Summary
Burada, C. elegansenfeksiyonunda Aeromonas çalışmaya üç farklı deneyler tanıtmak. Bu uygun yöntemler kullanarak, arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek kolaydır.
Abstract
İnsan patojen Aeromonas klinik olarak gastroenterit, yara enfeksiyonları, septisemi ve idrar yolu enfeksiyonu neden olduğu gösterilmiştir. En insan hastalıkları bakteri dört türleri ile ilişkili olduğu bildirilmiştir: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniive Aeromonas caviae. Model organizma Caenorhabditis elegans mükemmel enfeksiyon modeli hangi Aeromonasbakteriyel patogenezi okumaya sağlar bacterivore olduğunu. Burada, hayatta kalma, sıvı toksisite ve kas nekrozu deneyleri gibi bir C. elegans modeli kullanarak Aeromonas enfeksiyon çalışmaya üç farklı deneyler tanıtmak. Aeromonas virülans belirleyen üç yöntem sonuçları tutarlı edildi. A. dhakensis klinik enfeksiyonlar neden 4 büyük Aeromonas türler arasında en zehirli olduğu gösterilmiştir. Bu yöntemler arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek ve Aeromonas enfeksiyon patogenezi bilgimizi katkıda bulunmak için uygun bir yol olarak gösterilmektedir.
Introduction
İnsan patojen Aeromonas, klinik olarak gastroenterit, yara enfeksiyonları, septisemi ve idrar yolu enfeksiyonları1,2neden olduğu gösterilmiştir. En ilişkili insan hastalıkları dört bakteriyel türler ile ilişkili olduğu bildirilmiştir: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniive Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. Aeromonas bulaşıcı hastalıklar arasında yumuşak doku enfeksiyonları ciddi morbidite ve mortalite insanlarda neden olabilir. Not, kas nekrozu yumuşak doku enfeksiyonu6en ağır şeklidir. Gözlem hayatta kalma ve Caenorhabditis elegans kas nekrozu enfeksiyon sonra Aeromonastoksisite spekülasyon kullanılacak uygun bir yöntemdir.
Bilim adamları zaten bakteriyel enfeksiyonlar çalışmaya çok sayıda model organizmalar geliştirdik. Önceki çalışmalarda, fareler, zebrafishes ve Nematodlar patogenez ve virülans Aeromonas6,7,8çalışmaya hayvan modelleri olarak kullanılmıştır. Her hayvan modeli vardır onun ' avantajları ve uygulamaları. Model organizma, Caenorhabditis elegans, bacterivorous Yuvarlak solucanlar hangi alımı bakteri foodnaturally değil. C. elegansevrimi boyunca bakteriyel enfeksiyona karşı karmaşık bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi geliştirmiştir. Bakteriyel enfeksiyon stres altında C. elegans Aeromonas6,7,9 ve diğer patojenleri bakteriyel patogenezi okumaya bir mükemmel enfeksiyon model olmak kanıtlanmıştır mantar10 ve enterohaemorrhagic Escherichia coli O157: H711gibi. Ancak, hala C. elegans Aeromonasvirülans eğitimi için bir model olarak kullanarak metodoloji üzerinde duruluyor hiçbir yayın yoktur.
Burada, Aeromonas enfeksiyon C. elegans hayvan bir model olarak kullanarak eğitim için üç farklı deneyler tanıtmak: hayatta kalma, sıvı toksisite ve kas nekrozu deneyleri. Bu yöntemler arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek ve Aeromonaspatogenezinde anlayış geliştirmek için uygun bir yoldur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kültür orta hazırlanması
Not: Bkz. Tablo 1 için çözüm hazırlık.
- M9 orta12hazırlamak için KH2PO41.5 g, 5.66 g Na2HPO4ve NaCl 2.5 g 500 mL deiyonize su içinde çözülür. Otoklav 20 dakika süreyle 121 ° C'de oda sıcaklığına soğutmalı kadar bekleyin ve sonra 0.5 mL 1 M MgSO4 ilk kullanımdan önce ekleyin.
- Nematot büyüme orta (NGM)12hazırlamak için 3 g NaCl, 2.5 g bakteriyel pepton ve 1 litre deiyonize su 20 g agar geçiyoruz. Otoklav 20 dakika süreyle 121 ° C'de soğutmalı su banyosu içinde 55 ° c kadar bekleyin ve sonra 1 mL 1 M CaCl2, 1 M MgSO41 mL, 1 mL etanol içinde %5 kolesterol ve fosfat tampon 25 mL ekleyin. Girdap iyice karıştırın.
- Yaklaşık 5 mL NGM içine her 6 cm Petri kabına dökün. Yüzeyde kabarcık üretimini plaka kaçının. Tabaklar, oda sıcaklığında 1 gece ve 4 ° C'de kaydetmek için paketi için bırakın Kullanmadan önce oda sıcaklığına getir.
- Zenginleştirilmiş NGM (ENOA) hazırlamak için 3 g NaCl, 5 g bakteriyel pepton, 1 gr maya özü ve 1 litre deiyonize su 30 g agar geçiyoruz. Otoklav 20 dakika süreyle 121 ° C'de soğutmalı su banyosu içinde 55 ° c kadar bekleyin ve 1 mL 1 M CaCl2, 1 M MgSO41 mL, 1 mL etanol içinde %5 kolesterol ve fosfat tampon 25 mL ekleyin. Girdap iyice karıştırın.
- Yaklaşık 10 mL ENOA içine her 9 cm Petri kabına dökün. Yüzeyde kabarcık üretimini plaka kaçının. Tabaklar, oda sıcaklığında 1 gece ve 4 ° C'de kaydetmek için paketi için bırakın Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirmek.
- S orta12hazırlamak, 40 mL S bazal, 0.4 mL 1 M Potasyum sitrat karıştırmak için 0.4 mL izleme çözümü, 1 M CaCl2, 1 M MgSO40.12 mL, %5 kolesterol etanol içinde 40 µL 0.12 mL ve 1 mL 8 mm FudR kullanmadan önce metal.
2. C. elegans6,9,12 eşitlenmesi
- Yaklaşık 2000 solucanlar yetişkin gravid sahne 10 mL 15 mL tüp içinde steril deiyonize su ile yıkayın. Bakteri 3 x, solucanlar tüpün dibinde tutmak dışarı yıkamak.
- Örnek için solucanlar çekmek için 500 x g , 1 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın ve solucanlar 3,5 mL deiyonize su tutun.
- 1 mL NaOCl (10-%15) ve 0.5 mL 5 M KOH tüp içine ekleyin. Mix eşit sallayarak için < solucan cesetleri koşullar için 6 dakika.
- Yumurta solucanlara salınır sonra lizis durdurmak için 10 mL deiyonize su ekleyin. Yumurta çekin ve süpernatant mümkün olduğu kadar kaldırmak için 1200 x g , 1 dk santrifüj. 15 mL M9 orta en az 3 x ile yıkayın.
Not: adım 1.1 M9 orta bileşimi için bkz. - Yumurta 1 mL M9 ortamda tutmak. 3.5 cm çanak için bir gece (yaklaşık 12-18 h) 20 ° C'de kuluçka yumurta taşıma.
Not: kuluçka sonra ilk larva (L1) sahne adlandırılan larva solucan için yumurtalar çatlar. - Pipet L1 Worms M9 orta 10 µL dışarı. Solucan sayar ve L1 konsantrasyonu M9 ortamda solucanlar hesaplayın.
- Tohum en az 10.000 Escherichia coli OP50 ile yayılmış 9 cm ENOA plaka üzerinde bir damlalıklı ile L1 sahne solucanlar inkübe.
- Bu adımda, formanın 0.5 mL gecede E. coli OP50 9 cm ENOA plaka üzerinde Luria-Bertani (LB) et suyu ile kültürlü. 16-18 h için 37 ° C'de plaka kuluçkaya
Not: kirlenmesini önlemek için Yayilim adım laminar akış mahallede yapılmalıdır. - L1 solucanlar tohum önce oda sıcaklığına kadar serin. Tohum en az 10.000 L1 sahne solucanlar ENOA plaka E. coli OP50 ile inkübe.
- Bu adımda, formanın 0.5 mL gecede E. coli OP50 9 cm ENOA plaka üzerinde Luria-Bertani (LB) et suyu ile kültürlü. 16-18 h için 37 ° C'de plaka kuluçkaya
- 20 ° c kadar 4th larva (L4) sahne alanı'na büyürler veya 44 h için solucanlar kuluçkaya.
Not: Adım 1.3 ENOA orta bileşimi için bkz. Bir solucan L4 aşamada vücut yan ortasında yarım ay şeklinde beyaz bir nokta vardır. - Aşağıdaki deneyleri sahne solucanlar eşitlenmiş L4 kullanın. Vahşi C. elegans hayatta kalma tahlil Aeromonas dhakensis ile ve C. elegans sıvı toksisite tahlil Aeromonas dhakensisile N2 solucanlar türünü kullanın. RW1596 solucanlar (myo-3(st386); kullanın stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) C. elegans kas nekrozu tahlil Aeromonas dhakensisile.
3. C. elegans hayatta kalma tahlil Aeromonas6,9
- E. coli OP50 ile yayılan ENOA L1 solucanlar tohum günde, bir koloni dört Aeromonas suşları veya E. coli OP50 ve kültürü ile 2 mL LB suyu sırasıyla 37 ° C'de 16 h için Seç.
Not: Kirlenmesini önlemek için bu adımı laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. Burada, aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans normal gıda kaynağıdır. A. dhakensis AAK1, ilk tam sıralı patojenik klinik A. dhakensis yalıtmak. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121 Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden dinlerinden klinik yalıtır vardır. - OD600 absorbans bakteriyel suyu ölçmek ve bakteriyel suyu OD600 ayarlamak 2.0 LB suyu ile =.
- Spot ve bakteriyel suyu 30 µL her 6 cm NGM plaka yayıldı. Oda sıcaklığında plakaları gecede kültür.
Not: NGM orta bileşimi için 1.2 adıma bakın. - Gününde, L1 solucanlar L4 sahne alanı'na büyümek rasgele almak ve 50 solucanlar bir NGM plaka her dört Aeromonas suşları veya E. coli OP50 ile aktarın.
- Tahlil tamamlanana kadar 20 ° C'de NGM plakaları kuluçkaya.
- Tüm yaşayan solucanlar bakteri ve numaralarını canlı, ölü sayısı ve sensör solucanlar yeni hazırlanan bir NGM plakalı son solucan ölene kadar her gün aktarın.
Not: Solucanlar olsanız steril solucanlar bir taze hazırlanmış NGM plakasına enfeksiyon, bakımı için her gün transfer (örneğinglp-4, ya da FudR ile). - Günlük veri hesaplama temel hayatta kalma eğriler çizmek.
4. C. elegans sıvı toksisite tahlil Aeromonas7 ile
Not: Kirlenmesini önlemek için laminar akış mahallede gerçekleştirilen adımlar.
- L1 solucanlar E. coli OP50 ile yayıldı ENOA plaka üzerinde tohum sonra seçtiklerimiz bir koloni dört Aeromonas suşları ve E. coli OP50 ve kültürü ile 5 mL LB suyu her 16 h için 37 ° C'de.
Not: protokol, aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans normal gıda kaynağıdır. A. dhakensis AAK1, ilk tam sıralı patojenik klinik A. dhakensis yalıtmak. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121 Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden dinlerinden klinik yalıtır vardır. - OD600 absorbans bakteri suyu ölçmek.
- Bakteriyel suyu 3500 x g LB suyu kaldırmak 15 dakika, santrifüj kapasitesi. Bakteri resuspend ve bakteriyel suyu OD600 ayarlamak 3.0 ile S orta =. Bakteriyel suyu 195 µL S ortamda bir 96-şey plaka en az 8 wells için ekleyin.
Not: Adım 1.6 S orta bileşimi için bkz. - L4 solucanlar M9 orta kullanarak ENOA plaka E. coli OP5 ile kapalı yıkayın. Bir konsantrasyon µL başına 5 solucanlar solucan çözüm ayarlamak ve solucan çözüm 5 µL 96-şey plaka her şey için ekleyin. Yaklaşık 25 solucanlar iyi ücret olduğundan emin olun.
- Bir shaker 200 devirde 25 ° C'de 96-şey tabağa kuluçkaya
- 24, 48 ve 72 h. aşağıdaki formül ile her şey hayatta kalma oranları hesaplamak sonra canlı solucanlar ve ölü solucanlar saymak: (canlı solucanlar/toplam solucanlar) × %100.
- Bir dağılım çizim grafik günlük veri hesaplama ile çizin.
5. C. elegans kas nekrozu tahlil Aeromonas6
Not: Kirlenmesini önlemek için aşağıdaki adımları bir laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
- L1 solucanlar yayılmış ENOA E. coli OP50 ile üzerinde seribaşı gününde bir koloni dört Aeromonas suşları ve E. coli OP50 ve kültürü ile 2 mL LB suyu her 16 h için 37 ° C'de seç.
Not: Burada, aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans normal gıda kaynağıdır. A. dhakensis AAK1, ilk tam sıralı patojenik klinik A. dhakensis yalıtmak. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121 Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden dinlerinden klinik yalıtır vardır. - OD600 absorbans bakteri suyu ölçmek ve bakteri suyu OD600 ayarlamak 2.0 LB suyu ile =. Spot ve 6 cm NGM plakaları bakteriyel suyu 30 µL yayıldı. Oda sıcaklığında plakaları gecede kültür.
- Gününde L1 solucanlar L4 sahneye, transfer 50 solucanlar her NGM plaka her dört Aeromonas suşları veya E. coli OP50 ile büyümek. 20 ° C'de NGM plakaları kuluçkaya Solucanlar her 24 h bakteri ile yeni hazırlanan NGM plakalar aktarın.
- Kas görüntüleri floresan mikroskop kullanarak alın.
- Rastgele bir % 2 özel jel üzerine 10 solucanın M9 orta bir slayttaki seçin. 2 µL % 1 Sodyum azid özel M9 ortamda az 5 dk için resim çekmeden önce kullanarak solucanlar felç.
- Bir kapak notu yerleştirin ve floresan protein (GFP) filtre bir yeşil üzerinde floresan mikroskop kullanarak şarj kuplajlı cihaz fotoğraf makinesi ile kas çekim. 24 Kas çekim, 48 ve 72 h L4 sahne sonrası.
- Görüntü analizi ve şekil hazırlık bir görüntü işleme yazılımı ile yapmak.
Not: Puanları ve kas hasarı düzeyleri tanımları için ölçütleri listelenen aşağıdaki gibi Şekil 3' te, gösterilmektedir: 3 puan için eksik kas lifleri; 2 puan parçalanmış veya kırık kas lifleri için; 1 puan bükülmüş kas lifleri için; sağlıklı kas lifleri için 0 puan.
6. istatistiksel analizler
- Tüm deneyler bağımsız olarak en az üç kez gerçekleştirin.
- C. elegans hayatta kalma deneyleri değerlendirmek için Kaplan-Meier yöntemini kullanın ve hayatta kalma farklılıklar analiz günlük-rank testi kullanabilirsiniz. İstatistiksel anlamlılık 0,05 ayarla.
- Öğrenci t-test için iki farklı grup C. elegans sıvı toksisite deneyleri istatistiksel sonuçlarını çözümlemek için kullanın. Bir bağımsız değişken için üç veya daha fazla değer arasında farklılıklar analiz tek yönlü ANOVA testi kullanın. İstatistiksel anlamlılık 0,05 ayarla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolleri takip ederek, toksisite üzerinden dört Aeromonas suşları arasında ayırt etmek kolaydır. C. elegans hayatta kalma tahlil Şekil 1' de gösterilen. Hayatta kalma oranları düşük ile yüksek sırada gösterilen Aeromonas türleri ile enfekte C. elegans vardı: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila ve A. dhakensis. Çeşitlilik açısından toksisite arasında ve Aeromonas türleri içinde olsa da, C. elegans, hayatta kalma oranları ortalama, en yüksek ölüm A. dhakensisile enfekte solucanlar arasında gösterdi. A. hydrophila virülans A. dhakensis (p < 0,01) aşağı. A. dhakensis ve A. hydrophila,aksine zayıflatılmış virulences A. veronii ve A. caviae C. elegans hayatta kalma assay olarak tespit edildi. Farklı Aeromonas türleri ile enfekte C. elegans sağkalım oranları çeşitliliği Aeromonas enfeksiyon7klinik gözlemleri ile tutarlıdır.
C. elegans sıvı toksisite tahlil sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir. Enfeksiyon zamanla ne zaman C. elegans A. dhakensis ya da A. hydrophilaile enfekte oldu sağ Kurt numaralarını önemli ölçüde azalmıştır. A. dhakensis ile enfekte solucanlar survival oranı bu A. hydrophilaile enfekte daha aşağı. Buna ek olarak, A. veronii veya A. caviae ile enfekte grupları, her zaman bir noktada A. dhakensis ve A. hydrophilakıyasla daha yüksek sağkalım oranları vardı. C. elegans sağkalım oranları farklı Aeromonas türleri virülans temsil eden sıvı toksisite tahlil eğilimleri hayatta kalma assay olarak gözlenen benzer.
C. elegans kas nekrozu tahlil ilk kas hasarı düzeyde sınıflandırılmış ve puanları karşılık gelen düzeylerine göre atanmış. Skor ve kas hasarı düzeyleri tanımları Şekil 3' te verilmiştir. Her kas hasar düzeyi için Puanlama ölçütünü ise şöyle: 0 puan için sağlıklı kas lifleri; 1 puan bükülmüş kas lifleri için; 2 puan parçalanmış veya kırık kas lifleri için; kas liflerinin 3 puan kaybı için. C. elegans kas nekrozu sonuçlarını virüslü -C. elegans Şekil 4' te gösterilen Aeromonas tahlil. Kas hasarı derecelerde Aeromonas türleri arasında değişmekteydi. Kas düzeylerini aşağıdaki gibi içinde değişmekteydi kaliteden hafif şiddetli hasar: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila ve A. dhakensis , her zaman bir noktada. A. hydrophila ve A. dhakensisaksine, kas nekrozu A. caviae ve A. veroniiile enfekte solucanlar belli değildi. A. caviae ve A. veronii ile enfekte solucanların en 0 puan kaydedildi. A. hydrophila veya A. dhakensis ile enfekte C. elegans şiddetli kas hasarı sergiledi. Not, A. dhakensis ile enfekte solucanların en kas kademeli hasar ≥2 puan gösterdi. A. dhakensis ile enfekte C. elegans kas nekrozu derecesi 2 A. hydrophilaile karşılaştırıldığında puan puanları ≥ daha yüksek bir oranda açısından daha ağır. 4 Aeromonas tür kas nekrozu şiddeti hayatta kalma ve sıvı toksisite deneyleri bulgular ile ilişkili.
Yukarıda açıklanan yöntemleri virülans çeşitlilik arasında ve Aeromonas türleri içinde ayırt etmek için kullanışlı bir yol sunar. Buna ek olarak, bu hangi bir patojen ve ev sahibi arasındaki etkileşimi incelemek güvenilir bir modeldir.
Resim 1 : C. eleganshayatta kalma eğrileri. C. elegans için farklı Aeromonas türlerin çeşitli toksisite hayatta kalma tahlil gösterir (**: P < 0,01; *: P < 0,05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : C. elegans sağkalım oranı üzerinden sıvı toksisite tahlil. Sıvı toksisite tahlil Aeromonas türleri farklı toksisitesine C. elegansiçin gösterir. (A) 24 h, (B) 48 h ve (C) 72 h Aeromonas enfeksiyon sonrası, A. dhakensis ile enfekte C. elegans en düşük sağkalım oranı vardır. Sonuç A. dhakensis C. elegans en zehirli Aeromonas tür olduğunu göstermektedir (***: P < 0,001; **: P < 0,01, hata çubukları: SD standart sapma). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Kas nekrozu C. elegans içinde karşılık gelen puanları Aeromonas enfeksiyon tarafından indüklenen. Ölçütlerini kas nekrozu ve karşılık gelen puanları gibidir: 3 puan için eksik kas lifleri; 2 puan parçalanmış veya kırık kas lifleri için; 1 puan bükülmüş kas lifleri için; sağlıklı kas lifleri için 0 puan. Bükülmüş kas lifleri (oklar), parçalanmış kas lifleri (ok uçları) ve eksik kas lifleri (yıldız) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : C. elegans kas nekrozu puanları. Kas nekrozu puanlar farklı Aeromonas türlerin çeşitli toksisitesine C. elegansiçin gösterir. (A) 24 h, (B), 48 h ve (C) 72 h post Aeromonas enfeksiyon, C. elegans kas hasarı şiddetli enfeksiyon ile A. dhakensis. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Çözüm | Hazırlık |
| Fosfat tampon | 119.35 g KH2PO4 ve K2HPO4, 1 litre deiyonize su 21.43 g geçiyoruz. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de PH pH değerine ayarlamak 6.0 KOH ile =. Oda sıcaklığına soğutmalı kadar bekleyin |
| S Bazal | 5.85 g NaCl, 6 gr KH2PO4ve 1 g K2HPO4 ' te 1 litre deiyonize su geçiyoruz. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de. Oda sıcaklığına soğutmalı kadar bekleyin. |
| 1 M Potasyum sitrat | 4 g sitrik acid•H2O 58,7 g tri-potasyum citrate•H ve2O 0.2 mL deiyonize su geçiyoruz. PH pH değerine ayarlamak 6.0 =. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de. Oda sıcaklığına soğutmalı kadar bekleyin. |
| İzleme metaller çözüm | 1.86 g disodyum EDTA, 0.69 g FeSO4•7 H2O, 0.2 g MnCl24 H2O, 0.29 g ZnSO4•7 H2O dağıtılması, 1 litre deiyonize su 0.025 g CuSO4•5 H2O. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de. Oda sıcaklığına soğutmalı kadar bekleyin Çözüm karanlıkta bırakın. |
| LB suyu | Erime 10 g NaCl, 10 g tryptone ve 5 gr Maya 1 litre deiyonize su ayıklayın. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de. Oda sıcaklığına soğutmalı kadar bekleyin. |
Tablo 1: Çözüm hazırlık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans olduğunu bacterivorous Yuvarlak solucanlar bu doğal gıda alımı bakteri ve bakteri için karmaşık bir doğuştan gelen bağışıklık onun evrim sürecinde geliştirmiştir. İki önemli organları korumak ve bağışıklığı destekleyici epidermis ve bağırsak9,13vardır. Epidermis ve C. elegans kas bantları memeliler ve insanlar6' yumuşak doku yapıları benzer. Bu özellikleri nedeniyle, C. elegans Aeromonas enfeksiyon patogenezinde çalışmak için bir model organizma olarak kullanılır.
Burada, klinik gözlem7ile 4 Aeromonas türler arasında çeşitli toksisitesi milletvekili olup correlated C. elegans enfeksiyonunda Aeromonas incelenmesi için üç yöntem mevcut. Bu uygun yöntemler toksisite Aeromonas türler arasında farklı derecelerde ayırt. Bu yöntemleri kullanarak, araştırmacılar farklı Aeromonas türleri virülans ve Aeromonas enfeksiyon üzerine ana savunma mekanizmasının çalışma olabilir.
Bu üç yöntem, C. elegans sadece bir avcı olarak aynı zamanda Aeromonasbir av olarak davranır. Kurtçuklar testi önce sağlıklı durumunu değilseniz, ana bilgisayar-patojen etkileşim sonuçlar farklı olacaktır. Böylece, C. elegansişlenirken çok dikkatli olmanız önemlidir. C. elegans yumurtalara eşitleme adımda aşırı zarar önlemek için sürekli olarak yumurta yayımlanmasından gözlemlemek emin olun. Bir kez yumurta zarar, C. elegans yumurta hatching sayısı büyük ölçüde azalır. Hasarlı yumurtadan başarılı bir şekilde olsa bile, solucanlar gelişim sorunları olması muhtemeldir. Bu nedenle, solucanlar NaOCl ve KOH maruz sonra tam adım 2.3 6 dakika içinde kritik.
Yukarıda açıklanan üç yöntem tutarlı sonuçlar için C. elegansiki farklı deney C. elegans sağkalım oranları Aeromonas enfeksiyon ve bir altında ölçme de dahil olmak üzere, Aeromonas toksisitesine göster Kas morfolojik değişiklik gözlemleyerek. Farklı tasarlanmış yöntemler kullanarak virülans test farklı sonuçlar sağlayabilir. Örneğin, bilim adamları daha önce C. elegans plaka farklı sonuçlar gözlemledim ve sıvı14deneyleri. Bizim araştırma, Ayrıca bu iki deneyleri9arasında mevcut tutarsızlık olduğunu bulduk. Dış ortamda virülans patojenin etkileyecektir ve araştırmacılar virülans mekanizması keşfetmek için en uygun koşulları bulmalıyız inanılıyor. Başka bir açıdan bakıldığında, eğitim ve özel durumda enfeksiyon temel mekanizmaları anlama değer.
Bu çalışmada, biz Aeromonas ve karşılık gelen ana bilgisayar yanıt virülans enfeksiyon sonra çalışmaya C. elegans bir enfeksiyon modeli kurulmuştur. Bu üç yöntem mevcut çalışmada ele 4 tür ötesinde diğer Aeromonas türleri çalışmak için uygulanabilir. Buna ek olarak, bu yaklaşımlar sorumlu kas nekrozu bakteriyel enfeksiyon tarafından indüklenen için temel mekanizması çalışmaya ve şiddetli yumuşak doku enfeksiyonları klinik sonuçlar geliştirmek için potansiyel tedaviler geliştirmek için bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Tayvan ve tanılama Mikrobiyoloji için C. elegans çekirdek tesisinden yardım için minnettarız ve antimikrobiyal direnç laboratuvar, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Aeromonas sağlamak için hastane izole ediyor. Ayrıca Caenorhabditis genetik Merkezi (CGC) ve WormBase kabul edersiniz. Biz de Savana Moore el yazması düzenleme için teşekkür ederiz.
Bu çalışmada kısmen Bilim Bakanlığı ve Tayvan teknoloji (en 105-2628-B-006-017-MY3) ve Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi (NCKUH-10705001) dan gelen hibe için P.L. Chen tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | Bacteria incubation |
| K2HPO4 | J.T.Baker | MP021519455 | Culture medium preparation |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-05 | Culture medium preparation |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | MP021914405 | Culture medium preparation |
| NaCl | SIGMA | 31434 | Culture medium preparation |
| MgSO4 | SIGMA | M7506 | Culture medium preparation |
| agar | Difco | 214530 | Culture medium preparation |
| CaCl2 | SIGMA | C1016 | Culture medium preparation |
| cholesterol | SIGMA | C8503 | Culture medium preparation |
| ethanol | SIGMA | 32205 | Culture medium preparation |
| KOH | SIGMA | P5958 | Culture medium preparation |
| 6 cm Petri plate | ALPHA PLUS | 46 | agar plate preparation |
| 96-well plate | FALCON | 353072 | liquid assay |
| bacterial peptone | Affymetrix/USB | AAJ20048P2 | Culture medium preparation |
| yeast extract | SIGMA | 92144 | Culture medium preparation |
| citric acid•H2O | SIGMA | C1909 | Culture medium preparation |
| tri-potassium citrate•H2O | SIGMA | 104956 | Culture medium preparation |
| FudR | SIGMA | 1271008 | Culture medium preparation |
| disodium EDTA | SIGMA | E1644 | Culture medium preparation |
| FeSO4•7 H2O | SIGMA | 215422 | Culture medium preparation |
| MnCl2•4 H2O | SIGMA | 221279 | Culture medium preparation |
| ZnSO4•7 H2O | SIGMA | 204986 | Culture medium preparation |
| CuSO4•5 H2O | SIGMA | C8027 | Culture medium preparation |
| tryptone | SIGMA | 16922 | Culture medium preparation |
| Microscope system | Nikon | Eclipase Ti inverted | microscope imaging |
| Scientific CCD Camera | QImaging | Retiga-2000R Fast 1394 | microscope imaging |
References
- Parker, J. L., Shaw, J. G. Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Biliary tract infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).
- Chuang, H. C., et al. Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia. Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).
- Chen, P. L., et al. A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 7, 2058 (2016).
- Chen, P. L., et al. Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences. PLoS One. 9 (11), 111213 (2014).
- Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila. Frontiers in Microbiology. 7, 1219 (2016).
- Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Immunology. 9, 774 (2018).
- Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens. Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Engelmann, I., Pujol, N. Innate immunity in C. elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).
- Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813 (2012).
