Summary
Hier introduceren we drie verschillende experimenten te studeren Aeromonas infectie in C. elegans. Met behulp van deze handige methoden, is het gemakkelijk om te evalueren van de toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas .
Abstract
De menselijke pathogenen Aeromonas is klinisch aangetoond dat het veroorzaken van gastro-enteritis, wond infecties, sepsis en urineweginfecties. Meest menselijke ziekten zijn gemeld te worden geassocieerd met vier soorten bacteriën: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniien Aeromonas caviae. De model-organisme Caenorhabditis elegans is een Bacterivoor waarmee een uitstekende infectie model voor het bestuderen van de bacteriële pathogenese van Aeromonas. Hier introduceren we drie verschillende experimenten te studeren Aeromonas infectie met behulp van een C. elegans -model, met inbegrip van overleven, vloeibare toxiciteit en spier necrose testen. De resultaten van de drie methoden voor het bepalen van de virulentie van Aeromonas waren consistent. A. dhakensis bleek te zijn de giftigste onder de 4 grote Aeromonas soorten klinische infecties veroorzaken. Deze methoden worden weergegeven als een handige manier om de evaluatie van de toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas en bijdragen aan ons begrip van de pathogenese van Aeromonas infectie.
Introduction
De menselijke pathogenen, Aeromonas, is klinisch aangetoond dat het veroorzaken van gastro-enteritis, wond infecties, bloedvergiftiging en1,2van de infecties van de urinewegen. Meest geassocieerde ziekten bij de mens zijn gemeld te worden geassocieerd met vier bacteriële soorten: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniien Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. onder Aeromonas besmettelijke ziekten, infecties van het zachte weefsel kunnen leiden tot ernstige morbiditeit en mortaliteit bij de mens. Van de nota is spieren necrose de meest ernstige vorm van weke delen-infectie6. Observatie van de overleving, spieren necrose van Caenorhabditis elegans na infectie is een handige methode om te speculeren op de toxiciteit van Aeromonas.
Wetenschappers hebben al talrijke modelorganismen om te bestuderen van bacteriële infecties ontwikkeld. In eerdere studies, werden muizen, zebrafishes en nematoden gebruikt als diermodellen om de pathogenese en de virulentie van Aeromonas6,7,8te studeren. Elke diermodel heeft haar ' voordelen en toepassingen. De model-organisme, Caenorhabditis elegans, is een nematode bacterivorous welke inname bacteriën als foodnaturally. C. elegansheeft ontwikkeld een ingewikkeld ingeboren immune systeem tegen bacteriële infecties in de loop van de evolutie. Onder de stress van een bacteriële infectie, heeft C. elegans bewezen een uitstekende infectie model te bestuderen van de bacteriële pathogenese van Aeromonas6,7,9 en andere ziekteverwekkers Als de schimmel10 en enterohemorragische Escherichia coli O157:H711. Er is echter nog steeds geen publicatie die zich op de methodologie richt bij het gebruik van C. elegans als een model voor het bestuderen van de virulentie van Aeromonas.
Hier introduceren we drie verschillende experimenten te studeren Aeromonas infectie met C. elegans als een dierlijk model: testen voor overleving, vloeibare toxiciteit en spier necrose. Deze methoden zijn een handige manier voor evaluatie van de toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas en verbetering van het inzicht van de pathogenese van Aeromonas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de voedingsbodem
Opmerking: Zie tabel 1 voor de voorbereiding van de oplossing.
- Los om te bereiden M9 middellange12, 1.5 g van KH2PO4, 5.66 g nb2HPO4en 2,5 g NaCl in 500 mL gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten wachten tot afgekoeld tot kamertemperatuur en Voeg 0,5 mL 1 M MgSO4 vóór eerste gebruik.
- Los om te bereiden nematode groei medium (NGM)12, 3 g NaCl, 2,5 g bacteriële pepton en 20 gram agar in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. wacht totdat afgekoeld tot 55 ° C in een waterbad en voeg vervolgens 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL van de 1 M MgSO4, 1 mL 5% cholesterol in ethanol en 25 mL fosfaatbuffer. Swirl aan meng goed.
- Giet ongeveer 5 mL NGM in elk 6 cm petrischaal. Vermijd zeepbel productie op het oppervlak van de plaat. Laat de platen bij kamertemperatuur voor 1 nacht en pakket te slaan bij 4 ° C. Breng terug op kamertemperatuur voordat gebruik.
- Ter voorbereiding van verrijkte NGM (ENGM), Los 3 g NaCl, bacteriële pepton 5 g en 1 g gistextract 30 g agar in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. wacht totdat afgekoeld tot 55 ° C in een waterbad en voeg 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL van de 1 M MgSO4, 1 mL 5% cholesterol in ethanol en 25 mL fosfaatbuffer. Swirl aan meng goed.
- Giet ongeveer 10 mL ENGM in elke 9 cm petrischaal. Vermijd zeepbel productie op het oppervlak van de plaat. Laat de platen bij kamertemperatuur voor 1 nacht en pakket te slaan bij 4 ° C. Breng op kamertemperatuur vóór gebruik.
- Te bereiden S middellange12mix 40 mL S basale, 0.4 mL 1 M kaliumcitraat, metalen 0.4 mL trace oplossing, 0,12 mL 0,12 mL 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, 40 µL van 5% cholesterol in ethanol en 1 mL van 8 mM FudR vóór gebruik.
2. synchronisatie van C. elegans6,9,12
- Wassen ongeveer 2.000 wormen in de fase van de gravid-volwassene met 10 mL steriel gedeïoniseerd water in een tube van 15 mL. Spoelen de bacteriën 3 x, de wormen houden aan de onderkant van de buis.
- Centrifugeer het monster voor 1 min bij 500 x g te trekken van de wormen. Verwijder het supernatant en houden de wormen in 3,5 mL gedeïoniseerd water.
- Voeg 1 mL NaOCl (10-15%) en 0,5 mL 5 M KOH in de buis. Mix gelijkmatig door schudden voor < 6 min lyse van de organen van de worm.
- Nadat de eieren zijn vrijgesteld van de wormen, voeg toe 10 mL gedeïoniseerd water om te stoppen met de lysis. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.200 x g pull-down de eieren en het verwijderen van het supernatans dat zo veel mogelijk. Wassen met 15 mL M9 middellange minstens 3 x.
Opmerking: Zie stap 1.1 voor de samenstelling van M9 medium. - Eieren in 1 mL M9 medium houden. Transport van eieren naar een 3,5 cm schotel voor incubatie gedurende één nacht (ongeveer 12-18 h) bij 20 ° C.
Opmerking: Na de incubatie, de eieren zullen uitkomen om de worm larve die wordt genoemd als eerste stadium van de larve (L1). - Pipetteer uit 10 µL van L1 wormen in M9 medium. Worm tellen en bereken dat de concentratie van L1 wormen in M9 medium.
- Zaad hooguit 10.000 geïncubeerd L1 fase wormen met een pipet op een 9 cm ENGM plaat verspreid met Escherichia coli OP50.
- In deze stap gekweekt verspreiding 0,5 mL's nachts E. coli OP50 met Luria Bertani (LB) Bouillon op de plaat van de ENGM 9 cm. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 16 tot 18 h
Opmerking: Om besmetting te voorkomen, de verspreiding stap moet worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap. - Afkoelen tot kamertemperatuur alvorens het zaaien van L1 wormen. Zaad hooguit 10.000 geïncubeerd L1 fase wormen op de ENGM plaat met E. coli OP50.
- In deze stap gekweekt verspreiding 0,5 mL's nachts E. coli OP50 met Luria Bertani (LB) Bouillon op de plaat van de ENGM 9 cm. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 16 tot 18 h
- Incubeer de wormen bij 20 ° C voor 44 h of totdat ze naar de 4th larve (L4) fase groeien.
Opmerking: Zie stap 1.3 voor de samenstelling van ENGM medium. Een worm is een witte stip in halve maan vorm in het midden van de kant van het lichaam in de L4-stadium. - Gebruik de gesynchroniseerde L4 fase in de volgende tests wormen. Wild type die N2 in de kwantitatieve analyse van C. elegans , overleven met Aeromonas dhakensis en de kwantitatieve analyse van C. elegans , vloeibare toxiciteit met Aeromonas dhakensis wormengebruiken. Gebruik RW1596 wormen (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) in de C. elegans spier necrose assay met Aeromonas dhakensis.
3. C. elegans Survival Assay met Aeromonas6,9
- Kies een één kolonie van elk van de vier Aeromonas stammen of E. coli OP50 en cultuur met de pond-Bouillon 2 mL respectievelijk bij 37 ° C gedurende 16 uur op de dag van L1 wormen op het verspreiden met E. coli OP50 ENGM zaaien.
Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moet deze stap worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap. Hier, de volgende bacteriestammen werden gebruikt: E. coli OP50, de normale voedselbron van C. elegans. A. dhakensis AAK1, de eerste gesequenced pathogene klinische A. dhakensis isoleren. A. hydrophila A2-066, A2-007 A. veronii en A. caviae A2-9307121 zijn representatief klinische isolaten van National Cheng Kung University Hospital. - Meet de extinctie van de600 OD van bacteriële Bouillon en aanpassen van de bacteriële Bouillon OD600 = 2.0 met de pond-Bouillon.
- Ter plaatse en verspreid 30 µL van bacteriële Bouillon elke 6 cm NGM plaat. De platen bij kamertemperatuur 's nachts cultuur.
Opmerking: Zie stap 1.2 voor de samenstelling van NGM medium. - Op de dag dat de L1 wormen naar het werkgebied L4 groeien, willekeurig plukken en 50 wormen overbrengen in een NGM plaat met elk van de vier Aeromonas stammen of E. coli OP50.
- Incubeer de platen van de NGM bij 20 ° C, totdat de test is voltooid.
- Elke dag tot de laatste worm dood is alle de levende wormen naar een nieuw bereid NGM plaat met bacteriën en tellen het aantal, dood leven, en sensor wormen overbrengen.
Opmerking: Overbrengen van wormen naar een vers voorbereid NGM plaat elke dag voor het onderhoud van infectie, zelfs als met behulp van steriele wormen (b.v.glp-4, of met FudR). - De curven van de overleving gebaseerd op de dagelijkse berekening van de gegevens worden uitgezet.
4. C. elegans vloeibare toxiciteit Assay met Aeromonas7
Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moeten stappen worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
- De dag na het zaaien van de L1 wormen op de plaat van de ENGM uitbreiden met E. coli OP50, kies een één kolonie van elk van de vier Aeromonas stammen E. coli OP50 en cultuur met 5 mL de pond-Bouillon elke bij 37 ° C gedurende 16 uur.
Opmerking: In het protocol, werden de volgende bacteriën stammen gebruikt: E. coli OP50, de normale voedselbron van C. elegans. A. dhakensis AAK1, de eerste gesequenced pathogene klinische A. dhakensis isoleren. A. hydrophila A2-066, A2-007 A. veronii en A. caviae A2-9307121 zijn representatief klinische isolaten van National Cheng Kung University Hospital. - Meet de extinctie van de600 OD van de bacteriën Bouillon.
- Centrifugeer de bacteriële Bouillon bij 3500 x g gedurende 15 minuten te verwijderen van de pond-Bouillon. Resuspendeer de bacteriën en aanpassen van de bacteriële Bouillon OD600 = 3.0 met S medium. Voeg 195 µL van bacteriële Bouillon in S middellange tot ten minste 8 wells van een 96-wells-plaat.
Opmerking: Zie stap 1.6 voor de samenstelling van S medium. - De wormen L4 op de plaat van de ENGM met E. coli OP5 M9 medium met afwassen. Pas de worm oplossing tot een concentratie van 5 wormen per µL en 5 µL van de worm-oplossing toevoegen aan elk putje van de 96-wells-plaat. Ervoor zorgen dat er ongeveer 25 wormen per putje.
- Incubeer de 96-wells-plaat op een shaker bij 200 t/min bij 25 ° C.
- Het aantal levende wormen en dode wormen na 24, 48 en 72 h. de overlevingscijfers van elk putje met de volgende formule Bereken: (levende wormen/totaal worms) × 100%.
- Teken een spreidingsgrafiek plot met de berekening van de dagelijkse gegevens.
5. C. elegans spier necrose Assay met Aeromonas6
Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moeten deze stappen worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
- Op de dag de L1-wormen worden overgeënt op de ENGM verspreid met E. coli OP50, kies een één kolonie van elk van de vier Aeromonas stammen E. coli OP50 en cultuur met 2 mL LB Bouillon, elke bij 37 ° C gedurende 16 uur.
Opmerking: Hier, de volgende bacteriën stammen werden gebruikt: E. coli OP50, de normale voedselbron van C. elegans. A. dhakensis AAK1, de eerste gesequenced pathogene klinische A. dhakensis isoleren. A. hydrophila A2-066, A2-007 A. veronii en A. caviae A2-9307121 zijn representatief klinische isolaten van National Cheng Kung University Hospital. - Meet de extinctie van de600 OD van de bacteriën Bouillon en aanpassen van de bacteriën Bouillon OD600 = 2.0 met de pond-Bouillon. Ter plaatse en verspreiden van 30 µL van bacteriële Bouillon op 6 cm NGM platen. De platen bij kamertemperatuur 's nachts cultuur.
- Op de dag groeien de wormen van L1 naar de L4-fase, de 50 wormen overdracht aan elke NGM plaat met elk van de vier Aeromonas stammen of E. coli OP50. Incubeer de platen NGM bij 20 ° C. Wormen elke 24 h overbrengen in nieuw bereid NGM platen met bacteriën.
- Het nemen van beelden van de spier met behulp van een fluorescentie Microscoop.
- Keuze willekeurig 10 wormen op een 2% agarose gel in M9 medium op een dia. De wormen met 2 µL van 1% natriumazide M9 medium op agarose voor minder dan 5 min voordat de opnamen te verlammen.
- Plaats een cover slip en vastleggen van de beelden van de spier met behulp van een groen fluorescente proteïne (GFP) filteren op een fluorescente microscoop met charge - coupled apparaat camera. Vastleggen van de beelden van de spier op 24, 48, en 72 uur na de L4-fase.
- Voeren beeld-analyse en figuur voorbereiding met een beeld processing software.
Opmerking: De definities van de scores en de spier schade niveaus worden weergegeven in Figuur 3, waarvan de criteria als volgt worden weergegeven: 3 punten voor ontbrekende spiervezels; 2 punten voor gescheurde of gebroken spiervezels; 1 punt voor gebogen spiervezels; 0 punten voor gezonde spiervezels.
6. statistische Analyses
- Voer alle experimenten minimaal drie keer onafhankelijk.
- Gebruik de methode Kaplan-Meier te beoordelen van de C. elegans overleving testen, en de log-rank test in het analyseren van overleving verschillen. Statistische significantie vastgesteldop 0.05.
- Van de Student t-test gebruiken om de statistische resultaten van de tests van C. elegans vloeibare toxiciteit voor de twee verschillende groepen te analyseren. One-way ANOVA-test in het analyseren van de verschillen tussen drie of meer waarden voor één onafhankelijke variabele gebruiken. Statistische significantie vastgesteldop 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door het volgen van de bovenstaande protocollen, is het gemakkelijk om te differentiëren tussen de toxicities van de vier Aeromonas stammen. De bepaling van de overleving van de C. elegans is afgebeeld in Figuur 1. De overlevingskansen bij C. elegans besmet met Aeromonas soorten, weergegeven in volgorde van hoog naar laag waren: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila, en A. dhakensis. Hoewel er diversiteit op het gebied van toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas is , toonde de overlevingskansen bij C. elegans, gemiddeld, hoogste sterfte onder de wormen geïnfecteerd met A. dhakensis. De virulentie van de A. hydrophila inferieur aan die van A. dhakensis (p < 0,01) was. In tegenstelling tot A. dhakensis en A. hydrophila,werden het verzwakte virulences van A. veronii en A. caviae vastgesteld bij de bepaling van de overleving C. elegans . De diversiteit van de overlevingskansen van C. elegans besmet met verschillende soorten Aeromonas strookt met klinische waarnemingen van Aeromonas infectie7.
De resultaten van de bepaling van de vloeibare toxiciteit van C. elegans worden weergegeven in Figuur 2. Met de tijd van infectie, worden de nummers van de wormen die overleefd aanzienlijk afgenomen wanneer C. elegans watertje septisch met A. dhakensis of A. hydrophila. De overlevingskansen van de wormen geïnfecteerd met A. dhakensis was inferieur aan degenen die besmet zijn met A. hydrophila. Daarentegen had de groepen geïnfecteerd met A. veronii of A. caviae hogere overlevingskans van de patiënt op elke tijdstip ten opzichte van A. dhakensis en A. hydrophila. De trends van de overlevingskansen van C. elegans in de bepaling van de toxiciteit van de vloeibare vertegenwoordigen de virulentie van verschillende plantensoorten, Aeromonas zijn vergelijkbaar met die bij de bepaling van de overleving waargenomen.
In de C. elegans spier necrose assay, we eerst de niveaus van spier schade ingedeeld en gekenmerkt met scores volgens de overeenkomstige niveaus. De definities van de score en de spier schade niveaus vindt u in Figuur 3. De scorende criteria voor elke spier schade niveau is als volgt: 0 punten voor gezonde spiervezels; 1 punt voor gebogen spiervezels; 2 punten voor gescheurde of gebroken spiervezels; 3 punten voor verlies van spiervezels. De resultaten van de C. elegans spier necrose assay in Aeromonas besmette -C. elegans is afgebeeld in Figuur 4. De graden van spier schade varieerde tussen de Aeromonas -soorten. De niveaus van spier schade varieerden in volgorde van mild tot ernstige als volgt: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila, en A. dhakensis op elk tijdstip. In tegenstelling tot A. hydrophila en A. dhakensiswas spieren necrose niet duidelijk in wormen geïnfecteerd met A. caviae en A. veronii. Allermeest naar de wormen geïnfecteerd met A. caviae en A. veronii werden geregistreerd als 0 punten. C. elegans geïnfecteerd met A. hydrophila of A. dhakensis tentoongesteld ernstige spier schade. Van de nota, allermeest naar de wormen geïnfecteerd met A. dhakensis aangetoond spier schade ingedeeld ≥2 punten. De mate van spieren necrose van C. elegans besmet met A. dhakensis was meer ernstig in termen van een hoger percentage van scores ≥ 2 punten in vergelijking met A. hydrophila. De ernst van de spier necrose in de 4 Aeromonas soorten gecorreleerd met de bevindingen van de overleving en vloeistof toxiciteit testen.
De hierboven beschreven methoden bieden een handige manier om te differentiëren van virulentie diversiteit tussen en binnen soorten Aeromonas . Bovendien is dit een betrouwbaar model waarmee de interactie tussen een pathogeen en gastheer te bestuderen.
Figuur 1 : De curven van de overleving van C. elegans. De overleving assay toont de verschillende toxicities van verschillende plantensoorten, Aeromonas aan C. elegans (**: P < 0,01; *: P < 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : De overlevingskans van C. elegans van de vloeibare toxiciteit assay. De vloeibare toxiciteit assay toont de verschillende toxicities van verschillende soorten Aeromonas C. elegans. Op (A) 24 h, (B) 48 h, en (C) 72 h post Aeromonas infectie, C. elegans besmet met A. dhakensis heeft de laagste overlevingskansen. Het resultaat blijkt dat A. dhakensis de giftigste Aeromonas doelsoorten C. elegans is (***: P < 0.001; **: P < 0,01, foutbalken: standaarddeviatie, SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : De bijbehorende scores voor spieren necrose in C. elegans geïnduceerd door Aeromonas infectie. De criteria voor spieren necrose en bijbehorende scores zijn als volgt: 3 punten voor ontbrekende spiervezels; 2 punten voor gescheurde of gebroken spiervezels; 1 punt voor gebogen spiervezels; 0 punten voor gezonde spiervezels. Gebogen spiervezels (pijlen), gescheurde spiervezels (pijlpunten) en ontbrekende spiervezels (ster) zijn aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : De C. elegans spier necrose scores. De spier necrose scores tonen de verschillende toxicities van verschillende plantensoorten, Aeromonas aan C. elegans. Op (A) 24 h, (B) 48 h, en (C) 72 h post Aeromonas infectie, de schade van C. elegans spier is de zwaarste van infectie met A. dhakensis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Oplossing | Voorbereiding |
| Fosfaatbuffer | Los 119.35 g KH2PO4 en 21.43 g K2HPO4, in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten Aanpassen van de pH-waarde tot pH = 6.0 met KOH. Wacht tot het afgekoeld tot kamertemperatuur |
| S basale | Ontbinden 5.85 g NaCl, 6 g KH2PO4en 1 g K2HPO4 in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Wacht tot het afgekoeld tot kamertemperatuur. |
| 1 M kaliumcitraat | Los 4 g citroenzuur acid•H2O en 58.7 g tri-kalium citrate•H2O in 0,2 mL gedeïoniseerd water. Aanpassen van de pH-waarde tot pH = 6.0. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Wacht tot het afgekoeld tot kamertemperatuur. |
| Trace metalen oplossing | Ontbinden van 1,86 g Dinatrium-EDTA, 0,69 g FeSO4•7 H2O, 0.2 g MnCl2• Teletekstverbeteringen: 4 H2O, 0.29 g ZnSO4•7 H2O, 0,025 g CuSO4•5 H2O in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Wacht tot het afgekoeld tot kamertemperatuur Bewaar deze oplossing in het donker. |
| De pond-Bouillon | Los 10 g NaCl, 10 g trypton en 5 g gistextract in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Wacht tot het afgekoeld tot kamertemperatuur. |
Tabel 1: Oplossing voorbereiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans is een nematode bacterivorous dat natuurlijk inname bacteriën als voedsel en een ingewikkeld aangeboren immuniteit voor bacteriën tijdens de evolutionaire proces heeft ontwikkeld. Twee van de belangrijke organen, onderhouden en ondersteunen van de immuniteit zijn de opperhuid en darm9,-13. De epidermis en de bands van spier van C. elegans lijken op de structuren van de soft-weefsel in zoogdieren en mensen6. Vanwege deze kenmerken geldt C. elegans als een modelorganisme voor het bestuderen van de pathogenese van Aeromonas infectie.
Hier presenteren wij drie methoden voor de behandeling van Aeromonas infectie in C. elegans die representatief zijn voor de diverse toxiciteit onder 4 Aeromonas soorten en zijn gecorreleerd met klinische observatie7. Deze handige methoden onderscheiden de verschillende graden van toxiciteit onder de Aeromonas -soorten. Met behulp van deze methoden kunnen onderzoekers bestuderen de virulentie van verschillende plantensoorten, Aeromonas en het verdedigende mechanisme van hosts op Aeromonas infectie.
In deze drie methoden fungeert C. elegans niet alleen als een roofdier, maar ook als een prooi van Aeromonas. Als de wormen niet in gezonde conditie voor proef, zullen de resultaten van host-pathogen interactions anders zijn. Het is dus belangrijk om zeer voorzichtig bij het bewerken van C. elegans. Om te voorkomen dat buitensporige schade aan de eieren van C. elegans in de synchroniseren stap, moet voortdurend observeren van de release van eieren. Zodra de eieren zijn beschadigd, zal grotendeels de broedeieren aantal C. elegans eieren afnemen. Zelfs als de beschadigde eitjes met succes, zijn de wormen waarschijnlijk ontwikkelingsproblemen. Daarom is het cruciaal voor volledige stap 2.3 binnen 6 minuten nadat de wormen worden blootgesteld aan NaOCl en KOH.
De drie hierboven beschreven methoden Showresultaten samenhangende op de Aeromonas toxicities aan C. elegans, met inbegrip van twee verschillende experimenten voor het meten van de overlevingskansen van C. elegans Aeromonas infectie, maar één observeren van de morfologische verandering van de spier. De test van de virulentie met verschillende ontworpen methoden kan verschillende resultaten opleveren. Bijvoorbeeld, wetenschappers hebben eerder waargenomen verschillende uitkomsten in C. elegans plaat en vloeistof testen14. In ons onderzoek vonden we ook was er een discrepantie bestaat tussen deze twee testen9. Het is van mening dat de externe omgeving de virulentie van het pathogene agens beïnvloedt, en de onderzoekers moeten vinden van de optimale omstandigheden om te verkennen de virulentie mechanisme. Vanuit een ander perspectief is het waard studeren en inzicht in de onderliggende mechanismen in specifieke toestand van infectie.
In dit werk vastgesteld wij het model van een infectie in C. elegans om te bestuderen de virulentie van Aeromonas en de bijbehorende host reactie na infectie. Deze drie methoden kunnen worden toegepast om te bestuderen van de andere Aeromonas soorten buiten de 4 soorten aangepakt in de huidige studie. Bovendien zorgt deze benaderingen een platform te bestuderen van het onderliggende mechanisme verantwoordelijk voor spieren necrose veroorzaakt door bacteriële infectie en om mogelijke therapieën ter verbetering van de klinische resultaten van ernstige weke delen infecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar voor de hulp uit de C. elegans kern facility in Taiwan en de diagnostische microbiologie en antimicrobiële resistentie laboratorium van nationale Cheng Kung universiteitsziekenhuis voor het verstrekken van de Aeromonas isoleert. We erkennen ook de Caenorhabditis genetica Center (CGC), en de WormBase. Wij danken ook Savana Moore voor het bewerken van het manuscript.
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het ministerie van wetenschap en technologie van Taiwan (meest 105-2628-B-006-017-MY3) en het nationale Cheng Kung universitair ziekenhuis (NCKUH-10705001) aan P.L. Chen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | Bacteria incubation |
| K2HPO4 | J.T.Baker | MP021519455 | Culture medium preparation |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-05 | Culture medium preparation |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | MP021914405 | Culture medium preparation |
| NaCl | SIGMA | 31434 | Culture medium preparation |
| MgSO4 | SIGMA | M7506 | Culture medium preparation |
| agar | Difco | 214530 | Culture medium preparation |
| CaCl2 | SIGMA | C1016 | Culture medium preparation |
| cholesterol | SIGMA | C8503 | Culture medium preparation |
| ethanol | SIGMA | 32205 | Culture medium preparation |
| KOH | SIGMA | P5958 | Culture medium preparation |
| 6 cm Petri plate | ALPHA PLUS | 46 | agar plate preparation |
| 96-well plate | FALCON | 353072 | liquid assay |
| bacterial peptone | Affymetrix/USB | AAJ20048P2 | Culture medium preparation |
| yeast extract | SIGMA | 92144 | Culture medium preparation |
| citric acid•H2O | SIGMA | C1909 | Culture medium preparation |
| tri-potassium citrate•H2O | SIGMA | 104956 | Culture medium preparation |
| FudR | SIGMA | 1271008 | Culture medium preparation |
| disodium EDTA | SIGMA | E1644 | Culture medium preparation |
| FeSO4•7 H2O | SIGMA | 215422 | Culture medium preparation |
| MnCl2•4 H2O | SIGMA | 221279 | Culture medium preparation |
| ZnSO4•7 H2O | SIGMA | 204986 | Culture medium preparation |
| CuSO4•5 H2O | SIGMA | C8027 | Culture medium preparation |
| tryptone | SIGMA | 16922 | Culture medium preparation |
| Microscope system | Nikon | Eclipase Ti inverted | microscope imaging |
| Scientific CCD Camera | QImaging | Retiga-2000R Fast 1394 | microscope imaging |
References
- Parker, J. L., Shaw, J. G. Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Biliary tract infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).
- Chuang, H. C., et al. Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia. Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).
- Chen, P. L., et al. A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 7, 2058 (2016).
- Chen, P. L., et al. Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences. PLoS One. 9 (11), 111213 (2014).
- Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila. Frontiers in Microbiology. 7, 1219 (2016).
- Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Immunology. 9, 774 (2018).
- Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens. Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Engelmann, I., Pujol, N. Innate immunity in C. elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).
- Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813 (2012).
