Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Évaluer la Virulence et la pathogenèse de l’Infection à Aeromonas dans un modèle de Caenorhabditis elegans

Published: December 20, 2018 doi: 10.3791/58768
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 2,4
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Internal Medicine, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Ici, nous présentons trois expériences différentes afin d’étudier les infection à Aeromonas chez c. elegans. En utilisant ces méthodes pratiques, il est facile d’évaluer la toxicité entre et au sein des espèces d’Aeromonas .

Abstract

L’agent pathogène humain Aeromonas a été cliniquement démontré provoque des gastro-entérites, infections de plaies, septicémie et infections des voies urinaires. Maladies plus humaines ont été signalés à être associés à quatre espèces de bactéries : Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniiet Aeromonas caviae. L’organisme modèle Caenorhabditis elegans est une communauté qui fournit un modèle d’infection excellent par pour l’étude de la pathogénie bactérienne d’Aeromonas. Ici, nous présentons trois expériences différentes afin d’étudier les infection à Aeromonas en utilisant un modèle de c. elegans , y compris la survie, la toxicité liquide et dosages de nécrose musculaire. Les résultats des trois méthodes de détermination de la virulence de Aeromonas concordaient. A. dhakensis s’est avéré être le plus toxique parmi les 4 principales espèces d’Aeromonas provoquant des infections cliniques. Ces méthodes semblent être un moyen pratique d’évaluer la toxicité entre et au sein des espèces d’Aeromonas et contribuer à notre compréhension de la pathogenèse de l’infection à Aeromonas .

Introduction

L’agent pathogène humain, Aeromonas, a été démontré cliniquement provoque des gastro-entérites, infections de plaies, septicémie et voies urinaires infections1,2. Plus des maladies humaines associées ont été signalés à être associés à quatre espèces bactériennes : Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniiet Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. parmi les maladies infectieuses Aeromonas , infections des tissus mous peuvent entraîner une morbidité et mortalité chez l’homme. Noter, nécrose musculaire est la forme la plus sévère d’infection des tissus mous6. Observation de la survie et la nécrose musculaire Caenorhabditis elegans après que infection est une méthode pratique permettant de spéculer la toxicité d’Aeromonas.

Les scientifiques ont déjà développé de nombreux organismes modèles pour l’étude des infections bactériennes. Dans des études précédentes, souris, zebrafishes et les nématodes ont servi des modèles animaux pour l’étude de la pathogénie et la virulence de Aeromonas6,7,8. Chaque modèle animal a ses « avantages et applications. L’organisme modèle, Caenorhabditis elegans, est un nématode scuticociliés quelles bactéries apports comme foodnaturally. C. elegansa mis au point un système compliqué d’immunitaire inné contre les infections bactériennes au cours de son évolution. Sous le stress d’une infection bactérienne, c. elegans s’est avéré pour être un modèle d’infection excellent pour l’étude de la pathogénie bactérienne de Aeromonas6,7,9 et d’autres agents pathogènes comme le champignon10 et entérohémorragique Escherichia coli O157 : H711. Cependant, il n’y a encore aucune publication qui met l’accent sur la méthodologie en utilisant le c. elegans comme modèle pour l’étude de la virulence de Aeromonas.

Ici, nous présentons trois expériences différentes afin d’étudier les infection à Aeromonas à l’aide de c. elegans comme modèle animal : dosages pour la survie, la toxicité liquide et nécrose musculaire. Ces méthodes sont un moyen pratique d’évaluer la toxicité entre et au sein des espèces d’Aeromonas et améliorer la compréhension de la pathogenèse de Aeromonas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. préparation du milieu de Culture

NOTE : Voir le tableau 1 pour la préparation de la solution.

  1. Pour préparer le M9 moyenne12, dissoudre 1,5 g de KH2PO4, 5,66 g Na2HPO4et 2,5 g de NaCl dans 500 mL d’eau désionisée. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min. attendez que refroidie à température ambiante et puis ajouter 0,5 mL de 1 M MgSO4 avant la première utilisation.
  2. Pour la préparation des nématodes de la croissance moyenne (NGM)12, dissoudre 3 g NaCl peptone bactérienne de 2,5 g et agar de 20 g dans 1 L d’eau déionisée. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min. attendez que refroidi à 55 ° C dans un bain d’eau et puis ajouter 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de cholestérol de 5 % dans l’éthanol et 25 mL de tampon phosphate. Tourbillon pour bien mélanger.
  3. Verser environ 5 mL de NGM dans chaque boîte de pétri de 6 cm. Éviter la production de bulles à la surface des tôles. Laisser les plaques à température ambiante pendant 1 nuit et paquet à conserver à 4 ° C. Ramener à température ambiante avant utilisation.
  4. Pour la préparation enrichie NGM (ENGM), dissoudre 3 g NaCl peptone bactérienne de 5 g, 1 g d’extrait de levure et agar 30 g dans 1 L d’eau déionisée. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min. attendez que refroidi à 55 ° C dans un bain d’eau et ajouter 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de cholestérol de 5 % dans l’éthanol et 25 mL de tampon phosphate. Tourbillon pour bien mélanger.
  5. Verser environ 10 mL ENGM dans chaque boîte de pétri de 9 cm. Éviter la production de bulles à la surface des tôles. Laisser les plaques à température ambiante pendant 1 nuit et paquet à conserver à 4 ° C. Ramener à température ambiante avant utilisation.
  6. Pour préparer S moyen12, citrate de potassium de 1 M 40 mL S basale, 0,4 mL de mélange, trace de 0,4 mL métaux solution, 0,12 mL de 1 M CaCl2, 0,12 mL de 1 M MgSO4, 40 µL de cholestérol de 5 % dans l’éthanol et 1 mL de 8 mM FudR avant utilisation.

2. synchronisation de c. elegans6,9,12

  1. Laver les vers environ 2 000 dans la phase d’adultes gravides avec 10 mL d’eau désionisée stérile dans un tube de 15 mL. Lavez les bactéries 3 x, garder les vers au fond du tube.
  2. Centrifuger l’échantillon pendant 1 min à 500 x g à tirer vers le bas les vers. Retirez le surnageant et garder les vers à 3,5 mL d’eau désionisée.
  3. Ajouter 1 mL de NaOCl (10 – 15 %) et 0,5 mL 5 M KOH dans le tube. Mélanger uniformément en brassant pour < 6 min à lyser les corps du ver.
  4. Après que les œufs sont libérés vers, ajouter 10 mL d’eau désionisée pour arrêter la lyse. Centrifuger pendant 1 min à 1 200 g pour tirer vers le bas les oeufs et éliminer le surnageant autant que possible. Laver avec 15 mL M9 moyenne au moins 3 x.
    Remarque : Reportez-vous à l’étape 1.1 pour la composition du milieu de M9.
  5. Conserver les oeufs dans un milieu 1 mL M9. Transport des oeufs dans un plat de 3,5 cm pour incubation à 20 ° C pendant une nuit (environ 12 à 18 h).
    Remarque : Après l’incubation, les œufs vont éclore pour la larve qui s’appelle le premier stade de larve (L1) à vis sans fin.
  6. Pipette à 10 µL de L1 vers dans un milieu M9. Compter le nombre de ver et calculer la concentration de L1 vers chez M9 moyen.
  7. Semences au plus 10 000 incubés worms de stade L1 avec une pipette sur une plaque ENGM 9 cm parsemé d’Escherichia coli OP50.
    1. Dans cette étape, tartinade 0,5 mL cultivé du jour au lendemain e. coli OP50 avec bouillon Luria-Bertani (LB) sur la plaque ENGM 9 cm. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 16-18 h
      Remarque : Pour éviter toute contamination, l’étape de propagation doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire.
    2. Refroidir à température ambiante avant de semer vers L1. Semences au plus 10 000 incubés vers stade L1 sur la plaque ENGM avec e. coli OP50.
  8. Incuber les vers à 20 ° C pour 44 h ou jusqu'à ce qu’ils cultivent le stade de larve (L4)th 4.
    Remarque : Voir l’étape 1.3 pour la composition du milieu ENGM. Un ver a un point blanc en forme de demi-lune au milieu du côté du corps au stade L4.
  9. Utilisez le L4 synchronisée étape vers de terre dans les épreuves suivantes. Utilisez le type sauvage que N2 vers de terre dans le test de survie de c. elegans avec Aeromonas dhakensis et le test de toxicité liquide c. elegans avec Aeromonas dhakensis. Utiliser les vers de RW1596 (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) dans l’essai de nécrose musculaire de c. elegans avec Aeromonas dhakensis.

3. test de survie c. elegans avec Aeromonas6,9

  1. Le jour de l’ensemencement L1 worms sur le ENGM étalé avec e. coli OP50, choisir une seule colonie de chacun des quatre souches d’Aeromonas ou e. coli OP50 et culture avec 2 mL du bouillon LB respectivement à 37 ° C pendant 16 h.
    Remarque : Pour éviter toute contamination, cette étape doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire. Ici, les souches bactériennes suivantes ont été utilisées : e. coli OP50, la source de nourriture normale de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, la première entièrement séquencé pathogènes cliniques dhakensis a. isoler. A. hydrophila A2-066, a. veronii A2-007 et a. caviae A2-9307121 sont des isolats cliniques représentative de la National Cheng Kung University Hospital.
  2. Mesurer l’absorbance de600 OD de bouillon bactérienne et ajuster le bouillon de culture bactérienne pour OD600 = 2.0 avec bouillon LB.
  3. Repérer et diffuser 30 µL de bouillon bactérienne chaque plaque NGM 6 cm. Culture du jour au lendemain les plaques à température ambiante.
    Remarque : Voir l’étape 1.2 pour la composition du milieu NGM.
  4. Le jour que les vers L1 croître sur la scène de L4, au hasard choisir et transfert 50 vers à une plaque NGM avec chacune des quatre souches d’Aeromonas ou e. coli OP50.
  5. Incuber les plaques NGM à 20 ° C jusqu'à ce que le test est terminé.
  6. Transférer tous les vers vivants à un NGM nouvellement préparé sur plaque avec des bactéries et comptent le nombre de vivants, morts, et le capteur vers chaque jour jusqu'à ce que le dernier ver est mort.
    Remarque : Transférer vers une plaque NGM fraîchement préparés chaque jour pour le maintien de l’infection, même si vers stérile à l’aide (p. ex.glp-4, ou avec FudR).
  7. Tracer les courbes de survie basés sur le calcul de données tous les jours.

4. analyse de toxicité liquide c. elegans avec Aeromonas7

Remarque : Pour éviter toute contamination, les étapes doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire.

  1. Le jour après l’ensemencement les vers L1 sur la plaque ENGM parsemée d’e. coli OP50, choisir une seule colonie de chacune des quatre souches d’Aeromonas et e. coli OP50 et culture 5 ml bouillon LB chaque à 37 ° C pendant 16 h.
    Remarque : Dans le protocole, les souches de bactéries suivantes ont été utilisées : e. coli OP50, la source de nourriture normale de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, la première entièrement séquencé pathogènes cliniques dhakensis a. isoler. A. hydrophila A2-066, a. veronii A2-007 et a. caviae A2-9307121 sont des isolats cliniques représentative de la National Cheng Kung University Hospital.
  2. Mesurer l’absorbance de600 OD du bouillon de bactéries.
  3. Centrifuger le bouillon bactérien à 3 500 x g pendant 15 min retirer le bouillon LB. Remettre en suspension les bactéries et ajuster le bouillon de culture bactérienne pour OD600 = 3.0 avec S moyenne. Ajouter 195 µL de bouillon bactérienne dans un milieu S au moins 8 puits d’une plaque de 96 puits.
    Remarque : Voir l’étape 1.6 pour la composition du milieu S.
  4. Laver les vers L4 sur la plaque ENGM avec e. coli OP5 utilisant le milieu M9. Ajuster la solution ver à une concentration de 5 vers par µL et ajouter 5 µL de la solution de ver dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Veiller à ce qu’il y a environ 25 vers par puits.
  5. Incuber la plaque 96 puits sur un agitateur à 200 tr/min à 25 ° C.
  6. Compter le nombre de vers vivants et les morts vers après 24, 48 et 72 h. calculent le taux de survie de chaque puits avec la formule suivante : (Live vers/Total vers) × 100 %.
  7. Dessiner un graphique de parcelle de nuages de points avec le calcul de données tous les jours.

5. c. elegans Muscle nécrose dosage avec Aeromonas6

Remarque : Pour éviter toute contamination, ces étapes doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire.

  1. Ce jour-là, les vers L1 sont ensemencées sur le ENGM parsemée d’e. coli OP50, prélever une colonie unique de chacun des quatre souches d’Aeromonas et e. coli OP50 et culture avec 2 mL LB de bouillon chaque à 37 ° C pendant 16 h.
    Remarque : Ici, les souches de bactéries suivantes ont été utilisées : e. coli OP50, la source de nourriture normale de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, la première entièrement séquencé pathogènes cliniques dhakensis a. isoler. A. hydrophila A2-066, a. veronii A2-007 et a. caviae A2-9307121 sont des isolats cliniques représentative de la National Cheng Kung University Hospital.
  2. Mesurer l’absorbance de600 OD du bouillon bactéries et ajuster le bouillon de bactéries à OD600 = 2.0 avec bouillon LB. Repérer et diffuser 30 µL de bouillon bactérienne sur des plaques NGM 6 cm. Culture du jour au lendemain les plaques à température ambiante.
  3. Ce jour-là les L1 vers atteignent le stade L4, transfert 50 vers pour chaque plaque NGM avec chacune des quatre souches d’Aeromonas ou e. coli OP50. Incuber les plaques NGM à 20 ° C. Transfert vers toutes les 24 h à plaques NGM nouvellement préparés avec des bactéries.
  4. Prendre des photos de muscle à l’aide d’un microscope à fluorescence.
    1. Choisir au hasard 10 vers sur un gel d’agarose de 2 % dans le milieu de la M9 sur une diapositive. Paralyser les vers en utilisant 2 µL de l’azide de sodium à 1 % dans le milieu de la M9 sur gel d’agarose pour moins de 5 min avant de prendre des images.
    2. Placez une lamelle couvre-objet et capturer les images de muscle à l’aide d’un vert protéine fluorescente (GFP) filtrer sur un microscope à fluorescence avec dispositif à couplage de charge caméra. Capturer les images de muscle à 24, 48 et 72 h après le stade L4.
  5. Mener des image analyse et figure la préparation avec une logiciel de traitement d’image.
    Remarque : Les définitions des scores et les niveaux de dommages musculaires sont indiquées à la Figure 3, pour lequel les critères sont énumérés comme suit : 3 points pour les fibres musculaires manquantes ; 2 points pour les fibres musculaires ruptures ou cassées ; 1 point pour les fibres musculaires courbés ; 0 point pour les fibres du muscle sains.

6. statistiques Analyses

  1. Effectuer toutes les expériences au moins trois fois indépendamment.
  2. Utilisez la méthode de Kaplan-Meier pour évaluer les essais de survie de c. elegans et le test de Mantel-Haenzel en analysant les différences de survie. La valeur de signification statistique à 0,05.
  3. Test t de Student permet d’analyser les résultats statistiques, les essais de toxicité liquide c. elegans pour les deux groupes différents. Utiliser le sens unique test ANOVA dans l’analyse des différences entre les valeurs de trois ou plus pour une variable indépendante. La valeur de signification statistique à 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En suivant les protocoles décrits ci-dessus, il est facile de différencier les toxicités des quatre souches d’Aeromonas . Le test de survie de c. elegans est illustré à la Figure 1. Le taux de survie c. elegans infectés par des espèces d’Aeromonas , indiqués dans l’ordre de haut en bas : a. caviae, a. veronii, a. hydrophila et a. dhakensis. Bien qu’il y a diversité en termes de toxicité entre et au sein des espèces d’Aeromonas , le taux de survie des elegans de Caenorhabditis, en moyenne, ont montré une mortalité plus élevée parmi les vers infectés par a. dhakensis. La virulence d’a. hydrophila était inférieure à celle de a. dhakensis (p < 0,01). Contrairement à a. dhakensis et a. hydrophila,les virulences atténués d’a. veronii et a. caviae ont été observés dans le test de survie de c. elegans . La diversité des taux de survie c. elegans infectés par différentes espèces d’Aeromonas concorde avec les observations cliniques d’infection à Aeromonas 7.

Les résultats de l’essai de toxicité liquide de c. elegans sont indiquées à la Figure 2. Avec le temps de l’infection, le nombre de vers qui a survécu a diminué significativement lorsque c. elegans a été infecté avec a. dhakensis ou a. hydrophila. Le taux de survie vers infectés par a. dhakensis a été inférieur à celles infectées par a. hydrophila. En revanche, les groupes infectés par a. veronii ou a. caviae avaient des taux de survie supérieurs à chaque point dans le temps par rapport à a. dhakensis et a. hydrophila. Les tendances des taux de survie de c. elegans dans l’essai de toxicité liquide représentant la virulence des différentes espèces d’Aeromonas sont similaires à celles observées dans l’analyse de survie.

Dans l’essai de nécrose musculaire de c. elegans , nous tout d’abord classer les niveaux de lésion musculaire et assignés scores selon les niveaux correspondants. Les définitions de la partition et les niveaux de dommages musculaires sont fournies à la Figure 3. Les critères de notation pour chaque niveau de dommages musculaires est comme suit : 0 points pour la santé des fibres musculaires ; 1 point pour les fibres musculaires courbés ; 2 points pour les fibres musculaires ruptures ou cassées ; 3 points pour la perte des fibres musculaires. Les résultats de la nécrose du muscle c. elegans essai dans Aeromonas infecté -c. elegans est illustré à la Figure 4. Les degrés de lésions musculaires varient parmi les espèces d’Aeromonas . Les niveaux du muscle endommagent ordre mesuraient de doux à grave comme suit : a. caviae, a. veronii, a. hydrophila et a. dhakensis à chaque instant. Contrairement à a. hydrophila et a. dhakensis, nécrose musculaire n’était pas évidente à worms infectées par a. caviae et a. veronii. La plupart vers infectés par a. caviae et a. veronii ont été enregistrée comme 0 points. C. elegans infectés par a. hydrophila ou dhakensis a. exposé des lésions musculaires graves. À noter, la plupart vers infectés par a. dhakensis a démontré muscle dommages classés ≥2 points. Le degré de nécrose musculaire c. elegans infectées par a. dhakensis a été plus sévère en ce qui concerne un pourcentage plus élevé de scores ≥ 2 points par rapport à a. hydrophila. La gravité de la nécrose musculaire chez les 4 espèces d’Aeromonas en corrélation avec les résultats des survie et le liquide les épreuves de toxicité.

Les méthodes décrites ci-dessus offrent un moyen pratique pour différencier la diversité virulence entre et au sein des espèces d’Aeromonas . En outre, il s’agit d’un modèle fiable permettant d’étudier l’interaction entre un agent pathogène et l’hôte.

Figure 1
Figure 1 : Les courbes de survie de c. elegans. Le test de survie montre les toxicités diverses des différentes espèces d’Aeromonas de c. elegans (** : P < 0,01 ; * : P < 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Le taux de survie de c. elegans de l’essai de toxicité liquide. Le test de toxicité liquide montre les différentes toxicités des diverses espèces d’Aeromonas de c. elegans. En (A), 24h, (B) (C) 72 h et 48 h après l’infection Aeromonas , c. elegans infectées par a. dhakensis a le plus faible taux de survie. Le résultat suggère qu’a. dhakensis est l’espèce de Aeromonas plus toxique pour le c. elegans (*** : P < 0,001 ; ** : P < 0,01, barres d’erreur : écart-type, SD). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les scores correspondants à la nécrose musculaire chez c. elegans induite par l’infection à Aeromonas . Les critères de nécrose des muscles et notes correspondantes sont comme suit : 3 points pour les fibres musculaires manquantes ; 2 points pour les fibres musculaires ruptures ou cassées ; 1 point pour les fibres musculaires courbés ; 0 point pour les fibres du muscle sains. Fibres musculaires courbés (flèches), ruptures fibres musculaires (flèches) et fibres musculaires manquantes (étoile) sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Les scores de nécrose musculaire c.elegans . Les scores de nécrose musculaire montrent les différentes toxicités des différentes espèces d’Aeromonas de c. elegans. En (A), 24h, (B) (C) 72 h et 48 h après l’infection Aeromonas , la lésion musculaire de c. elegans est la plus sévère de l’infection par a. dhakensis. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Solution Préparation
Tampon phosphate Dissoudre 119,35 g de KH2PO4 et 21,43 g de K2HPO4, dans 1 L d’eau déionisée.
Autoclave à 121 ° C pendant 20 min
Ajuster le pH à pH = 6.0 avec KOH.
Attendre, laisser refroidir à température ambiante
S basale Dissoudre 5,85 g NaCl et g 6 KH2PO4g 1 K2HPO4 dans 1 L d’eau déionisée.
Autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
Attendre, laisser refroidir à température ambiante.
Citrate de Potassium 1 M Dissoudre 4 g acide citrique acid•H2O et 58,7 g tri-potassium citrate•H2O dans 0,2 mL d’eau désionisée.
Ajuster le pH à pH = 6.0.
Autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
Attendre, laisser refroidir à température ambiante.
Solution de trace metals Dissoudre disodique 1,86 g, 0,69 g FeSO4•7 H2O, 0,2 g MnCl2•4 H2O, 0,29 g ZnSO4•7 H2O,
0,025 g CuSO4•5 H2O dans l’eau 1 L eau désionisée.
Autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
Attendre, laisser refroidir à température ambiante
Conserver la solution dans l’obscurité.
Bouillon LB Dissoudre 10 g de NaCl, 10 g tryptone et extrait de levure 5 g dans 1 L d’eau déionisée. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
Attendre, laisser refroidir à température ambiante.

Tableau 1 : Préparation de la Solution.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans est un nématode scuticociliés qui naturellement bactéries apports comme nourriture et a développé une immunité innée compliquée aux bactéries au cours de son processus évolutif. Deux des principaux organes soutenant l’immunité sont l’épiderme et l’intestin9,13. L’épiderme et les bandes de muscle de c. elegans ressemblent à des structures de tissus mous dans les mammifères et les êtres humains6. En raison de ces caractéristiques, le c. elegans s’applique comme un organisme modèle pour l’étude de la pathogenèse de l’infection à Aeromonas .

Nous présentons ici trois méthodes pour l’examen des infection à Aeromonas chez c. elegans qui sont représentatifs de la toxicité diverse parmi les 4 espèces d’Aeromonas et sont corrélées avec l’observation clinique7. Ces méthodes pratiques de distinguer les différents degrés de toxicité chez les espèces d’Aeromonas . En utilisant ces méthodes, les chercheurs peuvent étudier la virulence de différentes espèces d’Aeromonas et le mécanisme de défend des hôtes sur infection à Aeromonas .

Dans ces trois méthodes, c. elegans agit non seulement comme un prédateur, mais aussi comme une proie d’Aeromonas. Si les vers ne sont pas en bon état avant l’essai, les résultats de l’interaction hôte-pathogène sera différentes. Ainsi, il est important d’être très prudent lors de la manipulation de c. elegans. Pour éviter des dommages excessifs aux oeufs de c. elegans dans l’étape de synchronisation, n’oubliez pas d’observer le dégagement des oeufs en permanence. Une fois que les oeufs sont endommagés, le nombre d’éclosion des oeufs de c. elegans diminuera grandement. Même si les œufs endommagés éclosent avec succès, les vers sont susceptibles d’avoir des problèmes de développement. Par conséquent, il est essentiel de complète étape 2.3 moins de 6 min après les vers sont exposés à NaOCl et KOH.

Les trois méthodes décrites ci-dessus montrent des résultats cohérents sur les toxicités Aeromonas c. elegans, y compris deux expériences différentes, mesurant les taux de survie de c. elegans sous infection à Aeromonas et un observant le changement morphologique du muscle. Le test de virulence en utilisant différentes méthodes conçues peut fournir des résultats variés. Par exemple, auparavant, les scientifiques ont observé des résultats différents en plaque c. elegans et des analyses de liquide14. Dans notre recherche, nous avons également constaté il y avait divergence existant entre ces deux essais9. On croit que l’environnement extérieur influencera la virulence de l’agent pathogène, et les chercheurs ont besoin de trouver les conditions optimales pour étudier le mécanisme de virulence. D’autre part, il faut étudier et comprendre les mécanismes sous-jacents dans la condition spécifique de l’infection.

Dans ce travail, nous avons établi un modèle d’infection chez c. elegans afin d’étudier la virulence de Aeromonas et la réponse de l’hôte correspondant après l’infection. Ces trois méthodes pourraient être appliquées à l’étude des autres espèces d’Aeromonas au-delà des 4 espèces traitées dans la présente étude. En outre, ces approches fournira une plateforme pour étudier le mécanisme sous-jacent responsable de la nécrose musculaire induite par une infection bactérienne et de développer des thérapies potentielles afin d’améliorer les résultats cliniques des infections des tissus mous.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants de l’aide de l’installation de base de c. elegans à Taïwan et à la microbiologie diagnostique et antimicrobiens résistance laboratoire de National Cheng Kung University Hospital pour fournir les Aeromonas isole. Nous remercions également le centre de génétique de Caenorhabditis (CGC) et le WormBase. Nous remercions également Savana Moore pour l’édition du manuscrit.

Cette étude a été financée partiellement par des subventions du ministère de la Science et la technologie de Taiwan (plus 105-2628-B-006-017-MY3) et la National Cheng Kung University Hospital (NCKUH-10705001) à P.L. Chen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shaker incubator YIH DER LM-570R Bacteria incubation
K2HPO4 J.T.Baker MP021519455 Culture medium preparation 
KH2PO4 J.T.Baker 3246-05 Culture medium preparation 
Na2HPO4 J.T.Baker MP021914405 Culture medium preparation 
NaCl SIGMA 31434 Culture medium preparation 
MgSO4 SIGMA M7506 Culture medium preparation 
agar Difco 214530 Culture medium preparation 
CaCl2 SIGMA C1016 Culture medium preparation 
cholesterol SIGMA C8503 Culture medium preparation 
ethanol SIGMA 32205 Culture medium preparation 
KOH SIGMA P5958 Culture medium preparation 
6 cm Petri plate ALPHA PLUS 46 agar plate preparation
96-well plate FALCON 353072 liquid assay
bacterial peptone Affymetrix/USB AAJ20048P2 Culture medium preparation 
yeast extract SIGMA 92144 Culture medium preparation 
citric acid•H2O SIGMA C1909 Culture medium preparation 
tri-potassium citrate•H2O SIGMA 104956 Culture medium preparation 
FudR  SIGMA 1271008 Culture medium preparation 
disodium EDTA SIGMA E1644 Culture medium preparation 
FeSO4•7 H2O SIGMA 215422 Culture medium preparation 
MnCl2•4 H2O SIGMA 221279 Culture medium preparation 
ZnSO4•7 H2O SIGMA 204986 Culture medium preparation 
CuSO4•5 H2O SIGMA C8027 Culture medium preparation 
tryptone SIGMA 16922 Culture medium preparation 
Microscope system Nikon  Eclipase Ti inverted  microscope imaging
Scientific CCD Camera QImaging  Retiga-2000R Fast 1394  microscope imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Parker, J. L., Shaw, J. G. Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).
  2. Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).
  3. Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Biliary tract infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).
  4. Chuang, H. C., et al. Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia. Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).
  5. Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).
  6. Chen, P. L., et al. A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 7, 2058 (2016).
  7. Chen, P. L., et al. Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences. PLoS One. 9 (11), 111213 (2014).
  8. Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila. Frontiers in Microbiology. 7, 1219 (2016).
  9. Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Immunology. 9, 774 (2018).
  10. Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens. Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).
  11. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Engelmann, I., Pujol, N. Innate immunity in C. elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).
  14. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813 (2012).

Tags

Immunologie et Infection numéro 142 Aeromonas dhakensis Aeromonas hydrophila Aeromonas veronii Aeromonas caviae Caenorhabditis elegans infection bactérienne essai de toxicité liquide test de survie Dosage de nécrose musculaire.
Évaluer la Virulence et la pathogenèse de l’Infection à <em>Aeromonas</em> dans un modèle de <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., … More

Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model. J. Vis. Exp. (142), e58768, doi:10.3791/58768 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter