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Immunology and Infection

Evaluación de la virulencia y patogenia de la infección por Aeromonas en un modelo elegans de Caenorhabditis

Published: December 20, 2018 doi: 10.3791/58768
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 2,4
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Internal Medicine, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Aquí, presentamos tres diferentes experimentos para estudiar la infección por Aeromonas en C. elegans. Usando estos métodos convenientes, es fácil evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas .

Abstract

El patógeno humano Aeromonas se ha demostrado clínicamente para causar gastroenteritis, infecciones de heridas, septicemia y las infecciones del tracto urinario. Enfermedades más humanas se han divulgado para ser asociado de cuatro especies de bacterias: Aeromonas caviae, Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophilay Aeromonas veronii. El organismo modelo Caenorhabditis elegans es un bacterivore que proporciona un modelo de infección excelente por que estudiar la patogénesis bacteriana de Aeromonas. Aquí, presentamos tres diferentes experimentos para estudiar la infección por Aeromonas utilizando un modelo de C. elegans , incluyendo supervivencia, toxicidad líquida y ensayos de necrosis muscular. Los resultados de los tres métodos de determinación de la virulencia de Aeromonas eran constantes. A. dhakensis fue demostrado para ser el más tóxico entre las 4 principales especies de Aeromonas causando infecciones clínicas. Estos métodos aparecen para ser una forma conveniente para evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas y contribuir a la comprensión de la patogenia de la infección por Aeromonas .

Introduction

El patógeno humano, Aeromonas, se ha demostrado clínicamente para causar gastroenteritis, infecciones de heridas, septicemia y las infecciones de vías urinarias1,2. Más enfermedades humanas asociadas se han divulgado para ser asociado a cuatro especies bacterianas: Aeromonas caviae , Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophilay Aeromonas veronii 2,3 , 4 , 5. entre las enfermedades infecciosas Aeromonas , infecciones de tejidos blandos pueden causar morbilidad grave y mortalidad en los seres humanos. De nota, la necrosis del músculo es la forma más severa de infección de tejidos blandos6. Observación de la supervivencia y la necrosis del músculo de elegans de Caenorhabditis después de la infección es un método conveniente especular la toxicidad de Aeromonas.

Los científicos ya han desarrollado numerosos organismos modelo para estudiar las infecciones bacterianas. En estudios previos, ratones, zebrafishes y nemátodos se utilizaron como modelos animales para estudiar la patogénesis y virulencia de Aeromonas6,7,8. Cada animal tiene su ' ventajas y aplicaciones. El organismo modelo Caenorhabditis elegans, es un nematodo de bacterivorous que las bacterias de las tomas como foodnaturally. C. elegansha desarrollado un complicado sistema inmune innato contra la infección bacteriana en el transcurso de su evolución. Bajo el estrés de una infección bacteriana, C. elegans ha demostrado para ser un modelo de infección excelente para el estudio de la patogenia bacteriana de Aeromonas6,7,9 y otros patógenos como hongo10 y enterohemorrágica Escherichia coli O157: H711. Sin embargo, todavía hay ninguna publicación que se centra en la metodología en el uso de C. elegans como modelo para el estudio de la virulencia de Aeromonas.

Aquí, presentamos tres diferentes experimentos para estudiar la infección por Aeromonas con C. elegans como modelo animal: Análisis de supervivencia, líquida toxicidad y necrosis muscular. Estos métodos son una manera conveniente para evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas y mejorar la comprensión de la patogenesia de Aeromonas.

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Protocol

1. preparación de medio de cultivo

Nota: Ver tabla 1 para la preparación de la solución.

  1. Para preparar el medio M912, disolver 1.5 g de KH2PO4, 5,66 g de Na2HPO4y 2.5 g de NaCl en 500 mL de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 min esperar hasta que haya enfriado a temperatura ambiente y añadir 0,5 mL de 1 M MgSO4 antes del primer uso.
  2. Para preparar el crecimiento de nematodos medio (NGM)12, disolver 3 g de NaCl, 2.5 g peptona bacteriana y agar 20 g en 1 L de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 min esperar hasta que se enfríe a 55 ° C en un baño de agua y luego añadir 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de colesterol 5% en etanol y 25 mL de tampón fosfato. Agite para mezclar bien.
  3. Vierta unos 5 mL de NGM en cada plato de Petri de 6 cm. Evitar la producción de burbujas en la superficie de la placa. Dejar las placas a temperatura ambiente durante 1 noche y paquete para guardar a 4 ° C. Llevar a temperatura ambiente antes de usar.
  4. Para preparar enriquecido NGM (ENGM), disolver 3 g de NaCl, peptona bacteriana 5 g, 1 g extracto de levadura y agar de 30 g en 1 L de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos a esperar hasta que se enfríe a 55 ° C en un baño de agua y agregar 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de colesterol 5% en etanol y 25 mL de tampón fosfato. Agite para mezclar bien.
  5. Vierta aproximadamente 10 mL ENGM en cada plato de Petri de 9 cm. Evitar la producción de burbujas en la superficie de la placa. Dejar las placas a temperatura ambiente durante 1 noche y paquete para guardar a 4 ° C. Llevar a temperatura ambiente antes de usar.
  6. Para preparar medio S12, mezcla de citrato de potasio de 40 mL S Basal, 0,4 mL de 1 M, rastro de 0,4 mL metales solución 0,12 mL de 1 M CaCl2, 0,12 mL de 1 M MgSO4, 40 μl de colesterol 5% en etanol y 1 mL de 8 mM FudR antes de usar.

2. sincronización de C. elegans6,9,12

  1. Lave unos 2.000 lombrices en la etapa adulta grávida con 10 mL de agua desionizada estéril en un tubo de 15 mL. Lavar las bacterias 3 x mantener los gusanos en la parte inferior del tubo.
  2. Centrifugar la muestra durante 1 minuto a 500 x g para tirar abajo los gusanos. Quite el sobrenadante y mantener los gusanos en 3,5 mL de agua desionizada.
  3. Añadir 1 mL de NaOCl (10 – 15%) y 0.5 mL 5 M de KOH en el tubo. Mezcla uniformemente agitando para < 6 min a lyse los cuerpos del gusano.
  4. Después se liberan los huevos de los gusanos, agregar 10 mL de agua desionizada para evitar la lisis. Centrifugar por 1 min a 1.200 x g tire hacia abajo de los huevos y retirar el sobrenadante tanto como sea posible. Lavar con 15 mL M9 media por lo menos 3 x.
    Nota: Véase el paso 1.1 para la composición del medio M9.
  5. Mantener los huevos en medio M9 de 1 mL. Transporte de huevos en un plato de 3,5 cm para la incubación a 20 ° C por una noche (de 12 a 18 h).
    Nota: Después de la incubación, los huevos eclosionan para gusano de la larva que se llama como la primera etapa de la larva (L1).
  6. Pipetear a 10 μl de gusanos L1 en medio M9. Contar el número de gusanos y calcular que la concentración de L1 gusanos en medio M9.
  7. Semilla a más de 10.000 incubaron gusanos de fase L1 con una pipeta en una placa de 9 cm ENGM con Escherichia coli OP50.
    1. En este paso, propagación 0,5 mL cultivados durante la noche OP50 de e. coli con caldo de Luria-Bertani (LB) en la placa de 9 cm ENGM. Incubar la placa a 37 ° C durante 16-18 h.
      Nota: Para evitar la contaminación, el paso que se separa debe realizarse en una campana de flujo laminar.
    2. Enfriar a temperatura ambiente antes de sembrar lombrices de L1. Semilla a más de 10.000 incubaron gusanos de fase L1 de la placa de la ENGM con e. coli OP50.
  8. Incubar los gusanos a 20 ° C durante 44 h o hasta que crecen a la etapa de larva (L4) 4 demayo .
    Nota: Consulte el paso 1.3 para la composición del medio ENGM. Un gusano tiene un punto blanco en forma de media luna en la mitad del lado del cuerpo en la etapa de L4.
  9. Utilice el L4 sincronizado escenario gusanos en los siguientes ensayos. En el ensayo de supervivencia de C. elegans con Aeromonas dhakensis y el ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas dhakensisgusanos uso salvaje tipo N2. Usar gusanos de RW1596 (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) en el ensayo de necrosis de músculo de C. elegans con Aeromonas dhakensis.

3. Análisis de supervivencia de C. elegans con Aeromonas6,9

  1. En el día de la siembra de lombrices de la L1 en la ENGM separarse con e. coli OP50, escoge una sola Colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o e. coli OP50 cultura con 2 mL de caldo de libras respectivamente, a 37 ° C por 16 h.
    Nota: Para evitar la contaminación, este paso debe realizarse en una campana de flujo laminar. Aquí, se utilizaron las siguientes cepas bacterianas: Escherichia coli OP50, la alimentación normal de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, el primer completamente secuenciado patógenos clínicos dhakensis a. aislar. A. hydrophila A2-066, A2-007 a. veronii y a. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativo del National Cheng Kung University Hospital.
  2. Medir la absorbancia de600 OD de caldo bacteriano y ajustar el caldo bacteriano OD600 = 2.0 con caldo LB.
  3. Punto y extensión 30 μl de caldo bacteriano de cada placa NGM de 6 cm. La cultura las placas a temperatura ambiente durante la noche.
    Nota: Consulte el paso 1.2 para la composición del medio NGM.
  4. En el día que los gusanos L1 crecen hasta la etapa de L4, aleatoriamente escoger y transferir 50 gusanos en una placa de NGM con cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o e. coli OP50.
  5. Incubar las placas NGM a 20 ° C hasta que termine el ensayo.
  6. Transferir todos los gusanos de vida a una placa NGM recién preparada con bacterias y cuenta los números de viven, muerta, y sensor gusanos todos los días hasta el último gusano está muerto.
    Nota: Transferencia de gusanos a una placa NGM preparado fresco todos los días para el mantenimiento de la infección, aunque utilizando gusanos estériles (p. ej.glp-4, o con FudR).
  7. Trazar las curvas de supervivencia basadas en el cálculo de datos diario.

4. ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas7

Nota: Para evitar la contaminación, pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar.

  1. El día después de la siembra de las lombrices de la L1 en la placa de la ENGM con e. coli OP50, escoge una sola Colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y e. coli OP50, cultura con 5 mL de LB caldo cada a 37 ° C por 16 h.
    Nota: En el protocolo, se utilizaron las siguientes cepas de bacterias: e. coli OP50, la alimentación normal de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, el primer completamente secuenciado patógenos clínicos dhakensis a. aislar. A. hydrophila A2-066, A2-007 a. veronii y a. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativo del National Cheng Kung University Hospital.
  2. Medir la absorbancia de600 OD del caldo de las bacterias.
  3. Centrifugar el caldo bacteriano a 3.500 x g durante 15 min quitar el caldo LB. Resuspender las bacterias y ajustar el caldo bacteriano OD600 = 3.0 con medio S. Añadir 195 μl de caldo bacteriano en medio S a por lo menos 8 pocillos de una placa de 96 pocillos.
    Nota: Consulte el paso 1.6 para la composición del medio de S.
  4. Lave los gusanos L4 en la placa ENGM con e. coli OP5 con medio M9. Ajustar la solución de gusano a una concentración de 5 gusanos por μl y añadir 5 μl de la solución de gusano a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que hay aproximadamente 25 lombrices por pozo.
  5. Incubar la placa de 96 pocillos en un agitador a 200 rpm a 25 ° C.
  6. Contar el número de gusanos vivos y gusanos muertos después de 24, 48 y 72 h. calculan las tasas de supervivencia de cada pocillo con la siguiente fórmula: (Total gusanos vivos gusanos) × 100%.
  7. Dibujar un gráfico de diagrama de dispersión con el cálculo diario de datos.

5. ensayo de Necrosis de músculo de C. elegans con Aeromonas6

Nota: Para evitar la contaminación, estos pasos deben realizarse en campana de flujo laminar.

  1. En el día que los gusanos L1 se siembran en la ENGM extendido con e. coli OP50, escoge una sola Colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y e. coli OP50 cultura con 2 mL LB caldo cada a 37 ° C por 16 h.
    Nota: Aquí, se utilizaron las siguientes cepas de bacterias: e. coli OP50, la alimentación normal de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, el primer completamente secuenciado patógenos clínicos dhakensis a. aislar. A. hydrophila A2-066, A2-007 a. veronii y a. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativo del National Cheng Kung University Hospital.
  2. Medir la absorbancia de600 OD del caldo de bacterias y ajustar el caldo de las bacterias a OD600 = 2.0 con caldo LB. Punto y 30 μl de caldo bacteriano en las placas de NGM de 6 cm de extensión. La cultura las placas a temperatura ambiente durante la noche.
  3. En el día los gusanos L1 crecen hasta la etapa de L4, transferencia 50 gusanos en cada placa de NGM con cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o OP50 de e. coli . Incubar las placas NGM a 20 ° C. Transferencia de gusanos cada 24 h para placas NGM recién preparadas con bacterias.
  4. Tomar imágenes músculo utilizando un microscopio de fluorescencia.
    1. Seleccionar al azar 10 gusanos en un gel de agarosa al 2% en medio M9 en un portaobjetos. Paraliza los gusanos con 2 μl de azida de sodio al 1% en medio M9 en agarosa para menos de 5 minutos antes de tomar imágenes.
    2. Coloque un cubreobjetos y capturar las imágenes de músculo con un verde filtro de proteínas fluorescentes (GFP) en un microscopio de fluorescencia con cámara de dispositivo de carga acoplada. Capturar las imágenes de músculo a las 24, 48 y 72 h post la etapa L4.
  5. Realizar análisis y figura la preparación de imagen con un software de procesamiento de imágenes.
    Nota: Las definiciones de las puntuaciones y los niveles de daño muscular se muestran en la figura 3, para que los criterios son las siguientes: 3 puntos por falta de las fibras musculares; 2 puntos para las fibras de músculo rotas o quebradas; 1 punto para el doblado de las fibras musculares; 0 puntos para las fibras de músculo sanas.

6. estadísticos análisis

  1. Realizar todos los experimentos un mínimo de tres veces de forma independiente.
  2. Utilice el método de Kaplan-Meier para evaluar los ensayos de supervivencia de C. elegans y usar el test de log-rank en el análisis de las diferencias de supervivencia. Establecer significancia estadística al 0.05.
  3. Utilizar la prueba t de Student para analizar los resultados estadísticos de los ensayos de toxicidad líquida de C. elegans a los dos grupos diferentes. Utilice la prueba ANOVA unidireccional en el análisis de las diferencias entre tres o más valores de una variable independiente. Establecer significancia estadística al 0.05.

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Representative Results

Siguiendo los protocolos descritos anteriormente, es fácil diferenciar la toxicidad de las cuatro cepas de Aeromonas . El ensayo de supervivencia de C. elegans se muestra en la figura 1. Las tasas de supervivencia de C. elegans infectados con especies de Aeromonas , se muestra en la orden de alta a la baja fueron: a. caviae, a. veronii y a. hydrophila y a. dhakensis. Aunque existe diversidad en cuanto a la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas , las tasas de supervivencia de C. elegans, en promedio, mostraron mayor mortalidad entre los gusanos infectados con a. dhakensis. La virulencia de a. hydrophila fue inferior a la de a. dhakensis (p < 0.01). En contraste con dhakensis a. y a. hydrophila,el virulences atenuadas de a. caviae y a. veronii se observaron en el ensayo de supervivencia de C. elegans . La diversidad de las tasas de supervivencia de C. elegans infectados con diferentes especies de Aeromonas es consistente con las observaciones clínicas de Aeromonas infección7.

Los resultados del ensayo de toxicidad líquida de C. elegans se muestran en la figura 2. Con el tiempo de infección, el número de gusanos que disminuyó significativamente cuando C. elegans fue infectado con a. dhakensis o : a. hydrophila. La tasa de supervivencia de los gusanos infectados con a. dhakensis fue inferior a los infectados con a. hydrophila. En contraste, los grupos infectados con a. veronii o a. caviae tuvieron tasas de supervivencia en cada punto de tiempo en comparación con dhakensis a. y a. hydrophila. Las tendencias de las tasas de supervivencia de C. elegans en el ensayo de toxicidad líquida que representa a la virulencia de las diferentes especies de Aeromonas son similares a los observados en el análisis de supervivencia.

En el ensayo de necrosis de músculo de C. elegans , primero clasificar los niveles de daño muscular y asigna puntajes según los niveles correspondientes. Se proporcionan las definiciones de la puntuación y los niveles de daño muscular en la figura 3. Los criterios de puntuación para cada nivel de daño muscular es el siguiente: 0 puntos para las fibras de músculo sanas; 1 punto para el doblado de las fibras musculares; 2 puntos para las fibras de músculo rotas o quebradas; 3 puntos para la pérdida de fibras musculares. Los resultados de la necrosis del músculo de C. elegans ensayo en Aeromonas infectados -C. elegans se muestra en la figura 4. Los grados de daño muscular varían entre las especies de Aeromonas . Los niveles de músculo dañan distancia en orden de leve a severa como sigue: a. caviae, a. veronii y a. hydrophila y a. dhakensis en cada momento. En contraste con : a. hydrophila y a. dhakensis, necrosis del músculo no era obvia en gusanos infectados con a. caviae y a. veronii. La mayoría de los gusanos infectados con a. caviae y a. veronii se registraron como 0 puntos. C. elegans infectados con a. hydrophila o dhakensis a. exhibieron daño muscular severo. De la nota, la mayoría de los gusanos infectados con a. dhakensis demostró músculo daños graduada ≥ 2 puntos. El grado de necrosis del músculo de C. elegans infectados con a. dhakensis fue más grave en términos de un mayor porcentaje de puntuación ≥ 2 puntos en comparación con : a. hydrophila. La severidad de la necrosis del músculo en las especies de Aeromonas 4 correlacionada con los resultados de los ensayos de toxicidad de la supervivencia y el líquido.

Los métodos descritos ofrecen una manera conveniente para distinguir diversidad de virulencia entre y dentro de las especies de Aeromonas . Además, este es un modelo confiable por que estudiar la interacción entre el patógeno y huésped.

Figure 1
Figura 1 : Las curvas de supervivencia de C. elegans. El análisis de supervivencia muestra las toxicidades diversas de diferentes especies de Aeromonas en C. elegans (**: P < 0.01; *: P < 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : La tasa de supervivencia de C. elegans del ensayo de toxicidad líquida. El ensayo de toxicidad líquida muestra la diferente toxicidad de distintas especies de Aeromonas en C. elegans. En (A) 24 h, (B) 48 h y (C) 72 horas post infección por Aeromonas , C. elegans infectados con a. dhakensis tiene la tasa más baja de supervivencia. El resultado sugiere que a. dhakensis es la especie más tóxica de Aeromonas a C. elegans (***: P < 0.001; **: P < 0.01, barras de Error: desviación estándar, SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Los puntajes correspondientes para la necrosis muscular en C. elegans inducida por infección por Aeromonas . Los criterios de necrosis del músculo y las puntuaciones correspondientes son como sigue: 3 puntos por falta de las fibras musculares; 2 puntos para las fibras de músculo rotas o quebradas; 1 punto para el doblado de las fibras musculares; 0 puntos para las fibras de músculo sanas. Doblado las fibras musculares (flechas), rotas fibras musculares (flecha) y fibras musculares falta (estrella) se indican. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Las puntuaciones de necrosis de músculo de C. elegans . Las puntuaciones de necrosis de músculo muestran las toxicidades diversas de diferentes especies de Aeromonas en C. elegans. En (A) 24 h, (B) 48 h y (C) 72 horas post infección por Aeromonas , el daño del músculo del C. elegans es la más severa de infección con a. dhakensis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución Preparación
Tampón fosfato Disolver 119,35 g de KH2PO4 y 21,43 g de K2HPO4, en 1 L agua desionizada.
Autoclave a 121 ° C por 20 min
Ajustar el pH a pH = 6.0 con KOH.
Espere hasta que haya enfriado a temperatura ambiente
S Basal Disolver 6 g KH2PO4y 5,85 g de NaCl y 1 g K2HPO4 en 1 L de agua desionizada.
Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
Espere hasta que haya enfriado a temperatura ambiente.
Citrato de potasio de 1 M Disolver 4 g acid•H cítrico2O y 58,7 g tri-potasio citrate•H2O 0,2 ml de agua desionizada.
Ajustar el pH a pH = 6.0.
Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
Espere hasta que haya enfriado a temperatura ambiente.
Solución de metales traza Disolver disódico 1,86 g de EDTA, 0,69 g FeSO4•7 H2O, 0,2 g MnCl2• 4 H2O, 0,29 g de ZnSO4•7 H2O,
0,025 g CuSO45 H2O en 1 L desionizada agua.
Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
Espere hasta que haya enfriado a temperatura ambiente
Mantener la solución en la oscuridad.
Caldo LB Disolver 10 g de NaCl y 10 g triptona Extracto de levadura 5 g en 1 L de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
Espere hasta que haya enfriado a temperatura ambiente.

Tabla 1: Preparación de solución.

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Discussion

C. elegans es un nematodo de bacterivorous que naturalmente las bacterias de las tomas como alimento y ha desarrollado una inmunidad innata complicado a las bacterias durante su proceso evolutivo. Dos de los principales órganos mantener y apoyar la inmunidad son la epidermis y el intestino9,13. La epidermis y bandas de músculo de C. elegans se asemejan a las estructuras de tejido blando en los mamíferos y los seres humanos6. Debido a estas características, C. elegans es aplicable como un organismo modelo para estudiar la patogenesia de la infección por Aeromonas .

Aquí, presentamos tres métodos para examinar infección por Aeromonas en C. elegans que son representativos de la diversa toxicidad entre 4 especies de Aeromonas y se correlacionan con la observación clínica7. Estos métodos convenientes distinguen los diferentes grados de toxicidad entre las especies de Aeromonas . Utilizando estos métodos, los investigadores pueden estudiar la virulencia de las diferentes especies de Aeromonas y el mecanismo de defensa de los ejércitos sobre la infección por Aeromonas .

En estos tres métodos, C. elegans actúa como un depredador, pero también como una presa de Aeromonas. Si los gusanos no están en condiciones sanas antes de la prueba, los resultados de la interacción huésped-patógeno será diferentes. Por lo tanto, es importante tener mucho cuidado al manipular el C. elegans. Para evitar daños excesivos a los huevos de C. elegans en el paso de la sincronización, asegúrese de observar continuamente la liberación de óvulos. Una vez que los huevos se dañan, disminuirá en gran medida el número de eclosión de huevos de C. elegans . Aunque los huevos dañados eclosionan con éxito, los gusanos son propensos a tener problemas de desarrollo. Por lo tanto, es fundamental para paso completo 2.3 dentro de 6 minutos después de que los gusanos están expuestos a NaOCl y KOH.

Los tres métodos descritos anteriormente muestran resultados coherentes sobre la toxicidad de Aeromonas en C. elegans, incluyendo dos experimentos diferentes, medir las tasas de supervivencia de C. elegans debajo de infección por Aeromonas y observando el cambio morfológico del músculo. La prueba de virulencia usando métodos diseñados para diferentes puede dar diversos resultados. Por ejemplo, los científicos ya han observado diferentes resultados en placa de C. elegans y líquido ensayos de14. En nuestra investigación encontramos también hubo discrepancia existente entre estos dos análisis9. Se cree que el ambiente externo influencia virulencia del patógeno, y los investigadores deben encontrar las condiciones óptimas para explorar el mecanismo de virulencia. Desde otra perspectiva, merece la pena estudiar y entender los mecanismos subyacentes en la condición específica de la infección.

En este trabajo, hemos establecido un modelo de infección en C. elegans para estudiar la virulencia de Aeromonas y la correspondiente respuesta de host después de la infección. Estos tres métodos se podrían aplicar para estudiar las otras especies de Aeromonas más allá de las 4 especies en el presente estudio. Además, estos enfoques proporcionará una plataforma para estudiar el mecanismo subyacente responsable de la necrosis del músculo inducida por infección bacteriana y para el desarrollo de terapias potenciales para mejorar los resultados clínicos de las infecciones graves de tejidos blandos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Estamos muy agradecidos por la ayuda de la instalación de base de C. elegans en Taiwán y en la microbiología de diagnóstico y aísla los antimicrobianos resistencia laboratorio de nacional Cheng Kung University Hospital para proporcionar la Aeromonas . También reconocemos el centro de genética de Caenorhabditis (CGC) y la WormBase. También agradecemos a Savana Moore para editar el manuscrito.

Este estudio fue parcialmente financiado por becas del Ministerio de ciencia y tecnología de Taiwán (más 105-2628-B-006-017-MY3) y el Hospital de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKUH-10705001) a P.L. Chen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shaker incubator YIH DER LM-570R Bacteria incubation
K2HPO4 J.T.Baker MP021519455 Culture medium preparation 
KH2PO4 J.T.Baker 3246-05 Culture medium preparation 
Na2HPO4 J.T.Baker MP021914405 Culture medium preparation 
NaCl SIGMA 31434 Culture medium preparation 
MgSO4 SIGMA M7506 Culture medium preparation 
agar Difco 214530 Culture medium preparation 
CaCl2 SIGMA C1016 Culture medium preparation 
cholesterol SIGMA C8503 Culture medium preparation 
ethanol SIGMA 32205 Culture medium preparation 
KOH SIGMA P5958 Culture medium preparation 
6 cm Petri plate ALPHA PLUS 46 agar plate preparation
96-well plate FALCON 353072 liquid assay
bacterial peptone Affymetrix/USB AAJ20048P2 Culture medium preparation 
yeast extract SIGMA 92144 Culture medium preparation 
citric acid•H2O SIGMA C1909 Culture medium preparation 
tri-potassium citrate•H2O SIGMA 104956 Culture medium preparation 
FudR  SIGMA 1271008 Culture medium preparation 
disodium EDTA SIGMA E1644 Culture medium preparation 
FeSO4•7 H2O SIGMA 215422 Culture medium preparation 
MnCl2•4 H2O SIGMA 221279 Culture medium preparation 
ZnSO4•7 H2O SIGMA 204986 Culture medium preparation 
CuSO4•5 H2O SIGMA C8027 Culture medium preparation 
tryptone SIGMA 16922 Culture medium preparation 
Microscope system Nikon  Eclipase Ti inverted  microscope imaging
Scientific CCD Camera QImaging  Retiga-2000R Fast 1394  microscope imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Inmunología e infección número 142 Aeromonas dhakensis Aeromonas hydrophila Aeromonas caviae Aeromonas veronii elegans de Caenorhabditis infección bacteriana ensayo de toxicidad líquidos análisis de supervivencia Ensayo de la necrosis del músculo.
Evaluación de la virulencia y patogenia de la infección por <em>Aeromonas</em> en un modelo <em>elegans de Caenorhabditis</em>
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Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., … More

Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model. J. Vis. Exp. (142), e58768, doi:10.3791/58768 (2018).

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