten von National Cheng Kung University Hospital. - Messen die OD600 Extinktion der Bakterien Brühe und passen Sie die Bakterien Brühe auf OD600 = 2,0 mit LB Brühe. Vor Ort und 30 µL bakterielle Brühe auf 6 cm NGM Platten zu verbreiten. Die Platten bei Raumtemperatur über Nacht Kultur.
- Am Tag wachsen die L1-Würmer auf die L4-Bühne, Transfer 50 Würmer auf jede NGM-Platte mit jedem der vier Stämme von Aeromonas oder E. Coli OP50. Die NGM-Platten bei 20 ° c inkubieren Übertragen Sie Würmer alle 24 h neu vorzubereitenden NGM-Platten mit Bakterien.
- Muskel-Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop zu nehmen.
- Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 10 Würmer auf eine 2 % Agarose-Gel in M9 Medium auf einer Folie aus. Die Würmer mit 2 µL 1 % Natriumazid in M9 Medium auf Agarose für weniger als 5 min vor der Einnahme von Bildern zu lähmen.
- Legen Sie ein Deckglas und Aufnahmen mit einem grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Filtern auf dem Fluoreszenz-Mikroskop mit – Coupled Ladegerät Kamera Muskel. Die Muskel-Aufnahmen bei 24, 48 und 72 h nach der L4-Bühne.
- Führen Sie Bild-Analyse und Abbildung Vorbereitung mit Bildverarbeitungs-Software.
Hinweis: Die Definitionen der Partituren und die Muskel-Schadenshöhe sind in Abbildung 3, für die aufgeführten Kriterien wie folgt dargestellt: 3 Punkte für fehlende Muskelfasern; 2 Punkte für gerissene oder gebrochene Muskelfasern; 1 Punkt für gebogene Muskelfasern; 0 Punkte für gesunden Muskelfasern.
6. statistische Analysen
- Durchführen Sie selbstständig alle Experimente mindestens drei Mal.
- Verwenden Sie die Kaplan-Meier-Methode, um die C. Elegans überleben Assays zu beurteilen, und verwenden Sie die Log-Rank-Test überleben Unterschiede zu analysieren. Statistischen Signifikanz auf 0,05 festgelegt.
- Verwenden Sie Studenten t-Test, um die statistischen Ergebnisse von C. Elegans flüssige Toxizität Assays für die beiden unterschiedlichen Gruppen zu analysieren. One-Way ANOVA-Test bei der Analyse der Unterschiede zwischen den drei oder mehrere Werte für eine unabhängige Variable zu verwenden. Statistischen Signifikanz auf 0,05 festgelegt.
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Representative Results
Folgen Sie den oben beschriebenen Protokolle, ist es leicht zu unterscheiden, die Toxizitäten von den vier Aeromonas Strapazen. Die überleben-Assay von C. Elegans ist in Abbildung 1dargestellt. Die Überlebensraten von C. Elegans mit Aeromonas Arten, im Auftrag von hoch zu niedrig angezeigt infiziert waren: A. Caviae, A. Veronii, A. Hydrophila und A. Dhakensis. Zwar gibt es Vielfalt in Bezug auf Toxizität unter und innerhalb der Arten Aeromonas , zeigte die Überlebensraten von C. Elegans, durchschnittlich höchste Sterblichkeit unter den Würmern infiziert mit A. Dhakensis. Die Virulenz von A. Hydrophila war schlechter als die von A. Dhakensis (p < 0,01). Im Gegensatz zu A. Dhakensis und A. Hydrophilawurden die abgeschwächte Virulences A. Veronii und A. Caviae C. Elegans überleben Assay beobachtet. Die Vielfalt der Überlebensraten von C. Elegans mit Aeromonas Arten infiziert steht im Einklang mit klinischen Beobachtungen von Aeromonas Infektion7.
Die Ergebnisse des flüssigen Toxizität Assays von C. Elegans sind in Abbildung 2dargestellt. Mit der Infektion zurückgegangen die Zahl der Würmer, die überlebt deutlich, wenn C. Elegans mit A. Dhakensis oder A. Hydrophilainfiziert war. Die Überlebensrate von den Würmern infiziert mit A. Dhakensis war A. Hydrophila-infizierten unterlegen. Im Gegensatz dazu hatten die Gruppen mit A. Veronii oder A. Caviae infiziert höhere Überlebensraten zu jedem Zeitpunkt im Vergleich zu A. Dhakensis und A. Hydrophila. Die Trends der Überlebensraten von C. Elegans in der flüssigen Toxizität Assay repräsentieren die Virulenz von Arten Aeromonas ähneln denen im Survival Test beobachtet.
In C. Elegans Muskel Nekrose Assay wir zuerst klassifiziert die Ebenen von Muskelschäden und Noten nach den entsprechenden Ebenen zugeordnet. Die Definitionen der Partitur und die Muskel-Schadenshöhe sind in Abbildung 3zur Verfügung gestellt. Die Bewertungskriterien für jeden Muskel Schadenshöhe ist wie folgt: 0 Punkte für gesunden Muskelfasern; 1 Punkt für gebogene Muskelfasern; 2 Punkte für gerissene oder gebrochene Muskelfasern; 3 Punkte für den Verlust der Muskelfasern. Die Ergebnisse von C. Elegans Muskel Nekrose assay in Aeromonas infizierten -C. Elegans in Abbildung 4dargestellt ist. Der Grad der Schädigung der Muskulatur variiert zwischen den Arten Aeromonas . Die Ebenen des Muskels Schaden Fernkampf in Auftrag von mild bis schwer wie folgt: A. Caviae, A. Veronii, A. Hydrophila und A. Dhakensis zu jedem Zeitpunkt. Im Gegensatz zu A. Hydrophila und A. Dhakensiswar Muskel Nekrose nicht offensichtlich in Würmern infiziert mit A. Caviae und A. Veronii. Die meisten von den Würmern infiziert mit A. Caviae und A. Veronii wurden als 0 Punkte erfasst. C. Elegans infiziert mit A. Hydrophila oder A. Dhakensis ausgestellt schweren Muskelschäden. Der Hinweis die meisten von den Würmern infiziert mit A. Dhakensis demonstriert Muskel benotet ≥2 Schadenspunkte. Der Grad der Muskel Nekrose von C. Elegans mit A. Dhakensis infiziert war schwerer im Hinblick auf einen höheren Prozentsatz von Partituren ≥ 2 Punkte im Vergleich mit A. Hydrophila. Der Schweregrad der Muskel Nekrose in den 4 Arten Aeromonas korreliert mit den Ergebnissen aus der Überlebens- und Flüssigkeit Toxizität Assays.
Die oben beschriebenen Methoden bieten eine bequeme Möglichkeit, Virulenz Vielfalt zwischen und innerhalb der Aeromonas Arten zu unterscheiden. Darüber hinaus handelt es sich um ein zuverlässiges Modell durch, um die Interaktion zwischen Erreger und Wirt zu untersuchen.
Abbildung 1 : Das Survival-Kurven von C. Elegans. Der Survival-Test zeigt die vielfältigen Toxizitäten verschiedener Arten Aeromonas , C. Elegans (**: P < 0,01; *: P < 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Die Überlebensrate von C. Elegans aus der flüssigen Toxizität Test. Die flüssigen Toxizität Assay zeigt die verschiedenen Toxizitäten verschiedener Arten Aeromonas C. Elegans. Bei (A) 24 h (B) 48 h, und (C) 72 h post Aeromonas Infektion, C. Elegans mit A. Dhakensis infiziert hat die niedrigste Überlebensrate. Das Ergebnis legt nahe, dass A. Dhakensis die giftigsten Arten Aeromonas C. Elegans (***: P < 0,001; **: P < 0,01, Fehlerbalken: Standardabweichung, SD). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Die entsprechenden Noten für Muskel Nekrose in C. Elegans induziert durch Aeromonas Infektion. Die Kriterien für die Muskel Nekrose und entsprechenden Partituren sind wie folgt: 3 Punkte für fehlende Muskelfasern; 2 Punkte für gerissene oder gebrochene Muskelfasern; 1 Punkt für gebogene Muskelfasern; 0 Punkte für gesunden Muskelfasern. Gebogene Muskelfasern (Pfeile), gerissenen Muskelfasern (Pfeilspitzen) und fehlende Muskelfasern (Stern) sind angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : C. Elegans Muskel Nekrose Partituren. Der Muskel Nekrose Resultate zeigen die verschiedenen Toxizitäten verschiedener Arten Aeromonas C. Elegans. Bei (A), 24 h, (B) 48 h, und (C) 72 h post Aeromonas Infektion, die C. Elegans Muskelschäden ist die schwerste vor Ansteckung mit A. Dhakensis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Lösung | Vorbereitung |
| Phosphatpuffer | 119,35 g KH2PO4 und 21,43 g K2HPO4, in 1 L entionisiertem Wasser auflösen. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. Stellen Sie den pH-Wert auf pH = 6,0 mit KOH. Warten Sie, bis auf Raumtemperatur abgekühlt |
| S Basal | 5,85 g NaCl, 6 g KH2PO4und 1 g K2HPO4 in 1 L entionisiertem Wasser auflösen. Autoklaven bei 121 ° C für 20 Minuten. Warten Sie, bis auf Raumtemperatur abgekühlt. |
| Kalium Citrat 1 M | 4 g Zitronensäure Acid•H2O und 58,7 g Tri-Kalium Citrate•H2O in 0,2 mL entionisiertem Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf pH = 6,0. Autoklaven bei 121 ° C für 20 Minuten. Warten Sie, bis auf Raumtemperatur abgekühlt. |
| Spur Metalle Lösung | Auflösen von 1,86 g Binatrium-EDTA, 0,69 g FeSO4•7 H2O, 0,2 g MnCl2•4 H2O, 0,29 g ZnSO4•7 H2O, 0,025 g CuSO4•5 H2O in 1 L deionisiertes Wasser. Autoklaven bei 121 ° C für 20 Minuten. Warten Sie, bis auf Raumtemperatur abgekühlt Halten Sie die Lösung in der Dunkelheit. |
| LB-Bouillon | 10 g NaCl, Tryptone 10 g und 5 g Hefe-Extrakt in 1 L entionisiertem Wasser auflösen. Autoklaven bei 121 ° C für 20 Minuten. Warten Sie, bis auf Raumtemperatur abgekühlt. |
Tabelle 1: Vorbereitung der Lösung.
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Discussion
C. Elegans ist das natürlich eine Bacterivorous Nematode Zufuhr Bakterien als Nahrung und hat eine komplizierte angeborene Immunität gegen Bakterien während seiner evolutionären Prozess entwickelt. Zwei der wichtigsten Organe Erhaltung und Unterstützung der Immunität sind die Epidermis und Darm9,13. Die Epidermis und Bands des Muskels von C. Elegans ähneln die Weichgewebe Strukturen in Säugetieren und beim Menschen6. Aufgrund dieser Eigenschaften gilt C. Elegans als Modellorganismus zur Erforschung der Pathogenese der Aeromonas Infektion.
Hier stellen wir drei Methoden für die Prüfung von Aeromonas Infektion in C. Elegans , die stehen stellvertretend für die unterschiedlichen Toxizität unter 4 Arten Aeromonas und korrelieren, mit klinischer Beobachtung7. Diese bequemen Methoden unterscheiden die verschiedenen Grade der Toxizität unter Gattung Aeromonas . Mit diesen Methoden können Forscher die Virulenz von Arten Aeromonas und der verteidigenden Mechanismus der Gastgeber auf Aeromonas Infektion untersuchen.
In diesen drei Methoden fungiert C. Elegans nicht nur als ein Raubtier, sondern auch als Beute von Aeromonas. Wenn die Würmer nicht in gesundem Zustand vor dem Test sind, werden die Ergebnisse der Wirt-Pathogen Interaktion unterscheiden. Daher ist es wichtig, sehr vorsichtig sein bei C. Eleganszu manipulieren. Um übermäßige Beschädigung der Eier von C. Elegans in der Synchronisierung Schritt zu vermeiden, achten Sie darauf, die Freisetzung von Eizellen kontinuierlich zu beobachten. Sobald die Eier beschädigt sind, wird die Schraffur Zahl von C. Elegans Eier weitgehend abnehmen. Auch wenn die beschädigten Eier erfolgreich auszubrüten, dürften die Würmer Entwicklungs-Probleme haben. Daher ist es entscheidend für die vollständige Schritt 2.3 innerhalb von 6 Minuten, nachdem die Würmer NaOCl und KOH ausgesetzt sind.
Die drei oben beschriebenen Methoden zeigen zusammenhängende Ergebnisse auf die Aeromonas Toxizitäten, C. Elegans, einschließlich zwei verschiedene Experimente messen die Überlebensraten von C. Elegans unter Aeromonas Infektion und einer beobachten die morphologische Veränderung des Muskels. Die Virulenz-Test mit verschiedenen gestalteten Methoden kann unterschiedliche Ergebnisse liefern. Zum Beispiel Wissenschaftler haben unterschiedliche Ergebnisse in C. Elegans Platte vorher beobachtet und Flüssigkeit assays14. In unseren Recherchen fanden wir auch gab Diskrepanz zwischen diesen beiden Assays9. Es wird vermutet, dass die äußere Umgebung die Virulenz des Erregers beeinflussen, und die Forscher benötigen, finden die optimalen Bedingungen um die Virulenz-Mechanismus zu erkunden. Aus einer anderen Perspektive lohnt es sich Studium und das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen in einem bestimmten Zustand der Infektion.
In dieser Arbeit haben wir eine Infektionsmodell in C. Elegans , die Virulenz der Aeromonas und die entsprechenden Host-Reaktion nach der Infektion zu studieren. Diese drei Methoden könnte angewendet werden, um den anderen Aeromonas Arten jenseits der 4 Arten, die in der vorliegenden Studie adressiert zu studieren. Darüber hinaus bieten diese Ansätze eine Plattform, den zugrunde liegende Mechanismus verantwortlich für Muskel Nekrose induziert durch bakterielle Infektion zu untersuchen und mögliche Therapien zur Verbesserung der klinischen Ergebnisse von schweren Weichteilinfektionen entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Unterstützung von C. Elegans zentrale Einrichtung in Taiwan und der diagnostischen Mikrobiologie und antimikrobielle Resistenz Labor der National Cheng Kung University Hospital für die Bereitstellung der Aeromonas isoliert. Wir anerkennen auch die Caenorhabditis Genetik Center (CGC) und die WormBase. Wir danken auch Savana Moore für das Manuskript zu bearbeiten.
Diese Studie wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan (meist 105-2628-B-006-017-MY3) und der National Cheng Kung University Hospital (NCKUH-10705001), p.l. Chen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | Bacteria incubation |
| K2HPO4 | J.T.Baker | MP021519455 | Culture medium preparation |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-05 | Culture medium preparation |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | MP021914405 | Culture medium preparation |
| NaCl | SIGMA | 31434 | Culture medium preparation |
| MgSO4 | SIGMA | M7506 | Culture medium preparation |
| agar | Difco | 214530 | Culture medium preparation |
| CaCl2 | SIGMA | C1016 | Culture medium preparation |
| cholesterol | SIGMA | C8503 | Culture medium preparation |
| ethanol | SIGMA | 32205 | Culture medium preparation |
| KOH | SIGMA | P5958 | Culture medium preparation |
| 6 cm Petri plate | ALPHA PLUS | 46 | agar plate preparation |
| 96-well plate | FALCON | 353072 | liquid assay |
| bacterial peptone | Affymetrix/USB | AAJ20048P2 | Culture medium preparation |
| yeast extract | SIGMA | 92144 | Culture medium preparation |
| citric acid•H2O | SIGMA | C1909 | Culture medium preparation |
| tri-potassium citrate•H2O | SIGMA | 104956 | Culture medium preparation |
| FudR | SIGMA | 1271008 | Culture medium preparation |
| disodium EDTA | SIGMA | E1644 | Culture medium preparation |
| FeSO4•7 H2O | SIGMA | 215422 | Culture medium preparation |
| MnCl2•4 H2O | SIGMA | 221279 | Culture medium preparation |
| ZnSO4•7 H2O | SIGMA | 204986 | Culture medium preparation |
| CuSO4•5 H2O | SIGMA | C8027 | Culture medium preparation |
| tryptone | SIGMA | 16922 | Culture medium preparation |
| Microscope system | Nikon | Eclipase Ti inverted | microscope imaging |
| Scientific CCD Camera | QImaging | Retiga-2000R Fast 1394 | microscope imaging |
References
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