Summary
C. 선 충감염 Aeromonas 공부 하 세 다른 실험을 소개 합니다. 이러한 편리한 방법을 사용 하 여, 그것 중 고 Aeromonas 종 내에서 독성을 평가 하기 쉽습니다.
Abstract
인간 병원 체 Aeromonas 임상적으로 위장염, 상처 감염, 패 혈 증, 및 요로 감염 원인 표시 되었습니다. 대부분의 인간의 질병 4 종의 박테리아와 관련 된 것으로 보고 되었습니다: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii및 Aeromonas caviae. 모델 생물 꼬마 선 충 은 Aeromonas의 세균 병 인을 공부 하는 우수한 감염 모델을 제공 하는 bacterivore 이다. 여기, 생존, 액체 독성, 그리고 근육 괴 사 분석을 포함 하 여 선 충 C. 모델을 사용 하 여 Aeromonas 감염 연구 3 다양 한 실험을 소개 합니다. Aeromonas 의 독성을 결정 하는 세 가지 방법의 결과 일치 했다. A. dhakensis 는 4 주요 Aeromonas 종 임상 감염을 일으키는 가운데 가장 독성이 있을 표시 했다. 이러한 메서드 및 Aeromonas 종 내에서 독성을 평가 하 고 Aeromonas 감염의 병 인에 대 한 우리의 이해에 기여 하는 편리한 방법이 되도록 표시 됩니다.
Introduction
인간 병원 체, Aeromonas, 임상적으로 위장염, 상처 감염, 패 혈 증, 및 요로 감염1,2에 표시 되었습니다. 가장 관련 된 인간의 질병 관련 4 개의 세균성 종 된 것으로 보고 되었습니다: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii및 Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. Aeromonas 전염병 중 소프트-조직 감염에에서 발생할 수 있습니다 심각한 병 적 상태와 사망률 인 간에. 메모의 근육 괴 사 연 조직 감염6의 가장 심한 형태입니다. 생존의 관찰 및 감염 후 꼬마 선 충 의 근육 괴 사 Aeromonas의 독성을 추측 하는 편리한 방법입니다.
과학자는 이미 수많은 모형 유기 체 공부 세균 감염을 개발 했다. 이전 학문에서는, 쥐, zebrafishes, 및 nematodes 사용 되었다 동물 모델로 pathogenesis Aeromonas6,,78의 독성을 공부 하 고. 모든 동물 모델의 ' 장점 및 응용 프로그램. 모델 유기 체, 꼬마 선 충, foodnaturally bacterivorous 선 충 류는 섭취 박테리아 이다. C. 선 충의 진화의 과정을 통해 세균 감염에 대 한 복잡 한 타고 난 면역 체계를 개발 했다. 세균 감염의 스트레스, 선 충 C. Aeromonas6,,79 와 다른 병원 체의 세균 병 인을 공부 하는 우수한 감염 모델 입증 되었습니다. 같은 균 류10 및 enterohaemorrhagic 대장균 O157:H711. 그러나, 여전히 모델 C. 선 충 을 사용 하 여 Aeromonas독성 연구 방법론에 초점을 맞춘 없습니다 게시가입니다.
여기, 우리가 공부 Aeromonas 감염 동물 모델로 서 C. 선 충 을 사용 하 여 3 개의 다른 실험 소개: 생존, 액체 독성, 그리고 근육 괴에 대 한 분석. 이 메서드는 중 고 Aeromonas 종 내에서 독성을 평가 하 고 Aeromonas의 pathogenesis의 이해를 개선 하는 편리한 방법을.
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Protocol
1입니다. 문화 매체의 준비
참고: 솔루션 준비에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
- M9 중간12준비, KH2포41.5 g, 나2HPO4, 5.66 g 및 이온된 물 500 mL에 NaCl의 2.5 g을 분해. 20 분을 위한 121 ° C에 고압 실내 온도에 냉각 될 때까지 기다립니다 고 1 M MgSO4 처음 사용 하기 전에 0.5 mL를 추가 합니다.
- 선 충 류 성장 매체 (NGM)12를 준비 하려면 3g NaCl, 2.5 g 세균성 펩, 및 이온을 제거 된 물 1 리터에 20 g 한 천 분해. 20 분을 위한 121 ° C에 고압 물 욕조에 55 ° C에 냉각 될 때까지 기다립니다 고 1 M CaCl2의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO4, 5% 에탄올, 콜레스테롤의 1 mL 및 인산 염 버퍼의 25 mL를 추가 합니다. 잘 섞어 소용돌이 친다.
- 약 5 mL NGM 각 6 cm 배양 접시에 부 어. 접시의 표면에 거품 생산을 하지 마십시오. 1 박 및 4 ° c.에 저장 하려면 패키지 실내 온도에 격판덮개를 두고 사용 하기 전에 실내 온도에 돌려.
- 풍부한 NGM (ENGM)를 준비 하려면 3g NaCl, 5 g 세균성 펩, 1 g 효 모 추출 물, 및 이온을 제거 된 물 1 리터에 30 g 한 천 분해. 20 분을 위한 121 ° C에 고압 물 목욕에서 55 ° C에 냉각 될 때까지 기다립니다 고 1 M CaCl2의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO4, 5% 에탄올, 콜레스테롤의 1 mL 및 인산 염 버퍼의 25 mL를 추가 합니다. 잘 섞어 소용돌이 친다.
- 약 10 mL ENGM 각 9 cm 배양 접시에 부 어. 접시의 표면에 거품 생산을 하지 마십시오. 1 박 및 4 ° c.에 저장 하려면 패키지 실내 온도에 격판덮개를 두고 사용 하기 전에 실내 온도에 가져와.
- S 중간12준비, 40 mL S 기저, 0.4 mL 1 M 칼륨 구 연산 염 혼합, 0.4 mL 추적 솔루션, 1 M CaCl2, 0.12 mL의 1 M MgSO4, 에탄올에 5% 콜레스테롤 40 µ L의 0.12 mL 및 사용 하기 전에 8 m m FudR의 1 mL 금속.
2. C. 선 충6,,912 의 동기화
- 15 mL 튜브에 살 균 이온된 수 10 mL와 함께 벗 성인 무대에서 약 2000 벌레를 씻어. 박테리아 3 x, 튜브의 아래쪽에는 벌레를 유지 충분히 세척 한다.
- 풀 벌레 다운 500 x g 에서 1 분 샘플 원심 상쾌한, 제거 하 고 3.5 mL 이온을 제거 된 물에는 벌레를 유지.
- 1 mL NaOCl (10-15%) 및 0.5 mL 5 M 코 튜브에 추가 합니다. 동안 흔들어 하 여 균등 하 게 혼합 < 6 분 웜 시체를 lyse.
- 후 계란 벌레에서 출시 되는 세포를 막으려고 10 mL 이온된 물을 추가 합니다. 풀 다운 계란을 제거 가능한 상쾌한 1200 x g 에서 1 분 동안 원심 분리기. 씻어 15 mL M9 중간 적어도 3 배.
참고: 단계 1.1 M9 매체의 구성에 대 한 참조. - 1 mL M9 매체에 계란을 유지. 1 박 (약 12-18 h) 20 ° C에 외피에 대 한 3.5 c m 접시에 계란을 전송 합니다.
참고:는 부 화 후 계란 벌레 유 충 애벌레 (L1) 초단으로 불리는 해치 것입니다. - M9 매체에서 L1 벌레의 10 µ L 밖으로 플라스틱. 벌레의 수를 계산 하 고 L1의 농도 웜 M9 매체에 계산.
- 씨앗 최대 10000 incubated L1 무대 벌레를 피펫으로와 대장균 OP50 확산 9 cm ENGM 접시에.
- 이 단계에서는 확산 0.5 mL 하룻밤 Luria Bertani (파운드) 9 cm ENGM 접시에 국물과 함께 대장균 OP50 경작. 16-18 h 37 ° C에서 접시를 품 어
참고: 오염을 방지 하려면 확산 단계는 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다. - L1 벌레를 뿌리기 전에 실내 온도에 냉각 하십시오. 씨앗 최대 10000 incubated L1 단계 웜 대장균 OP50와 ENGM에.
- 이 단계에서는 확산 0.5 mL 하룻밤 Luria Bertani (파운드) 9 cm ENGM 접시에 국물과 함께 대장균 OP50 경작. 16-18 h 37 ° C에서 접시를 품 어
- 44 h 또는 4번째 애벌레 (L4) 단계로 성장 때까지 20 ° C에서 벌레를 품 어.
참고: 1.3 ENGM 매체의 구성에 대 한 단계를 참조 하십시오. 벌레 L4 단계에서 반달 모양 몸 측면의 중앙에 흰 점이 있다. - 사용 하 여 동기화 된 L4 단계 다음 분석 실험에서 벌레. N2 Aeromonas dhakensis 와 선 충 C. 생존 분석 결과에 선 충 C. 액체 독성 분석 결과 Aeromonas dhakensis벌레는 야생 타입을 사용 합니다. RW1596 웜 (myo-3(st386); 를 사용 하 여 stEx30 [묘-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) Aeromonas dhakensis와 선 충 C. 근육 괴 사 분석 결과에.
3. 선 충 C. 생존 분석 결과 Aeromonas6,9
- L1 웜 확산 대장균 OP50와 ENGM에 시드 날, 각 4 개의 Aeromonas 긴장 또는 대장균 OP50 및 16 h 37 ° C에서 각각 2 mL 파운드 국물과 함께 문화 단일 식민지를 선택 하십시오.
참고: 오염을 방지 하려면이 단계는 층 류 후드에서 수행 되어야 한다. 여기서 다음 세균성 긴장 사용 했다: 대장균 OP50, C. 선 충의 정상적인 음식 소스. A. dhakensis , AAK1는 첫 번째 완전 시퀀싱 병원 임상 A. dhakensis 분리. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, 그리고 A. caviae A2-9307121 국립 쳉 쿵 대학 병원에서 대표적으로 임상 분리 있습니다. - 세균성 국물의 OD600 흡 광도 측정 하 고 OD600 세균 국물 조정 = 파운드 국물과 함께 2.0.
- 자리 하 고 확산 30 µ L 세균성 국물의 각 6 cm NGM 접시. 하룻밤 실 온에서 격판덮개 문화.
참고: NGM 매체의 구성에 대 한 1.2 단계를 참조 하십시오. - L1 웜 L4 단계에 성장 하는 날에 무작위로 선택 하 고 각 4 Aeromonas 긴장의 E. 콜라이 OP50 NGM 접시 50 웜 전송.
- 분석 결과 완료 될 때까지 20 ° C에서 NGM 접시를 품 어.
- 매일 때까지 마지막 벌레는 죽은 박테리아 및 수의 숫자, 죽은, 라이브 센서 웜 새로 준비 NGM 접시에 모든 살아있는 벌레를 전송 합니다.
참고: 전송 웜 신선한 준비 NGM 접시에 감염, 유지 관리를 위해 매일 살 균 벌레를 사용 하는 경우에 (예를 들어glp-4, 또는 FudR). - 매일 데이터 계산에 따라 생존 곡선을 플롯.
4. 선 충 C. 액체 독성 분석 결과 Aeromonas7
참고: 오염 방지 하려면 단계 층 흐름 후드에서 수행 되어야 합니다.
- L1 웜 확산 대장균 OP50 ENGM 플레이트에 시드 후 하루 4 Aeromonas 변종 대장균 OP50과의 문화 5 mL를 각각의 단일 식민지 파운드 국물 각 16 h 37 ° C에서 선택 합니다.
참고: 프로토콜을 다음 박테리아 긴장 사용 했다: 대장균 OP50, C. 선 충의 정상적인 음식 소스. A. dhakensis , AAK1는 첫 번째 완전 시퀀싱 병원 임상 A. dhakensis 분리. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, 그리고 A. caviae A2-9307121 국립 쳉 쿵 대학 병원에서 대표적으로 임상 분리 있습니다. - 박테리아 국물의 OD600 흡 광도 측정 한다.
- 3500 x g 파운드 국물 제거 하려면 15 분 동안에 세균성 국물 원심 박테리아를 resuspend 하 고 OD600 세균 국물 조정 = 3.0 S 매체. S 매체에 96 잘 접시의 적어도 8 우물 195 µ L 세균성 국물을 추가 합니다.
참고: 1.6 S 매체의 구성에 대 한 단계를 참조 하십시오. - M9 매체를 사용 하 여 대장균 OP5와 ENGM 접시에 L4 벌레를 씻어. µ L 당 5 벌레의 농도에 웜 솔루션을 조정 하 고 웜 솔루션의 5 µ L 96 잘 접시의 각 음을 추가. 잘 당 약 25 벌레 인지 확인 합니다.
- 25 ° c.에서 200 rpm에서 통에 96 잘 접시를 품 어
- 다음 수식 사용 하 여 각의 생존 율을 계산 하는 24, 48, 및 72 h. 후 라이브 웜 및 죽은 벌레의 수를 계산: (라이브 웜/총 벌레) × 100%.
- 매일 데이터 계산 분산형 플롯 그래프를 그립니다.
5. 선 충 C. 근육 괴 사 분석 결과 Aeromonas6
참고: 오염을 방지 하려면 다음이 단계는 층 류 두건에서 수행 되어야 합니다.
- L1 웜 대장균 OP50와 ENGM 확산에 시드는 하루에 4 개의 Aeromonas 긴장 및 대장균 OP50 및 문화 국물과 함께 2 mL 파운드 각 16 h 37 ° C에서의 각각의 단일 식민지를 선택 하십시오.
참고: 여기, 다음 박테리아 변종이 사용 되었다: 대장균 OP50, C. 선 충의 정상적인 음식 소스. A. dhakensis , AAK1는 첫 번째 완전 시퀀싱 병원 임상 A. dhakensis 분리. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, 그리고 A. caviae A2-9307121 국립 쳉 쿵 대학 병원에서 대표적으로 임상 분리 있습니다. - 박테리아 국물의 OD600 흡 광도 측정 하 고 OD600 박테리아 국물 조정 = 파운드 국물과 함께 2.0. 자리 고 30 µ L 세균성 국물 6 cm NGM 접시에의 확산. 하룻밤 실 온에서 격판덮개 문화.
- 하루에 L1 웜 4 Aeromonas 긴장의 E. 콜라이 OP50 각 각 NGM 접시에 전송 50 웜 L4 단계에 성장. 20 ° c.에 NGM 번호판을 품 어 박테리아와 새로 준비 NGM 판 웜 모든 24 h를 전송 합니다.
- 형광 현미경을 사용 하 여 근육 이미지를 가져가 라.
- 임의로 슬라이드에 M9 매체에 2 %agarose 젤에 10 벌레를 선택 합니다. 벌레를 사용 하 여 1% 나트륨 아 지 드의 2 µ L agarose에 M9 중간에 5 분 미만 대 한 이미지를 복용 하기 전에 마비
- 커버 슬립을 배치 하 고 전 하 결합 소자 카메라로 형광 현미경에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터를 사용 하 여 근육 이미지를 캡처하십시오. 24, 48, 및 72 h 포스트는 L4 단계에서 근육 이미지를 캡처하십시오.
- 이미지 프로세싱 소프트웨어와 이미지 분석 및 그림 준비를 수행 합니다.
참고: 정의 점수와 근육 손상 레벨의 그림 3을 기준은 다음과 같이 나열 됩니다에 표시 됩니다: 3 포인트 누락 된 근육 섬유; 파열 또는 깨진 근육 섬유;에 대 한 2 점 구부러진된 근육 섬유;에 대 한 1 포인트 건강 한 근육 섬유에 대 한 0 점입니다.
6. 통계 분석
- 수행 하지 모든 실험 최소 세 번 독립적으로 합니다.
- 카 플 란-마이어 메서드를 사용 하 여 선 충 C. 생존 분석, 평가 하 고 생존 차이 분석 로그-순위 테스트를 사용 합니다. 0.05에서 통계적 의미를 설정 합니다.
- 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 두 개의 서로 다른 그룹에 대 한 선 충 C. 액체 독성 분석 실험의 통계 결과 분석. 한 독립 변수가 3 개 이상의 값 간의 차이 분석에서 일방통행 ANOVA 테스트를 사용 합니다. 0.05에서 통계적 의미를 설정 합니다.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜에 따라, 4 개의 Aeromonas 긴장에서 독성 구분 하기 쉽습니다. C. 선 충 의 생존 분석 결과 그림 1에 표시 됩니다. C. 선 충 감염 Aeromonas 종, 낮은 높은 순서로 표시 된의 생존 율 했다: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila 그리고 A. dhakensis. 독성 및 Aeromonas 종 내 면에서 다양성은, C. 선 충의 생존 율 평균, A. dhakensis감염 벌레 중 가장 높은 사망률을 보였다. A. hydrophila 의 독성은 A. dhakensis (p < 0.01)의 열 등 한. A. dhakensis , A. hydrophila달리 A. veronii , A. caviae 의 감쇠 virulences C. 선 충 생존 분석 결과에서 관찰 되었다. C. 선 충 종 Aeromonas 감염의 생존 율의 다양성은 Aeromonas 감염7의 임상 관찰과 일치 합니다.
C. 선 충 의 액체 독성 시험의 결과 그림 2에 표시 됩니다. 감염 시간 살아남은 벌레의 숫자 감소 크게 때 선 충 C. A. dhakensis 또는 A. hydrophila감염 되었다. A. dhakensis 감염 벌레의 생존 율 A. hydrophila감염 그 게 열 등 했다. 반면, A. caviae , A. veronii 와 감염 그룹 A. dhakensis 와 A. hydrophila각 시간 지점에서 더 높은 생존 율을 했다. 다른 Aeromonas 종의 독성을 나타내는 액체 독성 분석 결과에서 C. 선 충 의 생존 율의 동향은 생존 분석 결과에서 관찰 된 것과 유사한.
C. 선 충 근육 괴 사 분석 결과에서 우리는 먼저 근육 손상의 수준을 분류 하 고 해당 수준에 따라 점수를 할당. 점수와 근육 손상 레벨의 정의 그림 3에서 제공 됩니다. 각 근육 손상 수준에 대 한 점수 기준은 다음과 같습니다: 건강 한 근육 섬유; 0 포인트 구부러진된 근육 섬유;에 대 한 1 포인트 파열 또는 깨진 근육 섬유;에 대 한 2 점 근육 섬유의 손실에 대 한 3 점입니다. C. 선 충 근육 괴 사의 결과 Aeromonas 감염-C. 선 충 는 그림 4에 나와 있는 시험. 근육 손상도 Aeromonas 종 가운데 다양합니다. 근육의 수준을 다음과 같이 원거리에서 하려면 약한부터 심한 손상: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila, 그리고 각 시간 지점에서 A. dhakensis . A. hydrophila , A. dhakensis와 근육 괴 벌레 감염 된 A. caviae , A. veronii에서 분명 했다. A. caviae , A. veronii 감염 벌레의 대부분 0 점으로 기록 되었다. 선 충 C. A. hydrophila 또는 A. dhakensis 감염 심한 근육 손상을 전시. 노트, A. dhakensis 감염 벌레의 대부분 근육 손상 등급 ≥2 포인트를 설명 했다. C. 선 충 감염 된 A. dhakensis 의 근육 괴 사의 정도 A. hydrophila에 비해 2 포인트 점수 ≥의 더 높은 백분율의 점에서 더 심각 했다. 4 Aeromonas 종 괴 사 근육의 생존 및 액체 독성 분석 실험에서 결과와 상관 된다.
위에서 설명한 방법을 독성 다양성 및 Aeromonas 종 내에서 차별화 하는 편리한 방법을 제공 합니다. 또한, 병원 체와 호스트 간의 상호 작용을 공부 하는 신뢰할 수 있는 모델입니다.
그림 1 : C. 선 충의 생존 곡선. 생존 분석 결과 표시 Aeromonas 종의 다양 한 독성 C. 선 충 (* *: P < 0.01; *: P < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 액체 독성 분석 결과에서 C. 선 충 의 생존 율. 액체 독성 분석 결과 C. 선 충을 다양 한 Aeromonas 종의 다른 독성을 보여줍니다. (A) 24 시간 (B) 48 h, 및 (C) 72 h Aeromonas 감염, C. 선 충 감염 된 A. dhakensis 는 최저 생존 율. A. dhakensis 는 C. 선 충 을 가장 독성 Aeromonas 종 결과 나왔다 (* * *: P < 0.001; * *: P < 0.01, 오차 막대: 표준 편차, SD). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : C. 선 충 괴 사 근육에 대 한 해당 점수 Aeromonas 감염에 의해 유도. 대 한 기준을 근육 괴 사 및 해당 점수는 다음과 같습니다: 3 포인트 누락 된 근육 섬유; 파열 또는 깨진 근육 섬유;에 대 한 2 점 구부러진된 근육 섬유;에 대 한 1 포인트 건강 한 근육 섬유에 대 한 0 점입니다. 구부러진된 근육 섬유 (화살표), 파열된 근육 섬유 (화살촉), 그리고 누락 된 근육 섬유 (별)이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 선 충 C. 근육 괴 사 점수. 근육 괴 사 점수 C. 선 충을 Aeromonas 종의 다양 한 독성을 보여줍니다. (A) (B) 24 시간에서 48 시간, 그리고 (C) 72 h Aeromonas 감염, C. 선 충 근육 손상은 가혹한 감염에서 A. dhakensis. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 솔루션 | 준비 |
| 인산 염 버퍼 | 119.35 g KH2PO4와 21.43 g K2HPO4 1 L 이온을 제거 된 물에서의 용 해. 20 분 동안 121 ° C에 고압 조정 산도를 pH 값 = 코와 6.0. 실내 온도에 냉각 될 때까지 기다립니다 |
| S 기저 | 5.85 g NaCl, 6 g KH2포4및 1 g K2HPO4 이온 물 1 L에 녹. 20 분 동안 121 ° C에 고압입니다. 실내 온도에 냉각 될 때까지 기다립니다. |
| 1 M 칼륨 구 연산 염 | 4 g 구 연산 acid•H2O와 58.7 g 트라이-칼륨 citrate•H2O 이온된 수의 0.2 mL에 용 해. 조정 산도를 pH 값 = 6.0. 20 분 동안 121 ° C에 고압입니다. 실내 온도에 냉각 될 때까지 기다립니다. |
| 추적 금속 솔루션 | 1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4•7 H2O, 0.2 g MnCl2• 4 H2O, 0.29 g ZnSO4•7 H2O, 해산 1 L 이온된 물에 0.025 g CuSO4•5 H2O. 20 분 동안 121 ° C에 고압입니다. 실내 온도에 냉각 될 때까지 기다립니다 어둠 속에서 솔루션을 계속. |
| 국물 LB | 10 g NaCl, 10 g tryptone, 및 이온을 제거 된 물 1 리터에 5 g 효 모 추출 물 분해. 20 분 동안 121 ° C에 고압입니다. 실내 온도에 냉각 될 때까지 기다립니다. |
표 1: 솔루션 준비입니다.
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Discussion
C. 선 충 은 bacterivorous 선 충 류는 자연스럽 게 음식 섭취 박테리아의 진화 과정 동안 박테리아에 복잡 한 타고 난 면제를 개발 했다. 유지 하 고 면역을 지 원하는 주요 장기의 2 개는 표 피와 내장9,13. 표 피와 근육 C. 선 충 의 포유류와 인간6소프트-조직 구조를 유사합니다. 이러한 특성 때문에 C. 선 충 은 Aeromonas 감염의 병 인 연구 모델 생물으로 적용 됩니다.
여기, 우리는 임상 관찰74 Aeromonas 종 중 다양 한 독성의 대표 고 상관은 Aeromonas C. 선 충 감염을 조사 하기 위한 세 가지 방법 제시. 이러한 편리한 방법을 구별 Aeromonas 종 중 독성의 다른 정도. 이러한 방법을 사용 하 여, 연구원은 Aeromonas 종 독성 및 Aeromonas 감염 시 호스트의 방어 메커니즘을 공부할 수 있습니다.
이 세 가지 방법에서 C. 선 충 뿐만 아니라 육 식으로 뿐만 아니라 Aeromonas의 먹이로 역할을 합니다. 벌레 테스트 하기 전에 건강 한 상태에 없는 경우, 호스트 병원 체 상호 작용의 결과 다를 수 것입니다. 따라서, C. 선 충을 조작 하는 때 매우 조심 하는 것이 중요 하다. C. 선 충 의 알을 동기화 단계에서 과도 한 손상을 방지 하려면 계란의 릴리스를 지속적으로 관찰을 해야 합니다. 달걀은 손상 된 일단 C. 선 충 계란의 부 화 수 크게 줄어듭니다. 경우에 손상 된 계란은 성공적으로 해치, 벌레 발달 문제가 높습니다. 따라서, 그것은 완료 단계 2.3 6 분 이내에 중요 한 벌레 NaOCl과 코에 노출 됩니다.
위에서 설명한 세 가지 방법 Aeromonas 독성에 C. 선 충, Aeromonas 감염 및 1 C. 선 충 의 생존 율을 측정 하는 2 개의 다른 실험을 포함 하 여 응집 결과 표시 근육의 형태학 적 변화를 관찰. 다른 설계 방법을 사용 하 여 독성 테스트는 다양 한 결과 제공할 수 있습니다. 예를 들어 과학자는 이전 선 충 C. 접시에 다른 결과 관찰 하 고 액체 분석 실험14. 우리의 연구에서 우리 또한 발견 했다이 두 분석9사이 기존 하는 불일치. 그것은 외부 환경, 병원 체의 독성 영향을 미칠 것을 연구원은 독성 메커니즘을 탐구 하는 최적의 조건의 찾이 필요가 믿고. 또 다른 관점에서 그것은 가치가 공부 하 고 감염의 특정 상태에 있는 근본적인 메커니즘을 이해입니다.
이 작품에서는, 우리는 C. 선 충 감염 후 Aeromonas 및 해당 호스트 응답의 독성 연구에서 감염 모델 설립. 이러한 세 가지 방법은 현재 연구에서 해결 하는 4 종의 넘어 다른 Aeromonas 종 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 이러한 방법 세균 감염에 의해 유도 된 근육 괴에 대 한 책임 기본 메커니즘을 연구 하 고 심한 연 조직 감염의 임상 결과 개선 하기 위해 잠재적인 치료를 개발 하는 플랫폼을 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 진단 미생물학을 대만에 선 충 C. 핵심 시설에서 지원에 대 한 감사와 항균 성 저항 실험실의 국립 쳉 쿵 대학 병원 Aeromonas 제공 하기 위한 격리. 우리는 또한 꼬마 유전학 센터 (CGC) 그리고는 WormBase를 인정합니다. 우리는 또한 원고 편집 Savana 무어 감사 합니다.
이 연구는 P.L. 첸을 과학의 부 및 기술의 대만 (가장 105-2628-B-006-017-MY3)과 국립 쳉 쿵 대학 병원 (NCKUH-10705001)에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | Bacteria incubation |
| K2HPO4 | J.T.Baker | MP021519455 | Culture medium preparation |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-05 | Culture medium preparation |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | MP021914405 | Culture medium preparation |
| NaCl | SIGMA | 31434 | Culture medium preparation |
| MgSO4 | SIGMA | M7506 | Culture medium preparation |
| agar | Difco | 214530 | Culture medium preparation |
| CaCl2 | SIGMA | C1016 | Culture medium preparation |
| cholesterol | SIGMA | C8503 | Culture medium preparation |
| ethanol | SIGMA | 32205 | Culture medium preparation |
| KOH | SIGMA | P5958 | Culture medium preparation |
| 6 cm Petri plate | ALPHA PLUS | 46 | agar plate preparation |
| 96-well plate | FALCON | 353072 | liquid assay |
| bacterial peptone | Affymetrix/USB | AAJ20048P2 | Culture medium preparation |
| yeast extract | SIGMA | 92144 | Culture medium preparation |
| citric acid•H2O | SIGMA | C1909 | Culture medium preparation |
| tri-potassium citrate•H2O | SIGMA | 104956 | Culture medium preparation |
| FudR | SIGMA | 1271008 | Culture medium preparation |
| disodium EDTA | SIGMA | E1644 | Culture medium preparation |
| FeSO4•7 H2O | SIGMA | 215422 | Culture medium preparation |
| MnCl2•4 H2O | SIGMA | 221279 | Culture medium preparation |
| ZnSO4•7 H2O | SIGMA | 204986 | Culture medium preparation |
| CuSO4•5 H2O | SIGMA | C8027 | Culture medium preparation |
| tryptone | SIGMA | 16922 | Culture medium preparation |
| Microscope system | Nikon | Eclipase Ti inverted | microscope imaging |
| Scientific CCD Camera | QImaging | Retiga-2000R Fast 1394 | microscope imaging |
References
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